Directives de Soumission d'Échantillons
Pourquoi le séquençage d'amplicons par nanopore est important
Les méthodes de séquençage à lecture courte, telles que les panneaux Illumina ciblant les régions V3–V4, échouent souvent à distinguer les espèces étroitement liées. Cela peut limiter les recherches en aval dans l'analyse du microbiome, la détection de pathogènes et la validation clonale.
Le séquençage par nanopore comble ces lacunes en produisant longs lectures sur la longueur totale du gène, comme les V1–V9 de l'ARNr 16S ou l'intégralité de la région ITS. Ces lectures offrent une résolution taxonomique plus élevée, réduisent les erreurs dans l'analyse des communautés et permettent une identification fiable au niveau des espèces ou des souches.
Pour les chercheurs ayant besoin d'un contexte plus large, Séquençage ultra-long par nanopore soutient les assemblages de génomes de télomère à télomère, tandis que Séquençage d'ARN direct par nanopore structure des liens avec expression.
Flux de travail pour l'approche PCR en deux étapes dans la préparation de bibliothèques de séquençage d'amplicons Nanopore. (Cette figure a été adaptée de Yoshiyuki Matsuo (https://dx.doi.org/10.17504/protocols.io.8epv5zrodv1b/v4)
Spécifications techniques
CD Genomics fournit un flux de travail fiable de bout en bout pour Séquençage d'amplification par nanopore, optimisés à la fois pour les projets clonaux et communautaires. Nos protocoles de laboratoire, plateformes de séquençage et pipelines bioinformatiques sont conçus pour maximiser la précision des lectures et garantir une résolution au niveau des espèces ou des souches.
| Paramètre | Spécification |
|---|---|
| Plage de taille des amplicons | 0,5–25 Ko (support étendu disponible sur demande) |
| Plateformes | Oxford Nanopore PromethION / GridION |
| Chimie | Kit 14 avec des cellules d'écoulement R10.4.1 pour une précision améliorée |
| Profondeur de lecture | ≥50 000 lectures par échantillon recommandées pour le profilage communautaire |
| Délai de traitement | 1 à 3 jours ouvrables (projets clonaux) ; environ 14 jours (profilage communautaire) |
| Précision des données | Pipelines de polissage standard ; workflow de consensus basé sur des codes-barres en option pour une fidélité accrue. |
| Livrables | Fichiers FASTQ/FASTA, rapports de contrôle de qualité, tableaux de taxonomie/variantes, rapports interactifs en HTML et PDF |
Assurance qualitéTous les projets de séquençage subissent un contrôle qualité strict, y compris des vérifications de l'intégrité de l'ADN, des analyses de la distribution de la longueur des lectures et un suivi du taux d'erreur.
Applications
Le séquençage d'amplicons par nanopore est largement appliqué dans recherche microbiennevalidation des gènes et génomique comparativeEn fournissant des lectures longues qui couvrent des amplicons entiers, cela permet une interprétation fiable des ensembles de données complexes et réduit l'ambiguïté souvent rencontrée dans les méthodes de lectures courtes.
Profilage des communautés microbiennes
- Les régions complètes de l'ARNr 16S (V1–V9) et des ITS permettent une identification au niveau des espèces.
- Adapté aux échantillons environnementaux, aux microbiomes humains et aux projets de microbiologie industrielle.
- Soutient l'analyse de la diversité, l'évaluation de la structure de la population et les études comparatives.
Surveillance des agents pathogènes et évaluation des risques
- Détecter des agents pathogènes potentiels dans l'eau, le sol, les aliments et les environnements intérieurs.
- Permet de suivre les changements microbiens en réponse aux variations saisonnières ou environnementales.
- Améliore la surveillance de la biosécurité dans la recherche clinique et agricole.
Sécurité alimentaire et agriculture
- Identifier les organismes de détérioration et les souches bénéfiques dans les chaînes de production alimentaire.
- Soutenir les programmes de reproduction en profilant les communautés microbiennes liées à la résilience des cultures.
