Séquençage des petits ARN

Pour soutenir l'intérêt croissant de la recherche sur les petits ARN, CD Genomics propose un service de séquençage de petits ARN qualifié qui couvre la découverte de nouveaux petits ARN, la caractérisation des mutations et le profilage de l'expression des petits ARN en tirant parti des avancées. technologies NGS et pipeline d'analyse de données.

L'introduction au séquençage des petits ARN

Les espèces de petits ARN comprennent généralement les plus courantes et les mieux étudiées. microARN (miARN), ARN interférent petit (siRNA) et ARN interagissant avec piwi (piRNA), ainsi que d'autres types de petits ARN, tels que l'ARN nucléolaire petit (snoRNA) et l'ARN nucléaire petit (snRNA). Les petits ARN sont un type d'ARN non codant, peu abondant, de courte longueur (<200 nt), qui manquent de polyadénylation. Les populations de petits ARN peuvent varier considérablement entre différents types de tissus et espèces. En général, les petits ARN se forment par fragmentation de séquences d'ARN plus longues avec l'aide d'ensembles dédiés d'enzymes et d'autres protéines.

Les petits ARN agissent dans le silençage des gènes et la régulation post-transcriptionnelle de l'expression génique. Cependant, les petits ARN ne suffisent pas à induire l'interférence par ARN. Ils doivent généralement former le noyau du complexe protéine-ARN connu sous le nom de complexe de silençage induit par l'ARN (RISC). Les siARN peuvent cliver l'ARNm au milieu du duplex ARNm-siARN, et les moitiés d'ARNm résultantes sont dégradées par d'autres enzymes cellulaires. Contrairement à la voie des siARN, la dégradation médiée par les miARN est initiée par l'élimination enzymatique de la queue polyA de l'ARNm. Les piARN sont essentiels au développement des cellules germinales. Il a été démontré que les petits ARN sont impliqués dans un certain nombre de processus biologiques, y compris le développement, la prolifération et la différenciation cellulaires, ainsi que l'apoptose.

En tirant parti d'une production énorme avec une sensibilité et une plage dynamique sans précédent, NGS peut identifier des petits ARN faiblement exprimés ainsi que révéler quantitativement l'hétérogénéité en longueur et en séquence. NGS est un outil puissant pour enquêter sur la fonction des petits ARN et prédire les molécules cibles potentielles d'ARNm sans nécessiter de génomes de référence disponibles. L'obtention d'une bibliothèque de séquençage de petits ARN de qualité commence par l'isolement des petits ARN par fractionnement de taille à l'aide de la sélection par électrophorèse sur gel ou de colonnes à spin en silice à partir d'ARN total. Après la ligature des adaptateurs d'ARN, en utilisant un adaptateur d'ADN adénylé en 5' avec une extrémité 3' bloquée, les petits ARN sont transcrits à l'envers, amplifiés par PCR et séquencés. Pour identifier et annoter les miARN connus, les lectures de séquençage peuvent être mappées à une base de données spécifique à une espèce, telle que mirWalk et miRBase.

Avantages de notre service de séquençage des petits ARN

• Petits ARN et profilage des miARN
• Comprendre comment la régulation post-transcriptionnelle contribue au phénotype.
• Identifier davantage de petits ARN non cartographiés et d'isoformes, ainsi que de nouveaux biomarqueurs.
• Haute résolution, haute précision : Détection des différences de nucléotides uniques, comptage précis de quelques à des dizaines de milliers de copies.
• Haute capacité, haute qualité : Obtention de plus de 8 millions de séquences en une seule course de séquençage, période expérimentale courte, haute efficacité, faible coût et qualité fiable.
• Flux de travail analytique standardisé : Équipes de bioinformatique professionnelles et services d'analyse pour fournir des analyses standardisées, avancées et personnalisées.
• Expérience approfondie en séquençage et analyse des petits ARN : Techniciens de séquençage professionnels aidant à la conception expérimentale, à la résolution de problèmes et à l'analyse des résultats.
• Protocoles de séquençage d'ARN petit personnalisé : Adaptation de plans de séquençage d'ARN petit personnalisés en fonction des besoins spécifiques.

