Directives de Soumission d'Échantillons
Pourquoi la poly(A) et le séquençage Iso-seq de TAIL sont importants
Les queues Poly(A) sont plus que de simples extensions d'ARN. Elles agissent comme des régulateurs clés de la durée de vie, de la stabilité et de la traduction de l'ARNm. Les méthodes standard de séquençage d'ARN écartent souvent ou négligent cette information, manquant ainsi des signaux régulateurs précieux.
TAIL Iso-seq comble cette lacune. Il capture des cDNA de longueur complète, y compris des queues poly(A) intactes, et fournit une vue directe de la longueur des poly(A), de leur hétérogénéité et des événements APA associés. Les chercheurs peuvent lier les changements du 3'UTR à liaison des miARNidentifier utilisation d'APA spécifique aux isoformeset explorer comment la longueur de la queue affecte l'expression génique.
Cela fait de TAIL Iso-seq un outil précieux pour :
- Investigation de la régulation de l'ARN au cours du développement
- Étudier les réponses au stress chez les plantes
- Exploration de la stabilité de l'ARN dans des modèles de cancer
- Soutenir le développement de thérapies et de vaccins à base d'ARN
Avantages de TAIL Iso-seq avec CD Genomics
Précision de longueur complète
TAIL Iso-seq capture le transcrit complet, y compris l'UTR 5', la région codante, l'UTR 3' et la queue poly(A). Cela élimine les erreurs d'assemblage courantes dans le RNA-seq à lectures courtes et fournit une résolution au niveau des isoformes.
Profilage poly(A) complet
Notre service quantifie les distributions de longueur de la queue poly(A) à travers le transcriptome et détecte les résidus non-A (U, G, C) qui affectent la stabilité de l'ARN et l'efficacité de la traduction. Cela permet aux chercheurs d'étudier la dynamique de l'ARN avec un détail inégalé.
Analyse de l'APA et du 3'UTR
TAIL Iso-seq identifie des sites de polyadénylation alternatifs (APA) et caractérise les changements de longueur des 3'UTR. Cela aide à relier l'APA aux changements dans la liaison des miARN, la localisation de l'ARN et la régulation post-transcriptionnelle.
Soutien bioinformatique riche
Nous livrons des rapports prêts à être publiés avec des distributions de longueur de queue, des cartes APA, des catalogues d'isoformes et des analyses d'enrichissement de voies. Les résultats visuels simplifient l'interprétation et peuvent être intégrés dans des projets multi-omiques.
Flux de travail technologique
CD Genomics propose un flux de travail TAIL Iso-seq complet, de l'extraction d'ARN à la production de rapports bioinformatiques. Chaque étape est optimisée pour la précision et la reproductibilité, garantissant des informations fiables sur la régulation poly(A) et la diversité des isoformes.
QC de l'ARNL'ARN d'entrée est évalué pour son intégrité (RIN ≥7) et sa pureté.
Capture de cDNA completLes protocoles préservent des queues poly(A) intactes et des codes-barres peuvent être ajoutés pour des projets multiplexés.
Séquençage à long lecteur par nanopore: Lit les transcriptions complètes, y compris l'UTR 5', le CDS, l'UTR 3' et les queues poly(A).
Flux de travail TAIL Iso-seq : de l'évaluation de la qualité de l'ARN, la préparation de la bibliothèque, et le séquençage long-read Nanopore à l'analyse bioinformatique complète et aux rapports prêts pour publication.