- Faciliter les études en biotechnologie agricole en résolvant la diversité au niveau des souches.
Vérification clonale et détection de variants
- Confirmez les amplicons à gène unique, les constructions modifiées ou les inserts de plasmides.
- Générer un consensus haute fidélité pour des échantillons clonaux en utilisant des stratégies basées sur des codes-barres.
- Un délai d'exécution rapide permet des cycles de conception et de test itératifs.
Génomique comparative et évolutive
- Résoudre les espèces étroitement liées et les variantes au niveau des souches.
- Soutenir les études de génétique des populations et d'évolution microbienne avec une couverture complète.
- Combiner avec Séquençage ciblé par nanopore pour une analyse ciblée de loci spécifiques.
Flux de travail : Service de bout en bout
Stratégie de primer: sélectionner les régions cibles (16S, ITS, gènes personnalisés)
PCR haute fidélité: avec étiquetage de code-barres optionnel pour la correction d'erreurs
Préparation de la bibliothèqueKit ONT 14, fragmentation minimale
SéquençagePromethION/GridION avec des cellules de flux R10.4.1
Traitement des données: appel de base, génération de consensus, filtrage des chimères
Bioinformatique: attribution taxonomique, analyse des variants, statistiques de diversité
LivraisonFichiers FASTQ/FASTA, rapports de contrôle de qualité, sorties HTML/PDF
Bioinformatique et Rapport
CD Genomics propose un pipeline bioinformatique complet pour Séquençage d'amplicons par nanopore, garantissant des résultats de haute confiance et des livrables prêts pour publication. Notre analyse couvre le contrôle de qualité, la classification taxonomique, la détection de variantes et des rapports personnalisés.
Analyse Standard
Basecalling et démultiplexageconversion des signaux bruts en FASTQ avec séparation des échantillons.
Contrôle de qualité: distribution de la longueur de lecture, profondeur de couverture et statistiques de précision.
Attribution taxonomiqueclassification au niveau des espèces pour les ensembles de données 16S et ITS en utilisant des bases de données de référence sélectionnées.
Analyse de la diversité: indices de diversité alpha et bêta avec des visualisations telles que des graphiques PCoA ou NMDS.
Analyse avancée (optionnelle)
Abondance différentielle: statistiques comparatives entre les groupes expérimentaux.
Détection de variantesidentifier des variantes de séquence au sein des amplicons clonaux.
Flux de travail de consensus des codes-barres: précision améliorée avec suppression des erreurs et filtrage des chimères.
Résolution au niveau de la souche: regroupement et appel de variantes à fine échelle.
Applications de cas prouvées
Notre Séquençage d'amplicons par nanopore Le service a été appliqué avec succès dans divers domaines de recherche. Voici quelques exemples sélectionnés qui démontrent des résultats pratiques.
| Projet | Objectif de recherche | Résultats clés |
|---|---|---|
| Microbiome des eaux urbaines | Évaluer les changements saisonniers et l'impact de la pollution sur les communautés riveraines. | Résolution au niveau des espèces d'Arcobacter et d'Aeromonas ; contributions spécifiques aux sources révélées dans les saisons humides et sèches. |
| Étude de l'environnement intérieur | Caractériser les populations microbiennes liées à l'occupation humaine. | Identifié 21 espèces clés, dont 11 agents pathogènes potentiels ; plus grande abondance de bactéries bénéfiques à l'intérieur. |
| Vérification génétique clonale | Confirmer les constructions génétiques et les séquences de plasmides. | Consensus de haute fidélité atteint ; réduction des faux positifs grâce à une stratégie basée sur les codes-barres. |
| Microbiome Agricole | Étudier la diversité microbienne associée aux cultures dans des échantillons de sol. | Profilage amélioré au niveau des souches ; analyse de résilience soutenue dans la recherche en élevage |
RemarqueCes applications sont pour usage uniquement à des fins de recherche et ne sont pas destinés à des procédures de diagnostic.
Livrables
- Données de séquençage brutes : fichiers FASTQ et fichiers FASTA optionnels.
