Directives de soumission d'échantillons
Modifications des histones et cartographie des enhancers : Les interrupteurs d'activation et de répression
QuestionVos gènes cibles sont-ils activement transcrits, ou sont-ils définitivement enfermés dans l'hétérochromatine répressive ?
Pour comprendre comment les facteurs de transcription maîtres et les protéines structurales (comme CTCF) régulent le développement des organoïdes, nous déployons Clivage sous cibles et tagmentation (CUT&Tag). Cela in situ la méthodologie remplace les protocoles ChIP-seq obsolètes et peu efficaces.
Exigence d'entrée ultra-basse
- CUT&Tag contourne le besoin de réticulation au formaldéhyde agressive et de sonication mécanique, fonctionnant efficacement avec seulement 1 000 à 50 000 cellules. Cela réduit considérablement les besoins en biomasse par rapport au ChIP-seq.
- Le BénéficeVous pouvez profiler directement des micro-organoïdes primaires ou des PDO à croissance lente immédiatement, sans passer des semaines à les étendre en culture, ce qui évite la dérive épigénétique induite par le passage et permet d'économiser des coûts de réactifs significatifs.
Clivage In Situ pour un Rapport Signal sur Bruit Élevé
- Le mécanisme de liaison de la transposase pAG-Tn5 clive et marque précisément l'ADN exclusivement aux sites cibles liés aux anticorps, éliminant ainsi le bruit de fond massif généré par la fragmentation génomique aléatoire.
- Le BénéficeVous recevez des données remarquablement propres (scores FRiP de 15 % à 40 %+) à une fraction de la profondeur de séquençage, permettant une identification fiable des super-enhancers et des nœuds régulateurs critiques même dans des modèles 3D hautement hétérogènes.
Nous cartographions régulièrement les promoteurs actifs (H3K4me3), les enhancers actifs (H3K27ac), l'élongation transcriptionnelle (H3K36me3) et les domaines répressifs (H3K27me3, H3K9me3) à travers divers types d'organoïdes.
Paysages de méthylation de l'ADN : Le code d'imprégnation et de silençage héréditaire
QuestionLa silenciation critique des gènes est-elle induite par une hyperméthylation stable des promoteurs ou par un marquage développemental dynamique ?
La méthylation de l'ADN (5mC) est la marque épigénétique la plus fondamentale définissant l'origine tissulaire et l'identité cellulaire stable. Confirmer que votre organoïde reflète avec précision le paysage de méthylation de son tissu parental est une étape cruciale de contrôle qualité. Nous proposons trois voies distinctes, priorisées en fonction de vos contraintes d'entrée et de vos besoins en résolution génomique :
1. Methyl-seq enzymatique (EM-seq)
Conversion non destructiveEM-seq utilise une réaction enzymatique en deux étapes (oxydation TET2 suivie de désamination APOBEC3A) plutôt qu'un traitement chimique agressif au bisulfite de sodium. Le traitement au bisulfite détruit plus de 90 % de l'ADN, tandis que l'EM-seq préserve l'intégrité de l'ADN de haut poids moléculaire et fournit une couverture très uniforme dans les régions riches en GC.
Le BénéficeVous pouvez obtenir des cartes de méthylation du génome entier à partir de seulement 100 pg à 10 ng d'ADNg extrait. C'est le choix optimal pour les échantillons d'organoïdes précieux où le rendement en ADN est sévèrement limité.
2. Séquençage bisulfite de tout le génome (WGBS)
Lorsque suffisamment d'ADN (50 à 200 ng) est disponible, le séquençage du génome entier par bisulfite (WGBS) reste la norme historique.
Le bénéficeIl fournit une carte de résolution unique et impartiale à travers environ 28 millions de sites CpG dans le génome humain, idéale pour la découverte complète du méthylome et la validation de modèles de référence par rapport aux ensembles de données historiques.
Séquençage bisulfite à représentation réduite (RRBS)
Enrichissement par enzymes de restrictionRRBS utilise la digestion par MspI pour enrichir spécifiquement les régions riches en CpG (promoteurs et îlots CpG) avant la conversion. Cela concentre la puissance de séquençage sur les ~1-10% les plus biologiquement actifs du génome.