Méthodes de séquençage de la queue Poly(A) — Quand utiliser lesquelles
| Méthode | Plateforme | Ce que cela mesure | Résidus non-A | Débit / Coût (relatif) | Forces typiques | Limitations typiques | Bon pour |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| TAIL-seq | Illumina (séquençage de l'extrémité 3') | Longueur de la queue à l'échelle du génome aux extrémités 3'; terminome 3' | Détecte les ajouts de terminal U/G | Élevé / $$ | Cartographie sensible des extrémités 3' ; relie la longueur de la queue à la dégradation. | Traitement de signal brut et analyse personnalisée requises ; pas d'isoformes de pleine longueur. | Études de déadenylation/uridylation ; essais de stabilité |
| PAL-seq | Illumina + normes de fluorescence | Longueur de la queue utilisant la fluorescence calibrée ; caractéristiques de l'extrémité 3' | Indirecte | Élevé / $$ | Normes internes pour la longueur de queue calibrée ; profilage en vrac robuste | Biochemie ajoutée ; configuration spécialisée ; pas en pleine longueur. | Distributions de longueur de queue en vrac calibrées ; étalonnage des méthodes |
| Poly(A)-seq | Illumina (lecture directe de poly(A) dans l'ADNc) | Profilage global des queues poly(A) ; queue médiane par gène | Pas l'objectif principal | Élevé / $ | Bibliothèque simplifiée vs TAIL-seq ; cohortes évolutives | Isoformes non résolues ; défis des homopolymères | Dépistage à grande échelle des variations de longueur de queue |
| FLAM-seq | PacBio (cDNA à longue lecture) | ARNm complet y compris la queue poly(A) | Rapports sur les résidus non-A | Modéré / $$–$$$ | Liens structure d'isoforme + longueur de la queue par molécule | Accès PacBio ; temps de course plus longs | Biologie des queues résolues par isoforme ; composition de la queue par isoforme. |
| PAIso-seq / PAIso-seq2 | PacBio HiFi | Longueur de la queue à l'échelle du transcriptome de faible entrée; longueur complète | Peut capturer la composition de la queue. | Modéré / $$–$$$ | Lectures HiFi à haute précision ; faible entrée (par exemple, ovocytes) | Spécifique à la plateforme ; complexité de la méthode | Échantillons précieux à faible input ; estimations de queue précises |
| FLEP-seq2 | Nanopore (cDNA à longue lecture) | ARN plein longueur avec une longueur de queue à travers les tissus/espèces | Détecte les motifs de queue | Modéré / $$ | Atlas compatibles avec la profondeur ; atlas inter-tissulaires ; comparaisons nucléaires vs cytoplasmiques | Compromis sur la précision au niveau de la base des nanopores | Atlas de tissus ; plantes et organismes non modèles |
| Nano3P-seq | Nanopore (cDNA de capture à l'extrémité 3') | Abondance d'ARN + dynamique de la queue (poly(A) et non-poly(A)) | Détecte les résidus non-A | Modéré / $$ | Capture des ARN polyadénylés et non polyadénylés ; queues par molécule | Biais de capture à l'extrémité 3'; nécessite une chaîne d'outils. | Chronologie du développement ; dynamique des queues à l'échelle du transcriptome |
Analyse bioinformatique
Notre pipeline interne intègre plusieurs couches d'informations :
- Identification des isoformes : Découverte d'isoformes de pleine longueur sans biais d'assemblage.
- Analyse de la queue Poly(A) : distribution, longueur médiane et détection des résidus non-A (U, G, C).
- Cartographie APA : Identification des sites de polyadénylation (PACs), des variantes de longueur de 3'UTR et des événements de commutation APA.
- Analyse de corrélation : Lien entre la longueur des poly(A), l'abondance des transcrits, la stabilité et l'efficacité de la traduction.
- Interprétation fonctionnelle : enrichissement GO et KEGG pour les gènes impactés par l'APA, prédictions de gain/perte de sites de liaison miARN.
Applications de TAIL Iso-seq
- Déchiffrer la réponse au stress et la biologie du développement chez les plantes – profiler comment la longueur de la queue poly(A) et l'APA changent sous l'effet de la chaleur, de la sécheresse ou lors de transitions développementales (par exemple, le travail PAL-seq sur le choc thermique de l'Arabidopsis).