- Rapports de CQ : rendement, distribution de la longueur de lecture et métriques de précision.
- Tables de taxonomie/variantes avec des profils d'abondance.
- Rapports interactifs HTML et PDF avec des figures prêtes pour publication (SVG/PNG).
- Méthodes de texte et paramètres de pipeline pour soutenir la reproductibilité.
Choisir la bonne plateforme de séquençage
CD Genomics prend en charge plusieurs technologies de lecture longue et courte, garantissant que chaque projet bénéficie de l'approche la plus adaptée. Que votre objectif soit la détection de variants avec une haute précision, l'analyse d'amplicons de pleine longueur ou des études à l'échelle de la population, nous pouvons recommander la bonne plateforme.
| Caractéristique | PacBio SMRT | Oxford Nanopore | Illumina |
|---|---|---|---|
| Longueur de lecture | Long (10–25 kb ; HiFi ~15–20 kb) | Ultra-long (plage de kb à Mb) | Court (100–500 pb) |
| Précision | Très élevé (HiFi >99,9%) | Élevé avec consensus/suppression d'erreurs | Très élevé (>99,9%) |
| Tournant | Modéré | Flexible, portable, en temps réel | Haute capacité, basée sur des lots |
| Forces | Faible erreur, idéal pour les régions répétées | Lectures les plus longues, amplicons au niveau des espèces, ARN/ADN direct | Rentable pour de grands cohorts |
| Limitations | Coût plus élevé, qualité de l'ADN critique | Le taux d'erreur brut est plus élevé sans correction. | Résolution limitée pour les longues répétitions |
| Le mieux adapté pour | Assemblages de novo, régions répétées | Amplicons, microbiomes, analyse rapide | Détection de SNP, études sur de grands échantillons |
Notre engagement:
Nous proposons des services de séquençage sur les trois plateformes—PacBio, Oxford Nanopore et Illumina—vous n'avez donc pas à vous soucier de choisir la mauvaise méthode. Nos experts évaluent vos échantillons et vos objectifs de recherche, puis recommandent la plateforme qui maximise la qualité des données, l'efficacité et le rapport coût-efficacité.
Exigences d'échantillon pour le séquençage d'amplicons Nanopore
| Type d'échantillon | Entrée recommandée | Pureté (OD260/280) | Exigences | Notes |
| Produits PCR purifiés | ≥1 μg (min. 500 ng) | 1,8–2,0 | ≥20 ng/μL ; haute qualité ; taille conforme aux spécifications de la plateforme | Groupe unique et spécifique ; pas de produits non spécifiques |
| Produits PCR non purifiés | Variable | — | Acceptable, mais une purification est fortement conseillée pour une qualité de séquençage optimale. | — |
| ADN fragmenté | Montant suffisant | — | Nécessite une taille uniforme et une compatibilité avec la région cible. | Pour des stratégies d'amplicons spécifiques |
| ADN génomique (ADNg) | ≥500 ng | 1,8–2,0 | Haute pureté ; ≥20 ng/μL ; pas de dégradation | Idéal pour l'amplification par PCR |
- Tous les échantillons d'ADN doivent subir des tests de pureté et de concentration pour garantir la qualité du séquençage.
- Si vous avez des questions concernant la préparation des échantillons ou si vous avez besoin d'un plan personnalisé, n'hésitez pas à nous contacter à tout moment pour obtenir une assistance experte.
Pourquoi choisir CD Genomics pour le séquençage d'amplicons Nanopore ?
Des plateformes de séquençage avancées à la livraison de données de haute qualité, CD Genomics propose une solution efficace, de bout en bout, adaptée à divers besoins de recherche. Que vous étudiiez des variants rares ou que vous séquenciez de l'ADN ancien, notre équipe garantit des résultats fiables avec un soutien flexible.
- ExpertiseNotre équipe possède une expertise approfondie dans l'utilisation de la technologie d'Oxford Nanopore pour diverses applications de séquençage.