Flux de travail de séquençage des petits ARN

CD Genomics utilise les plateformes Illumina HiSeq pour séquencer les petits ARN. Nous avons des stratégies flexibles pour la découverte et le profilage des miARN (15-30 nt) et/ou des petits ARN (30-200 nt). Notre équipe d'experts très expérimentés met en œuvre une gestion de la qualité, suivant chaque procédure pour garantir des résultats fiables et impartiaux. Le flux de travail général pour le séquençage des petits ARN est décrit ci-dessous.

Spécification de service

	Exigences d'échantillon ARN total ≥ 1 μg, Quantité minimale : 200 ng, Concentration ≥ 20 ng/µl Cellules ≥ 2×106 Tissu ≥ 500 mg, Quantité minimale : 100 mg OD A260/A280 ratio ≥ 1,8, A260/230 ratio ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Tous les échantillons d'ARN total doivent être exempts d'ADN. L'ARN doit être conservé dans de l'eau sans nucléase ou dans RNA Stable. Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégies de séquençage Bibliothèques de miARN (15-30 nt), petits ARN (30-200 nt) ou plage de taille personnalisée. Illumina HiSeq SE50 ≥ 10 M lectures Plus de 90 % des bases avec un score de qualité ≥Q30
	Analyse de données Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Contrôle de la qualité des données brutes et filtre de longueur Cartographie basée sur des références Classification et quantification des petits ARN Prédiction et annotation des gènes cibles Prédiction de nouveaux petits ARN Analyse des gènes cibles des petits ARN différemment exprimés (enrichissement GO et enrichissement KEGG) Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage des petits ARN pour votre rédaction (personnalisation)

CD Genomics propose des packages complets de séquençage de petits ARN incluant la standardisation des échantillons, la préparation de bibliothèques, le séquençage approfondi, le contrôle de qualité des données brutes, l'assemblage du génome et une analyse bioinformatique personnalisée. Nous pouvons adapter ce processus à vos intérêts de recherche. Si vous avez des exigences supplémentaires ou des questions, n'hésitez pas à contactez-nous.

Les résultats partiels sont présentés ci-dessous :

Distribution de la qualité de séquençage

Distribution A/T/G/C

Interface du navigateur IGV

Analyse de corrélation entre les échantillons

Graphique des scores PCA

Diagramme de Venn

Diagramme de volcan

Résultats statistiques de l'annotation GO

Classification KEGG

1. Quel est le flux de travail pour le prétraitement des données ?

Les premières étapes consistent à couper les adaptateurs en utilisant FASTX et à effectuer une correction de k-mers optionnelle avec ECHO. Par la suite, le profil d'expression est formé par le mapping et l'annotation du génome. Si le nombre de lectures par échantillon varie, une normalisation est appliquée pour compenser les effets de sous-échantillonnage.

2. Combien de lectures sont nécessaires pour le séquençage des petits ARN ?

Cela dépend de votre application. Pour le profilage d'expression, une plage acceptée pour les lectures mappées par échantillon est de 100K à 2M. Pour les applications de découverte, il faut considérer au moins 5-10M.

3. Combien de réplicats biologiques ai-je besoin pour chaque condition ?

Les réplicats biologiques peuvent augmenter la confiance et réduire l'erreur expérimentale, et nous vous recommandons de soumettre au moins trois réplicats par échantillon. Notez que le nombre final de réplicats est déterminé par vos conditions expérimentales finales.

4. Comment devrais-je expédier des échantillons ?

Vous pouvez expédier avec de la glace sèche ou RNAstable à température ambiante. Empiriquement, l'expédition d'échantillons d'ARN dans RNAstable donne une bonne qualité d'ARN après reconstitution.

5. Puis-je soumettre E. coli échantillons de cellules ou de tissus ?

Oui, en plus des ARN, vous pouvez également soumettre des échantillons congelés. E. coli pellets cellulaires ou tissus avec de la glace carbonique.