- Comprendre les mécanismes de la maladie et découvrir des biomarqueurs dans le cancer – identifier de nouveaux isoformes, des dynamiques de queue poly(A) altérées ou des transcrits de fusion qui peuvent entraîner une pathologie ou servir de cibles diagnostiques/thérapeutiques (par exemple, "Iso-Seq en pleine longueur et à cellule unique pour la recherche sur le cancer")
- Optimiser les thérapies et les constructions de vaccins basés sur l'ARNm – garantir l'intégrité des transcrits, l'uniformité de la longueur des queues et la composition des queues (y compris les résidus non-A) pour améliorer la traduction et la stabilité.
- Découverte de traits de culture et amélioration de la sélection – utiliser les signatures de longueur de queue et les motifs APA pour les relier au rendement, à l'hybridation vigoureuse, à la tolérance au stress ou à l'expression spécifique des tissus dans des cultures comme le riz, le maïs et le soja.
Exigences d'échantillon pour le service TAIL Iso-seq
| Type d'échantillon | Quantité recommandée | Quantité minimale | Concentration / Qualité | Notes |
|---|---|---|---|---|
| ARN total | ≥ 2 µg | 600 ng | ≥ 30 ng/µL | RIN ≥ 8, OD260/280 ≥ 1,8, sans ADN |
| Cellules | ≥ 1 × 10⁶ | ≥ 5 × 10⁵ | Haute viabilité (>80%) | Pélets congelés instantanément dans de l'azote liquide |
| Tissu (animal/plante) | ≥ 50 mg | ≥ 10 mg | Intégrité de l'ARN RIN ≥ 8 | Éliminez les contaminants, congelez immédiatement. |
| Tissu végétal (spécial) | 50 à 100 mg par aliquote | – | Intégrité de l'ARN RIN ≥ 8 | Lavez avec de l'eau DEPC, congelez dans de l'azote liquide. |
| Culture bactérienne | ≥ 1 × 10⁷ cellules | – | Intégrité de l'ARN RIN ≥ 8 | Pellet, laver avec du PBS, congeler dans de l'azote liquide. |
Directives Générales
- Soumettez des échantillons dans de l'eau sans RNase ou dans un tampon Tris à 10 mM (pH 8,0).
- Évitez les cycles de congélation-dégel répétés.
- Expédiez les échantillons sur de la glace carbonique pour maintenir la qualité de l'ARN.
- Étiquetez clairement les tubes avec des codes courts (≤4 caractères alphanumériques).
- Veuillez fournir les données de contrôle qualité (traces Bioanalyzer/Tapestation) ainsi que le formulaire de soumission.
Livrables
- Données de séquençage brutes et traitées (FASTQ, BAM).
- Catalogue de transcriptomes au niveau des isoformes.
- Distributions de longueur de queue Poly(A) et cartes des sites APA.
- Tableaux d'enrichissement des voies et visualisations intégratives.
- Figures prêtes à être publiées et un rapport technique détaillé.
Questions Fréquemment Posées (FAQ)
Qu'est-ce que le TAIL Iso-seq et en quoi diffère-t-il de l'Iso-seq classique ou de l'RNA-seq ?
TAIL Iso-seq est un service de séquençage à lecture longue (basé sur Nanopore) qui capture des transcrits de pleine longueur, y compris la queue poly(A) native, permettant la mesure directe de la longueur de la queue, des sites d'APA (polyadénylation alternative) et de la diversité des isoformes. Le séquençage RNA régulier perd souvent des informations sur la queue et nécessite un assemblage des lectures, tandis que l'Iso-seq standard peut capturer la structure des transcrits mais pas toujours la composition complète en poly(A) et les résidus non-A.
La méthode TAIL Iso-seq peut-elle détecter des nucléotides non-A à l'intérieur ou à l'extrémité des queues poly(A) ?
Oui. Le service inclut la détection de résidus non-adénosine (tels que U, G, C) à la fois à la position terminale et en interne dans la queue poly(A). Ces résidus non-A fournissent des informations sur la stabilité des transcrits, la dégradation ou la régulation de la déadénylation. Des outils comme tailfindr, nanopolish et d'autres soutiennent cette analyse.
Quelle est la précision de la mesure de la longueur de la queue poly(A) avec les lectures longues Nanopore ?