- Technologie de pointeNous utilisons les dernières avancées en séquençage par nanopores pour fournir les meilleurs résultats possibles.
- Solutions personnalisables : Nous adaptons chaque projet aux besoins spécifiques de nos clients, garantissant des résultats pertinents et de haute qualité.
- Délai d'exécution rapideAvec des capacités de séquençage en temps réel, nous fournissons des informations rapides pour maintenir votre recherche sur la bonne voie.
- Soutien completDe la préparation des échantillons à l'analyse des données, nous offrons un soutien complet tout au long du processus de séquençage.
Résultats de la démo
Vitrine des résultats de la démo
Les lectures de nanopores couvrent l'intégralité des régions 16S/ITS, tandis que les plateformes de courtes lectures se limitent à des segments partiels.
Amélioration de la résolution taxonomique
Le séquençage par amplicon Nanopore améliore considérablement l'attribution au niveau des espèces par rapport aux méthodes de séquençage à lecture courte.
Précision du consensus avec suppression des erreurs
Des flux de travail avancés de correction d'erreurs réduisent les faux positifs et la formation de chimères, garantissant un consensus de haute fidélité.
Analyse de la diversité communautaire
L'analyse de la bêta-diversité permet une séparation claire des communautés microbiennes entre les groupes d'échantillons.
FAQ sur le séquençage des amplicons Nanopore
Q1. Qu'est-ce qui distingue le séquençage d'amplicons Nanopore des méthodes de lecture courte Illumina ?
Nanopore fournit des lectures complètes (par exemple, 16S V1–V9 ou ITS), permettant une résolution au niveau des espèces ou des souches. Les lectures Illumina sont plus courtes (par exemple, V3–V4) et peuvent mal classifier les espèces ou perdre des détails au niveau des souches.
Q2. Quand la correction d'erreur basée sur les codes-barres (étiquetage unique) est-elle nécessaire ?
Utilisez-le lorsque :
- vous exigez une très haute précision (par exemple, la détection de variants dans des échantillons clonaux ou mixtes),
- ciblant de longs amplicons susceptibles aux erreurs de séquençage ou de PCR,
- investiguer des taxa rares.
Q3. Combien de lectures par échantillon sont recommandées ?
- Pour le profilage communautaire : ≥ 50 000 lectures/échantillon pour saturer la diversité dans des échantillons de complexité modérée.
- Pour les amplicons clonaux : moins de lectures sont nécessaires, car l'accent est mis sur l'exactitude du consensus plutôt que sur la richesse.
Q4. Quels facteurs affectent le plus la qualité des données ?
- Entrée ADN : quantité, pureté (ratios OD), intégrité (taille des fragments).
- Spécificité de la PCR : amplifications propres à bande unique.
- Manipulation des échantillons : éviter les cycles de gel-dégel, la contamination, les inhibiteurs.
Q5. À quelle vitesse vais-je recevoir les résultats ?
Le délai de traitement dépend du type de projet et de la qualité de l'échantillon. Les projets clonaux sont généralement plus rapides, tandis que les études communautaires peuvent prendre plus de temps en raison d'étapes d'analyse supplémentaires.
Q6. Les résultats sont-ils adaptés à la publication ou à un usage réglementaire ?
Oui, pour usage uniquement à des fins de rechercheNous fournissons des rapports de qualité publication, des détails sur les méthodes, des bases de données de taxonomie versionnées. Cependant, ce service n'est pas certifié pour les diagnostics.
Q7. Quelles bases de données de référence internes sont utilisées pour l'attribution taxonomique ?
Nous utilisons des bases de données de référence complètes 16S/ITS, soigneusement sélectionnées et régulièrement mises à jour, pour garantir une attribution améliorée au niveau des espèces et une minimisation des erreurs de classification.
Q8. Puis-je séquencer plusieurs cibles géniques ou loci dans un seul échantillon ?
Oui, à condition que les amplifications PCR soient spécifiques (un produit distinct par cible). Des amplicons mélangés ou non spécifiques réduisent la précision et peuvent nécessiter des courses séparées ou des workflows personnalisés.
