Séquençage MeRIP (Analyse m6A)

CD Genomics propose une analyse à l'échelle du transcriptome de la localisation de la m6A dans les transcrits d'ARNm et d'autres ARN par séquençage d'immunoprécipitation d'ARN méthylé (MeRIP-seq). Le MeRIP-seq utilise un anticorps qui détecte et caractérise spécifiquement l'N6-méthyladénosine (m6A) dans l'ARN. Étant donné que l'UTR 3' de l'ARNm joue un rôle important dans la stabilité, la localisation et la traduction de l'ARNm, et peut affecter la liaison des protéines régulatrices de l'ARN à ces régions, l'enrichissement de la m6A dans cette région indique que la m6A peut influencer le métabolisme de l'ARN et l'expression des gènes. L'inhibition des enzymes impliquées dans la méthylation de l'ARN a également fourni des indices sur les rôles biologiques potentiels de cette modification. Ainsi, l'identification et la caractérisation des bases modifiées dans l'ARN peuvent conduire à une meilleure compréhension des voies biologiques.

Qu'est-ce que le séquençage MeRIP ?

N6-méthyladénosine (m6A), la forme de modification par méthylation la plus répandue au sein de la séquences d'ARNm des eucaryotes, a la capacité de réguler fonctionnellement le transcriptome eucaryote, influençant ainsi les processus d'épissage de l'ARNm, d'exportation nucléaire, de localisation, de traduction et de stabilité. La présence de l'ARN m6A dans divers processus vitaux de la vie cellulaire signifie que la méthylation de l'ARNm participe à de nombreux processus biologiques, tels que la différenciation des cellules souches et le rythme circadien, et est impliquée dans la pathogénie de diverses maladies, y compris, mais sans s'y limiter, la carcinogenèse, l'obésité et l'infertilité.

La technique principale pour la recherche sur le transcriptome concernant la N6-méthyladénosine (m6A) est le MeRIP-seq (séquençage par immunoprécipitation de l'ARN méthylé). Le principe sous-jacent à cette méthode repose sur l'utilisation d'anticorps spécifiques à la m6A pour immunoprécipiter des fragments d'ARN contenant des modifications m6A au sein de la cellule, suivie d'un séquençage à haut débit de ces fragments d'ARN enrichis. Associée à une analyse bioinformatique, une recherche systématique approfondie sur les modifications m6A peut être réalisée à l'échelle du transcriptome.

Avantages de notre service de séquençage MeRIP

• Haute flexibilité : Capable de séquencer directement des fragments hautement méthylés du transcriptome de n'importe quelle espèce sans avoir besoin d'informations sur la séquence du génome connue.
• Haute précision : Capable de localiser précisément dans une plage de 100 à 200 nucléotides autour du site de liaison réel.
• Signal numérique : Permet une analyse quantitative et de séquençage directement sur des fragments méthylés, éliminant les problèmes de réactivité croisée et de bruit de fond associés aux signaux fluorescents d'hybridation sur puce traditionnels.
• Plateforme complète : expérience MeRIP—Construction de bibliothèque, analyse de séquençage—Validation par qPCR MeRIP, offrant un service véritablement tout-en-un.
• Sélection flexible : Options pour les méthodes de construction de bibliothèques et les tailles de fragments.
• Bonne reproductibilité : Une expérience de projet abondante garantit la reproductibilité expérimentale, avec une analyse comparative réalisée entre plusieurs échantillons.

Application du séquençage MeRIP

• Distribution de la méthylation de l'ARN dans les organismes eucaryotes ;
• La méthylation de l'ARNm chez les animaux et les plantes et son mécanisme de réponse au stress environnemental ;
• Mécanismes de résistance à la dégradation de l'ARNm ;
• Mécanismes sous-jacents à l'initiation et à la prolifération tumorale ;
• Études des fonctions biologiques de différentes plantes ;
• Initiation et métastase du cancer ; Début et progression de la maladie ;
• Différenciation cellulaire, développement embryonnaire et réponse au stress.