Le BénéficeSi vous réalisez un criblage à haut débit à grande échelle sur des dizaines de lignées d'organoïdes et que vous n'avez besoin que de données de méthylation au niveau des promoteurs, le RRBS offre une alternative très rentable au WGBS.
Accessibilité de la chromatine à cellule unique : résolution de l'hétérogénéité sous-clonale
QuestionQuels sous-clones distincts ou types cellulaires différenciés possèdent la chromatine ouverte nécessaire pour répondre à un stimulus ?
Le profilage épigénétique en vrac moyenne le signal à travers l'ensemble de l'organoïde. Cependant, les organoïdes possèdent des niches de cellules souches actives, des couches épithéliales entièrement différenciées et des cœurs nécrotiques. Pour analyser cela, nous déployons ATAC-seq à cellule unique (scATAC-seq) et le 10x Genomics Chromium Multiome à cellule unique (ATAC + Expression génique) plateforme.
- Transposition à noyau uniqueNous isolons des noyaux intacts et effectuons une tagmentation Tn5 en vrac avant de les partitionner en des dizaines de milliers de gouttelettes individuelles à l'aide de codes-barres spécifiques aux transcrits. Cela permet de cartographier les régions exactes de la chromatine ouverte et accessible indépendamment pour chaque cellule individuelle.
- Le BénéficeVous pouvez établir un lien définitif entre un amplificateur ouvert spécifique et un sous-clone cancéreux rare et résistant aux médicaments ou un progéniteur développemental transitoire, garantissant que les éléments régulateurs critiques conduisant à la lignée ne soient pas perdus dans le bruit de fond des types cellulaires dominants.
Intégration des réseaux régulatoires multi-omiques
QuestionComment les changements d'état de la chromatine se traduisent-ils directement en expression génique en aval ?
Les données épigénétiques sont les plus puissantes lorsqu'elles sont directement liées à la sortie transcriptomique. CD Genomics propose des pipelines d'intégration multi-omiques avancés. Nous fusionnons de manière computationnelle vos données CUT&Tag ou scATAC-seq avec des données parallèles. séquençage d'ARN en vrac ou scARN-seq données.
En utilisant des cadres de modélisation avancés (par exemple, Pando ou SCENIC+), nous construisons des modèles complets. Réseaux de Régulation Génétique (RRG)Cela vous permet de tracer un circuit biologique complet : de la liaison d'un facteur de transcription maître, à l'ouverture d'un amplificateur spécifique, jusqu'à la régulation à la hausse de l'ARNm cible—fournissant des preuves mécanistes irréfutables pour votre cible médicamenteuse ou votre voie de développement.
Préparation d'échantillons spécifiques aux organoïdes et passerelles de contrôle qualité rigoureuses
Le profilage épigénétique échoue si la préparation de l'échantillon est défectueuse. Les organoïdes encapsulés dans Matrigel présentent de graves obstacles biochimiques : la matrice résiduelle séquestre les anticorps primaires, bloque la transposition enzymatique et ruine la liaison cellule-bille.
Protocoles d'extraction propriétaires
- Élimination de Matrigel par dépolymérisation à froidAu lieu d'un cisaillement enzymatique agressif qui détruit les protéines de surface cellulaire et rupture les noyaux fragiles, nous utilisons des solutions de récupération à froid spécialisées (4°C) pour liquéfier les matrices extracellulaires.
- Dissociation DouceNous utilisons des réactifs enzymatiques non cisaillants associés à une perméabilisation optimisée par digitonine pour garantir des noyaux intacts, viables à plus de 95 % et sans débris.
Le système de contrôle qualité en 4 niveaux
Votre projet est soumis à des contrôles qualité stricts à chaque phase critique :
- Contrôle qualité à l'entréeValidation de l'intégrité de la membrane nucléaire par coloration AO/PI et fluorométrie Qubit.
- Réaction QCLes contrôles de spike-in (par exemple, des nucléosomes de conception recombinants) dans CUT&Tag surveillent la récupération quantitative.
- Contrôle qualité de la bibliothèqueLe profilage TapeStation confirme une fragmentation mononucléosomale (~300 pb).
- Contrôle de qualité en bioinformatiqueÉvaluation des taux d'alignement, des ratios de duplication et du FRiP.