Études de cas sur le séquençage d'amplicons par nanopore
Contexte du client
Des chercheurs de Université TU Dortmund (Allemagne) et Université Nationale du Sud (Argentine) a étudié l'actinomycète Streptomyces albus CAS922. Cette souche a été isolée à partir de coques de graines de tournesol et a montré un fort potentiel pour dégradation de la lignocellulose et biosynthèse de métabolites secondairesPour explorer sa capacité métabolique et sa pertinence industrielle, l'équipe avait besoin d'un séquence complète du génome de haute qualité.
Défi
- Les actinobactéries contiennent généralement de grands génomes riches en GC (>70 %), ce qui complique le séquençage et l'assemblage.
- Les technologies de séquençage à lecture courte produisent souvent des assemblages fragmentés avec des répétitions non résolues, limitant l'analyse en aval des clusters de gènes biosynthétiques (BGC) et des enzymes actives sur les glucides (CAZymes).
- Le client avait besoin d'une approche capable de générer des lectures longues et continues et de soutenir une annotation précise pour la recherche en génomique fonctionnelle.
Notre solution
- CD Genomics a réalisé un séquençage à long fragment Oxford Nanopore en utilisant le kit de ligation SQK-LSK109.
- Génération de données : Plus de 1,5 Go de données propres provenant de plus de 260 000 lectures, avec une longueur de lecture N50 d'environ 8 kb.
- Stratégie d'assemblage : Assemblage de novo avec Canu, suivi d'un polissage avec Pilon pour améliorer la précision.
- Outils d'annotation : NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline (PGAP) pour l'appel de gènes ; RepeatMasker pour les éléments répétitifs ; CAZy/dbCAN2 pour la prédiction des enzymes actives sur les glucides ; antiSMASH pour la détection des clusters biosynthétiques.
Résultats
- Un chromosome linéaire complet de 8,06 Mb a été assemblé, atteignant une couverture d'environ 191× et un contenu en GC de 72,6 %.
- 6 776 gènes codant des protéines et 80 ARN ont été identifiés.
- 232 enzymes actifs sur les glucides ont été prédits, y compris trois enzymes dépendantes du cuivre impliquées dans la dégradation de la cellulose et du xylane.
- 27 clusters de gènes biosynthétiques ont été révélés, codant des métabolites tels que des sidérophores (desferrioxamine E), des terpènes (cyslabdan, géosmine) et des antibiotiques (xantholipine, pseudouridimycine).
Impact
- Le génome de haute qualité a permis d'obtenir des informations fonctionnelles au niveau des souches sur la dégradation de la lignocellulose, soutenant le développement d'applications de biomasse renouvelable.
- La découverte de divers clusters biosynthétiques a mis en évidence le potentiel biotechnologique de S. albus CAS922 pour la production de nouveaux antibiotiques et de composés bioactifs.
- Le projet a démontré comment le service de séquençage Nanopore de CD Genomics peut résoudre des génomes complexes à forte teneur en GC et fournir des informations biologiques exploitables.
Références
- Tippelt A, Nett M, Vela Gurovic MS. Séquence Génomique Complète de l'Actinobactérie Dégradant la Lignocellulose Streptomyces albus CAS922. Annonces de ressources microbiologiques. 21 mai 2020 ; 9(21) : e00227-20. doi : 10.1128/MRA.00227-20. PMID : 32439662 ; PMCID : PMC7242664.
- Sun B, Bhati KK, Song P, Edwards A, Petri L, Kruusvee V, Blaakmeer A, Dolde U, Rodrigues V, Straub D, Yang J, Jia G, Wenkel S. La méthylation médiée par FIONA1 de l'UTR 3' de FLC affecte les niveaux de transcript de FLC et la floraison chez Arabidopsis.. PLoS Génétique. 2022 Sep 27;18(9):e1010386. doi: 10.1371/journal.pgen.1010386. PMID: 36166469; PMCID: PMC9543952.