TAIL Iso-seq utilise des pipelines de basecalling et de traitement du signal à la pointe de la technologie pour estimer la longueur des queues par molécule avec une haute résolution, souvent avec une précision au niveau du nucléotide pour les queues plus courtes et une bonne précision relative pour les queues plus longues. La précision dépend également de la qualité de l'échantillon, de la sortie de séquençage (rétention .fast5) et du choix des outils (tailfindr, nanopolish, etc.).
Ai-je besoin d'un génome de référence pour utiliser TAIL Iso-seq ?
Non, mais avoir un génome de référence ou une annotation de transcript améliore le mapping, l'identification des sites APA et la résolution des isoformes. Dans les organismes non modèles, l'assemblage de novo à long-lecture combiné avec une annotation de transcript sans référence est possible, bien que certaines analyses (par exemple, la prédiction de liaison des miARN) puissent être plus difficiles sans une bonne annotation.
Quelles sont les exigences d'échantillonnage pour TAIL Iso-seq ?
Un ARN total de haute intégrité est requis (RIN recommandé ≥ 7), exempt de contaminants, avec une quantité suffisante selon l'organisme / le tissu ; une quantité d'entrée inférieure est possible avec des méthodes optimisées. L'ARN doit inclure des queues poly(A) intactes et une dégradation minimale pour de meilleurs résultats.
Comment gérez-vous le biais PCR ou la troncature des queues poly(A) dans le pipeline ?
Nous minimisons les biais en utilisant le séquençage à longues lectures (ce qui évite l'assemblage de fragments), en capturant des transcrits de pleine longueur, en conservant les données de signal brut (.fast5) pour l'estimation de la longueur de la queue, et en employant des étapes de contrôle de qualité pour filtrer les ARN tronqués ou dégradés. L'utilisation d'outils qui fonctionnent sur le signal brut aide à garantir une estimation précise de la queue.
Quelle est la différence entre l'analyse de la queue poly(A) et l'analyse de l'APA (polyadénylation alternative) ?
L'analyse de la queue Poly(A) se concentre sur la longueur, la composition et les modifications de la queue elle-même à l'extrémité du transcrit. L'analyse APA traite de l'endroit où se produit la polyadénylation, c'est-à-dire le cartographie des sites de clivage poly(A), les longueurs variables de la région non traduite 3' (3'UTR) parmi les isoformes, et comment cela affecte la régulation (par exemple, la liaison des miARN). Les deux sont complémentaires.
La méthode TAIL Iso-seq peut-elle être utilisée pour des études comparatives entre différentes conditions ou espèces ?
Oui. Parce qu'il fournit des distributions de longueur de queue par isoforme et l'utilisation de sites APA par échantillon, TAIL Iso-seq soutient les comparaisons entre tissus, traitements ou espèces. Des pipelines statistiques peuvent tester la longueur de queue différentielle ou l'utilisation d'APA entre les groupes.
Combien de temps vais-je obtenir les résultats (bioinformatique + livrables) ?
Les délais typiques dépendent du nombre d'échantillons, de la complexité et de la profondeur de séquençage. Les rapports incluent des données de séquençage brutes et traitées, des distributions de longueur de queue, le mapping APA, des catalogues d'isoformes et des visualisations. (Des délais spécifiques seront fournis en fonction de l'étendue dans le devis du projet.)
Comment le coût évolue-t-il en fonction du nombre d'échantillons, de la profondeur ou de la complexité des transcrits cibles ?
Les coûts augmentent généralement avec le nombre d'échantillons, la profondeur de lecture requise et la complexité (par exemple, organisme non modèle ou transcrits à faible expression). CD Genomics propose des tarifs évolutifs ; les clients peuvent choisir entre des niveaux d'analyse standard ou premium en fonction de la résolution (découverte d'isoformes, composition des queues, précision de l'APA) dont ils ont besoin.
Étude de cas : "Un atlas de l'ARN full-length des plantes révèle une régulation spécifique aux tissus et évolutivement conservée de la longueur de la queue poly(A) chez les plantes"
Citation : Jia J., Lu W., Liu B., et al. Un atlas de l'ARN plein longueur des plantes révèle une régulation spécifique aux tissus et conservée entre monocotylédones et dicotylédones de la longueur de la queue poly(A)., Plantes de la nature 2022.
