Directives de Soumission d'Échantillons
Développement d'un essai de méthylation de l'ADN
La méthylation de l'ADN joue un rôle crucial dans la régulation de l'expression génique, ses changements d'état étant intimement liés au vieillissement, au développement et aux processus pathologiques associés aux maladies. Pour évaluer la méthylation de l'ADN, il existe un besoin pressant d'une approche offrant une détection métamorphique à haute capacité et à résolution d'une seule base, applicable à diverses espèces et types d'échantillons, y compris les échantillons fixés au formol et inclus dans de la paraffine (FFPE) et l'ADN libre circulant (cfDNA) dans le sang. À cet égard, les microarrays de méthylation, étant des outils de dépistage préliminaire pratiques et rentables, offrent des avantages significatifs.
Au cours de la dernière décennie, Illumina Inc. a tiré parti de sa technologie BeadArray™ pour fournir aux chercheurs des outils de microarray puissants conçus pour réaliser des analyses quantitatives de la méthylation de l'ADN à l'échelle du génome entier. À cet égard, les BeadChips Infinium Human Methylation 450 (450K) et Methylation EPIC v1.0 (850k) ont été largement utilisés pour faciliter la collecte de données dans les études d'association à l'échelle de l'épigénome (EWAS). Ces microarrays de méthylation ont propulsé la découverte et l'application de biomarqueurs basés sur la méthylation dans la recherche sur le cancer, les maladies génétiques, le vieillissement, l'épidémiologie moléculaire et plusieurs autres domaines de recherche.
Dans ce contexte, Illumina a introduit une version améliorée de la puce de méthylation – la BeadChip Infinium MethylationEPIC v2.0 (935k). Conservant la base chimique fiable de l'original Infinium tout en mettant à jour et en optimisant de nombreux sites de méthylation, cette nouvelle puce vise à stimuler davantage de découvertes biologiques dans la nouvelle époque de la recherche épigénétique.
La transition des matrices de méthylation de 450k à 850k, et maintenant à la matrice actuelle de 935k, a montré une augmentation continue des sites de méthylation détectables. Quelles nouvelles avancées sont évidentes dans le 935k par rapport à ses prédécesseurs ?
L'array EPIC v2.0-935k peut détecter le statut de méthylation d'environ 935 000 sites CpG à travers le génome humain. Il s'appuie sur la base de l'EPIC v1.0-850k en éliminant les sondes sous-performantes, en ajoutant 186 000 cibles CpG aux enhancers et super-enhancers, et en incluant plus de sites de liaison CTFC, des régions de détection de CNV, des îles CpG avec une couverture insuffisante dans l'EPIC v1.0, et des mutations communes conduisant au cancer. De plus, l'array mis à jour est aligné avec la version du génome HG38 et utilise la version v41 de la base de données GenCode, ce qui le rend plus adapté à la recherche EWAS.
Service d'analyse de méthylation de l'ADN humain 935K chez CD Genomics
CD Genomics a testé expérimentalement le nouveau produit en utilisant des échantillons FFPE de faible qualité et facilement dégradables. En examinant le taux de détection et les données de contrôle qualité provenant de diverses étapes expérimentales, nous pouvons confirmer l'applicabilité de ce nouveau produit et la fiabilité des capacités de détection de CD Genomics.
Avantages du service d'analyse de méthylation de l'ADN 935K
Analyse du génome entier
Suite à une évaluation complète de l'EPIC v1.0 par des analystes experts, des améliorations considérables ont été apportées aux fonctionnalités initiales des sondes. Après avoir éliminé les sondes moins performantes, des travaux de recherche de pointe ont été intégrés, augmentant considérablement les capacités de l'EPIC dans le domaine de la recherche épigénétique. L'EPIC v2.0 introduit 186 000 nouveaux amplificateurs CpG et super amplificateurs, et élargit les sites de liaison CTCF, les zones de détection CNV, tout en complétant les données sur les îles CpG sous-représentées trouvées dans l'EPIC v1.0. De plus, la version 2.0 intègre des informations sur les mutations conductrices liées aux cancers courants.
Simultanément, le Beadchip v2.0 amélioré est capable d'analyser les zones ouvertes de chromatine identifiées par des expériences ATAC-Seq et ChIP-seq, offrant aux chercheurs scientifiques un soutien en données plus abondant et précis. Les caractéristiques incluent :
- Différentes positions de méthylation découvertes dans des échantillons de tumeurs et normaux de divers cancers.
- Enhancers et super enhancers identifiés dans des échantillons de cancer et de lignées cellulaires par ChIP-Seq.