6. L'enrichissement en poly-A ou l'épuisement de l'ARN est-il nécessaire pour le séquençage des microARN ?

Aucun enrichissement n'est requis pour séquençage de microARN car les adaptateurs sont ligaturés sélectivement uniquement aux petits ARN.

7. J'ai constaté que je ne pouvais pas ouvrir le fichier fastq téléchargé.

Veuillez vous assurer que votre ordinateur dispose de suffisamment de RAM pour ouvrir les fichiers volumineux. Vous pouvez les ouvrir avec un éditeur de texte sur des ordinateurs Windows disposant de suffisamment de RAM, ou sur des ordinateurs Linux, qui est une option préférée. Alternativement, vous pouvez envisager d'autres lecteurs spécifiques au format fastq.

Découverte de nouveaux microARN par séquençage de petits ARN dans le cerveau humain post-mortem

Journal : BMC Genomics
Facteur d'impact : 3,729
Publié : 4 octobre 2016

Contexte

Les microARN (miARN) régulent l'expression génique principalement par la répression translationnelle des molécules d'ARNm cibles. Plus de 2700 miARN humains ont été identifiés et certains ont été associés à des phénotypes de maladie et ont montré des motifs d'expression spécifiques aux tissus. Les auteurs ont mené des études de séquençage de petits ARN sur 93 échantillons de cortex préfrontal post-mortem humain provenant de patients atteints de la maladie de Huntington ou de la maladie de Parkinson. Ils ont réussi à découvrir 99 miARN nouveaux putatifs.

Matériaux et Méthodes

Résultats

Figure 1. Représentation sous forme de diagramme de flux du nouveau pipeline de découverte de miARN.

Un total de 8891 miARN ont été identifiés.

L'analyse miRDeep* des données de séquence provenant de 93 échantillons du cortex préfrontal humain a identifié 8891 miARN. 3641 miARN ont été conservés après filtrage pour les miARN connus de miRBase v20, d'autres petits ARN et des exons. Le reste a été filtré par le score miRDeep*. Des scores plus élevés indiquent une plus grande confiance dans le résultat d'un miARN. Au total, 99 miARN novateurs putatifs ont finalement été identifiés.

Figure 2. miRDeep* miARN putatifs et miARN de miRBase (A), et emplacements génomiques des miARN novateurs putatifs (B).

2. Au total, 99 miARNs novateurs putatifs

En utilisant l'aligner SSEARCH, 34 des 99 miARN matures putatifs novateurs se sont bien alignés avec au moins un miARN mature présent dans la miRBase v20. L'analyse d'expression différentielle utilisant des modèles linéaires ajustés pour l'âge au décès a montré que 4 des 99 miARN putatifs sont exprimés différemment entre les échantillons témoins et ceux de la maladie de Huntington, et que 3 étaient exprimés différemment entre les échantillons témoins et ceux de la maladie de Parkinson (Tableau 2). Les données détaillées sont présentées dans le Tableau 2 généré par LIMMA v. 3.33.7.

Figure 3. MiARNs novateurs putatifs, données de réplication des miARNs et Londin et al.miARN.

Conclusion

Les auteurs ont développé un pipeline utilisant miRDeep*, le séquençage RNA en pool et le filtrage par score pour découvrir 99 miARNs putatifs nouveaux à partir de 93 échantillons de cortex préfrontal humain post-mortem. Sept de ces miARNs ont été validés expérimentalement, et 19 ont été reproduits dans un jeu de données indépendant. Certains miARNs ont montré une expression différentielle entre les échantillons de HD et de contrôle ou de PD et de contrôle, suggérant des rôles potentiels dans les maladies neurodégénératives. Ces résultats soulignent la diversité des miARNs humains, en particulier dans des contextes spécifiques aux tissus, et leurs implications potentielles pour la compréhension de maladies comme la HD et la PD.

Référence :

1. Réveillez C, Labadorf A, Dumitriu A, et al.Nouvelle découverte de microARN grâce au séquençage de petits ARN dans le cerveau humain post-mortem. BMC génomique, 2016, 17(1) : 776.