1. Contexte
Les chercheurs manquaient d'une ressource transcriptomique complète et exhaustive chez les plantes qui inclut informations sur la longueur de la queue poly(A) à travers les tissus et les espèces. Les méthodes antérieures à lecture courte échouaient souvent à préserver les queues poly(A) ou ne reliaient pas les queues aux isoformes de transcrits complets. Cette lacune limitait les connaissances sur la façon dont la longueur des poly(A), l'APA (polyadénylation alternative) et la stabilité de l'ARNm varient entre les tissus ou entre les espèces végétales.
2. Méthodes
- Utilisé une méthode sans enrichissement en poly(A), basée sur Nanopore (FLEP-seq2), pour séquencer des ARN de pleine longueur conservant des queues poly(A).
- Sept tissus différents d'Arabidopsis thaliana ont été échantillonnés, ainsi que le tissu de la tige de maïs, de soja et de riz. Plus de 120 millions de molécules d'ARNm polyadénylés ont été séquencées.
- Comparé les distributions de longueur de queue poly(A) entre le noyau et le cytoplasme, différents tissus, et à travers des gènes orthologues dans différentes espèces. Évalué également la relation entre la demi-vie de l'ARNm et la longueur de la queue.
3. Résultats
- Dans la plupart des tissus, les longueurs des queues poly(A) atteignaient un maximum d'environ 20 nt et 45 nt ; dans le pollen, les pics étaient différents (environ 55 à 80 nt).
- Les ARN nucléaires avaient des queues presque deux fois plus longues que celles des ARN cytoplasmiques.
- Les gènes avec de courtes demi-vies d'ARNm avaient généralement des queues poly(A) plus longues, tandis que les transcrits stables avaient des queues atteignant un pic d'environ 45 nt.
- La comparaison inter-espèces a montré que les gènes orthologues ont tendance à maintenir une régulation similaire de la longueur de la queue malgré les différences entre les espèces.
Figure : Les queues poly(A) nucléaires sont plus longues que les queues cytoplasmiques.Cela montre la distribution des longueurs de queue poly(A) dans les fractions nucléaires par rapport aux fractions cytoplasmiques à travers les espèces/tissus végétaux.
4. Conclusions
- La régulation de la queue Poly(A) est spécifique aux gènes, spécifique aux tissus et montre une conservation évolutive parmi les plantes.
- Les différences de longueur de queue entre le noyau et le cytoplasme et parmi les tissus soulignent la régulation dynamique de la coupe de la queue (déadenylation) et de l'APA.
- L'ensemble de données fournit une ressource pour étudier la stabilité de l'ARNm, la traduction, l'APA et les caractéristiques régulatrices non codantes chez les plantes.
- Soutient la valeur du séquençage complet et à longues lectures pour lier la longueur de la queue à la fonction de l'ARN.
Références
- Jia J, et al. Un atlas de l'ARN plein longueur des plantes révèle une régulation spécifique aux tissus et conservée entre monocotylédones et dicotylédones de la longueur de la queue Poly(A).. Plantes de la nature. 2022
- Wen H, Chen W, Chen Y, Wei G, Ni T. Analyse intégrative de l'Iso-Seq et de l'ARN-seq révélant des changements dynamiques des promoteurs alternatifs, du splicing alternatif et de la polyadénylation alternative durant la sénescence induite par l'angiotensine II dans des cellules endothéliales aortiques primaires de rat.. Front Genet. 2023 Jan 19;14:1064624.
- Kuo RI, Cheng Y, Zhang R, Brown JWS, Smith J, Archibald AL, Burt DW. Illuminer le côté obscur du transcriptome humain grâce au séquençage des transcrits à longues lectures.. BMC Genomics. 30 oct. 2020;21(1):751. doi: 10.1186/s12864-020-07123-7. PMID: 33126848; PMCID: PMC7596999.