Sélection de méthode et limites "Meilleur pour / Pas pour"
Pour garantir que votre budget et vos échantillons sont alloués correctement, notre équipe scientifique applique strictement les limites d'application suivantes lors de l'acheminement de votre projet à travers notre services de séquençage et d'analyse d'organoïdes:
| Technologie | Meilleur pour | Non recommandé pour |
|---|---|---|
| CUT&Tag | Profilage des marques d'histones et des facteurs de transcription à partir d'organoïdes rares ou primaires non passés (1 000 à 50 000 cellules) où la conservation des échantillons est primordiale. | Profilage direct de protéines structurales cytoplasmiques hautement insolubles, ou cibles manquant d'anticorps hautement spécifiques validés par ChIP. |
| EM-seq | Extraction de cartes de méthylation du génome entier uniformes à partir de pellets de micro-organoïdes extrêmement précieux (<10 ng d'ADN) sans risquer de dégradation par le bisulfite. | Projets avec un ADN ample et très robuste où des workflows WGBS hérités ont déjà établi d'importantes bases de cohortes historiques. |
| RRBS | Dépistage rentable et à haut débit des changements de méthylation au niveau des promoteurs à travers des dizaines de lignées de réponse médicamenteuse d'organoïdes distincts. | Des études de phase de découverte visant à identifier de nouveaux changements de méthylation dans des régions intergéniques profondes ou des super-enhancers distaux. |
| scATAC-seq | Résoudre les éléments réglementaires exacts qui pilotent des populations sub-clonales rares (par exemple, les niches de cellules souches) au sein d'une structure organoïde hautement hétérogène. | Des monocultures 2D homogènes et entièrement différenciées où l'ATAC-seq en vrac offre un aperçu plus rapide et plus économique de l'accessibilité globale. |
Références :
- Zenk F, Fleck JS, et al. Reconstruction épigénomique à cellule unique des trajectoires de développement à partir de la pluripotence dans des systèmes d'organoïdes neuronaux humains. Nature Neuroscience2024;27:1437–1448.
- Wang R, Mao YN, et al. Évaluation systématique du système d'organoïdes du cancer colorectal par analyse de l'ARN-Seq à cellule unique. Biologie des génomes. 2022;23(1):106.
- Kraiczy J, Nayak KM, et al. La méthylation de l'ADN définit l'identité régionale des organoïdes épithéliaux intestinaux humains et subit des changements dynamiques au cours du développement.. Biologie du génome. 2019;20(1):19.
- Zhang Y, Wang L, et al. Super-enhancer active l'expression du facteur de transcription maître NR3C1 et favorise la résistance au 5-FU dans le cancer gastrique.. Science avancée2024 ; 12(7) : 2409050.
- Kaya-Okur HS, Wu SJ, et al. Profilage génomique in situ ciblé avec une haute efficacité pour un faible nombre de cellules. Communications Nature2019 ; 10 : 1930.
À utiliser uniquement à des fins de recherche. Ne pas utiliser dans les procédures de diagnostic, la prise de décisions cliniques, la stratification des patients, la sélection thérapeutique ou les essais cliniques.
Démos de profilage épigénétique
Figure 1. Analyse CUT&Tag cartographiant les modifications dynamiques H3K27ac et H3K4me3 pour identifier les super-enhancers guidant l'engagement des lignées d'organoïdes. Le flux de travail à ultra-faible entrée préserve les signatures épigénétiques qui seraient perdues lors de l'adaptation en culture dans le ChIP-seq traditionnel.
Figure 2. Cartographie de la méthylation de l'ADN via EM-seq. En évitant la dégradation de l'ADN induite par le bisulfite, l'EM-seq maintient l'intégrité de l'ADN de haut poids moléculaire et offre une couverture robuste des CpG même à partir de pellets de micro-organoïdes contenant moins de 10 ng de gDNA.
Figure 3. Résolution de l'hétérogénéité sub-clonale avec scATAC-seq. Le mapping à cellule unique des régions de chromatine ouverte permet aux chercheurs de suivre distinctement les trajectoires de développement et d'isoler des niches résistantes aux médicaments au sein de la population organoïde plus large.