Flux de travail de séquençage MeRIP

CD Genomics utilise l'approche de cartographie m6A en utilisant l'immunoprécipitation avec des anticorps spécifiques à m6A, suivie de séquençage de nouvelle génération (MeRIP-Seq). L'ARN sélectionné par poly(A) a été fragmenté en oligonucleotides de 100 nucléotides de long (entrée) et immunoprécipité à l'aide d'un anticorps purifié par affinité anti-m6A, puis soumis au séquençage de nouvelle génération Illumina. Étant donné que les fragments d'ARN immunoprécipités peuvent contenir m6A à n'importe quel endroit le long de leur longueur, plusieurs fragments différents contenant m6A génèrent des lectures qui se chevauchent. Les sites m6A ont été prédits bioinformatiquement en utilisant un algorithme de détection de pics et en recherchant la présence d'un sous-ensemble de motifs DRACH près du point de couverture de lecture le plus élevé.

Fig. 1 Protocole de séquençage MeRIP

Spécifications du service

	Exigences d'échantillon ARN total ≥ 10 μg, Concentration ≥ 1 ng/µL Valeur RIN ≥ 7,0 Cellule ≥ 1×107 Tissu ≥ 500 mg
	Séquençage Les options de service flexibles incluent HiSeq X et NextSeq 500.
	Analyse bioinformatique Identification des résidus m6A dans l'ARN La distribution des pics m6A le long des transcrits Analyse des pics différentiels

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails dans le séquençage MeRIP pour votre rédaction (personnalisation)

La conférence sur le séquençage MeRIP de CD Genomics se concentre sur les liens entre la variation cellulaire dans les tissus et la fonction des organes, et élucide davantage les origines des maladies. Si vous avez des exigences supplémentaires ou des questions, n'hésitez pas à nous contacter.

Références:

1. Dominissini D, et al. Topologie des méthylomes d'ARN m6A humains et murins révélée par m6A-seq. Nature, 29 avril 2012 ; 485(7397) : 201-6.
2. Jesus D F D, et al. La méthylation de l'ARNm m6A régule la biologie des cellules β humaines dans des états physiologiques et dans le diabète de type 2. Nature Métabolisme2019,1, 765–774.

La méthylation de l'ARNm m6A régule la biologie des cellules β humaines dans des états physiologiques et dans le diabète de type 2. (Jesus et al., 2019)

1. Le MeRIP-seq pourrait-il être soumis à des restrictions liées aux espèces ?

Pour les espèces disposant de génomes de référence, ceux assemblés au niveau chromosomique, et ceux avec des fichiers d'annotation gtf complets, cette méthodologie est applicable. Il existe des méthodes et des paramètres distincts impliqués dans les logiciels de détection de pics pour les eucaryotes, les procaryotes ou les virus. Par conséquent, il est conseillé aux projets axés sur les procaryotes ou les virus de réaliser des évaluations préliminaires.

2. Pourquoi est-il nécessaire de mesurer simultanément les échantillons d'Input et d'IP dans les expériences MeRIP ?

Le projet MeRIP se caractérise par deux composants : l'Input et l'IP. Dans la procédure expérimentale, l'échantillon IP utilise un anticorps m6A pour enrichir spécifiquement les fragments d'ARN méthylés. En revanche, l'Input, qui se compose uniquement d'ARN fragmentés, sert de contrôle pour atténuer le bruit de fond. Les composants IP et Input sont traités en parallèle pour la construction de la bibliothèque et le séquençage. Pour l'analyse de détection des pics, les données des deux échantillons doivent être intégrées, en utilisant les données de l'Input pour exclure les pics correspondant à des niveaux d'expression basale élevés ou à des événements de liaison non spécifiques, maximisant ainsi la précision de l'appel des pics.

3. Quelles sont les forces et les limites du séquençage MeRIP ?

La technique de séquençage MeRIP offre plusieurs avantages :
Haute capacité de traitement : Elle facilite l'analyse simultanée d'un nombre substantiel d'échantillons d'ARN. Haute sensibilité : Elle est capable de détecter des modifications m6A à faible abondance. Résolution spatiale : Cette technique peut déterminer avec précision l'emplacement des modifications m6A.

Cependant, la technique de séquençage MeRIP présente également des limitations :
Dépendant des anticorps : La sélection et la qualité des anticorps peuvent potentiellement affecter les résultats expérimentaux.
Précision : Bien que les données de séquençage puissent fournir une localisation générale des modifications m6A, elles ne sont pas capables de déterminer la base précise.
Analyse de données complexes : Un haut degré de compétences spécialisées en analyse de données est nécessaire pour interpréter les données de séquençage et identifier les sites de modification m6A.