Étude de cas : Profilage des dynamiques des super-enhancers dans les organoïdes de cancer gastrique
SourceZhang et al. Science avancée, 2024. (CC BY 4.0) [4]
ContexteDes chercheurs étudiant le cancer gastrique ont besoin d'un modèle avancé pour étudier la résistance au médicament de chimiothérapie 5-fluorouracile (5-FU). Ils ont généré des organoïdes dérivés de patients (PDO) mais devaient comprendre les mécanismes épigénétiques à l'origine du phénotype résistant, qui ne présentait pas de mutations génétiques évidentes.
MéthodesL'équipe a appliqué CUT&Tag directement aux PDOs de cancer gastrique, ciblant la marque d'histone active H3K27ac et des facteurs de transcription spécifiques. La capacité à faible entrée de CUT&Tag était essentielle en raison de la biomasse limitée des modèles d'organoïdes de passage précoce.
Figure 4. Identification des moteurs épigénétiques de la résistance aux médicaments. CUT&Tag a révélé des pics robustes de H3K27ac marquant des super-enhancers uniques aux sous-clones d'organoïdes résistants à la 5-FU.
RésultatsLe profilage H3K27ac a cartographié un remodelage massif de la chromatine et identifié l'activation d'un super-enhancer (SE) critique. Ce SE a directement régulé à la hausse le facteur de transcription maître NR3C1. Les données CUT&Tag ont définitivement prouvé que le phénotype résistant était entraîné par ce commutateur épigénétique, et non par une altération génomique.
ConclusionEn utilisant CUT&Tag sur des organoïdes 3D, les chercheurs ont établi un lien mécanistique direct avec la chimiorésistance et ont réussi à démontrer que la disruption pharmacologique de ce super-enhancer (en utilisant un inhibiteur de bromodomaine BET) a re-sensibilisé les organoïdes au 5-FU.
FAQs sur les épigénétiques des organoïdes
Puis-je soumettre des pellets d'organoïdes congelés à la volée pour CUT&Tag ?
La congélation instantanée des pellets cellulaires standards sans cryoprotecteurs entraîne souvent la rupture des membranes nucléaires lors du processus de décongélation, ce qui augmente considérablement le bruit de fond non spécifique dans CUT&Tag. Nous recommandons vivement de congeler lentement des cellules viables dans des milieux de cryoconservation spécialisés ou d'utiliser nos tampons d'extraction nucléaire à faible toxicité avant la congélation.
2. Comment distinguez-vous l'ADN des organoïdes de l'ADN contaminant de Matrigel ou de souris ?
Le Matrigel contient des traces d'ADN de souris. Lors du traitement bioinformatique, toutes les lectures sont strictement alignées contre un génome de référence humain/souris dual (par exemple, hg38/mm10). Les lectures se mappant sans ambiguïté au génome de souris sont écartées par calcul avant l'appel de pics ou l'extraction de méthylation pour éviter les annotations faussement positives.
3. Si mon nombre de cellules organoïdes est inférieur à 1 000 cellules, puis-je quand même effectuer un profilage épigénétique ?
Bien que le CUT&Tag en vrac fonctionne de manière optimale au-dessus de 1 000 cellules, nous proposons des workflows spécialisés de CUT&Tag à cellule unique (scCUT&Tag) et de scATAC-seq qui utilisent des microfluidiques à goutte ou un indexage combinatoire pour générer des profils à partir de populations ultra-rares. Veuillez consulter notre équipe technique pour une étude de faisabilité pilote.
4. Pourquoi avez-vous besoin d'un anticorps validé par ChIP pour CUT&Tag ?
CUT&Tag s'appuie sur l'anticorps primaire pour lier précisément l'enzyme pAG-Tn5 à la chromatine cible. Si l'anticorps a une forte affinité hors cible (réactivité croisée) ou ne parvient pas à se lier à la structure de chromatine native, la transposase clivera de l'ADN aléatoire, détruisant le rapport signal sur bruit. Seuls des anticorps hautement spécifiques, validés par ChIP, garantissent une tagmentation fiable.
5. Combien de temps dure le processus de profilage épigénétique des organoïdes ?
Les délais de traitement varient en fonction de la modalité choisie et de la profondeur d'intégration bioinformatique. Les projets EM-seq ou CUT&Tag standard nécessitent généralement de 3 à 5 semaines, de la réception des échantillons à la livraison des données. Les projets multi-omiques hautement intégrés (par exemple, scATAC-seq + scRNA-seq) peuvent nécessiter de 6 à 8 semaines.