4. Quel est le principe du séquençage MeRIP ?

Le principe du séquençage Merip est basé sur la technologie MeRIP et le séquençage RNA à haut débit. Initialement, les échantillons d'ARN subissent des expériences MeRIP, dans lesquelles des anticorps spécifiques sont utilisés pour lier les molécules d'ARN modifiées par m6A. Par la suite, les molécules d'ARN modifiées par m6A sont enrichies à partir de l'ARN total par immunoprécipitation. Après l'enrichissement, l'ARN est soumis à une transcription inverse et à une préparation de bibliothèque pour le séquençage ADN en utilisant la technologie de séquençage à haut débit. En fin de compte, une analyse des données de séquençage est effectuée pour déterminer les positions et les abondances relatives des modifications m6A.

Les méthylomes d'ARN révèlent la régulation médiée par l'm6A du gène de la déméthylase de l'ADN SlDML2 lors de la maturation des fruits de tomate.

Journal : Biologie du Génome
Facteur d'impact : 14,028
Publié : 06 août 2019

Arrière-plans

Il est bien établi que les modifications de l'ADN 5mC et de l'ARNm m6A jouent des rôles critiques dans la régulation de l'expression génique. La conservation de la modification de l'ADN 5mC souligne son rôle fondamental dans la modulation de plusieurs processus biologiques. Cette étude met en lumière son lien avec la maturation des fruits. Des recherches antérieures ont montré que la mutagenèse du gène de la déméthylase de l'ADN SlDML2 chez les tomates déclenche une hyperméthylation à travers le génome et inhibe de manière significative la maturation des fruits. Cependant, le rôle que joue le m6A dans ce processus, ainsi que les interactions potentielles entre 5mC et m6A, restent non catégorisées. Il est déjà connu chez Arabidopsis que la modification m6A, médiée par la déméthylase de l'ARN SlALKBH2, peut réguler le gène homologue de la déméthylase de l'ADN SlDML2.

Méthodes

Résultats

La modification m6A présente un décalage dynamique au cours du processus de maturation des fruits, avec un niveau global de m6A diminuant progressivement à mesure que le fruit mûrit, reflétant les motifs de méthylation de l'ADN. Dans les mutations de défaut de maturation telles que Cnr, en plus de l'hyperméthylation de l'ADN, le niveau global de m6A est également plus élevé.

Figure 1 Dynamiques de la méthylation de l'ADN (5mC) et de la méthylation m6A de l'ARNm lors de la maturation des fruits de tomate.

2. La modification de méthylation, m6A, est largement distribuée dans l'ARNm des fruits de tomate, montrant une relation inverse avec les niveaux de transcription des gènes.

Les niveaux globaux de m6A pendant la maturation des fruits et dans le mutant Cnr correspondent à l'expression du gène de la déméthylase m6A SlALKBH2, qui est soumis à une régulation par méthylation de l'ADN. SlALKBH2, une déméthylase m6A, a la capacité de se lier à l'ARNm du gène de la déméthylase de l'ADN, SlDML2, afin de réguler sa modification et sa stabilité en m'6A. Lors de la mutation du gène SlALKBH2, des niveaux accrus de m6A dans SlDML2 coïncident avec une réduction du contenu en ARNm, entravant ainsi la maturation normale des fruits.

Figure 2. SlALKBH2 est nécessaire pour la maturation normale des fruits de tomate.

Conclusion

Cette étude confirme de manière préliminaire le lien entre la méthylation de l'ADN et la méthylation de l'ARN, révélant un nouveau mécanisme de régulation de la maturation des fruits, offrant un nouvel aperçu pour élucider le réseau de contrôle de la maturité des fruits. Étant donné la multifonctionnalité de la méthylation de l'ADN et de la méthylation de l'ARN, le mécanisme de régulation par rétroaction démontré dans cette étude s'appliquera également à d'autres processus biologiques.

Référence:

1. Zhou L, Tian S, Qin G. Les méthylomes d'ARN révèlent la régulation médiée par l' m 6 A du gène de la déméthylase de l'ADN SlDML2 lors de la maturation des fruits de tomate. Biologie du génome, 2019, 20 : 1-23.