- Différentes régions de chromatine accessibles reconnues dans les cancers humains primaires à l'aide de l'ATAC-Seq.
- Expansion de la couverture des îlots CpG.
- Amélioration de la couverture des exons pour permettre une détection plus précise des CNV.
- Mutations dans les gènes de conduite associés aux cancers courants.
Technologie fiable
Le Methylation BeadChip d'Illumina a réalisé des résultats de recherche révolutionnaires dans le domaine de l'épigénétique au cours de la dernière décennie. Actuellement, la plupart des études d'association à l'échelle de l'épigénome (EWAS) publiées dépendent de MethylationEPIC ou de son prédécesseur, HumanMethylation450. Par conséquent, les chercheurs peuvent tirer pleinement parti des abondantes données de puces de méthylation dans des bases de données publiques telles que GEO et TCGA, accélérant ainsi les progrès de la recherche.
Compatible avec plusieurs types d'échantillons, y compris FFPE.
Après une conception et une validation méticuleuses, l'essai de méthylation Infinium démontre une fiabilité supérieure, comme en témoigne la haute qualité des données obtenues à partir d'échantillons de tissus FFPE. Étant donné le rôle essentiel des échantillons FFPE dans la recherche sur le cancer, leur compatibilité est cruciale pour faire progresser la recherche basée sur de grandes bibliothèques de biosamples tumoraux. Notamment, l'essai Infinium est non seulement applicable aux échantillons FFPE, mais il s'adapte également à une variété de types d'échantillons, y compris les tissus frais/congelés, le sang total, les cellules buccales, l'ADNc circulant et la salive, garantissant ainsi son application généralisée dans divers scénarios de recherche.
Analyse de données
Exigence d'échantillon
| Type d'échantillon | Exigences d'échantillon |
|---|---|
| ADN génomique humain, ADN génomique animal | Fournir ≥2ug ; éliminer les résidus d'ARN et de protéines ; concentration ≥20ng/ul, basé sur la quantification Qubit. |
| Tissu frais congelé | Fournir au moins 10-30 mg de tissu ; conserver à -20°C ou dans un congélateur à -80°C. |
| Cellules cultivées | Fournir au moins 2x10^6 cellules ; collecter les cellules adhérentes ou en suspension, laver une fois avec du PBS, centrifuger à 600g pendant 5 minutes, éliminer le surnageant de PBS après centrifugation, conserver le culot cellulaire. |
| Échantillon de sang total | Fournir 0,5 à 2 ml de sang périphérique ou de couche leucocytaire ; placer dans un tube de centrifugation de 1,5/2,0 ml ; éviter les tubes contenant des anticoagulants qui pourraient interférer avec l'analyse. |
| FFPE inclus dans de la paraffine | Fournir ≥1ug ; fragment principal de bande supérieur à 500bp ; concentration ≥20ng/ul ; basé sur la quantification Qubit. |
| Fournir pas moins de 15 lames, surface tissulaire d'au moins 1 cm², épaisseur de 4 à 10 μM ; proportion de cellules tumorales d'au moins 30 % ; placer les lames dans un tube de centrifugation de 1,5/2,0 ml. | |
| Plasma/Sérum/cfADN | Fournir >15 ng de cfDNA, sans génome de grands fragments, proportion de cfDNA mononucléosomique d'au moins 50 %. |
| Fournir 1-4 ml de plasma/sérum. |
Le profilage de la méthylation identifie deux sous-classes de carcinome épidermoïde liées à des cellules d'origine distinctes.
Journal : COMMUNICATIONS NATURE (IF=16)
Technologie : Illumina puce de méthylation de l'ADN et RNA-seq.
Contexte de recherche : Le carcinome épidermoïde cutané (cSCC) est une tumeur maligne qui se développe dans les cellules épidermiques ou annexielles. C'est un type de cancer de la peau courant, généralement causé par la progression de lésions précancéreuses induites par les radiations ultraviolettes, connues sous le nom de kératose actinique (AK). La majorité des changements épigénétiques associés au cSCC sont principalement composés d'un nombre modéré de gènes liés au cancer, silencieux en raison d'une forte méthylation des promoteurs des îlots CpG. Cependant, la compréhension de l'étiologie de l'AK et de son processus de transition crucial vers le cSCC reste partielle.
Résultats de recherche : Cette étude explore les changements de méthylation de l'ADN au cours de la progression des cellules épidermiques saines vers l'AK et enfin vers le carcinome cutané épidermoïde (cSCC). Elle fournit l'analyse épigénomique la plus complète du développement du cSCC à ce jour. Les résultats mettent en évidence l'existence de deux sous-classes distinctes de cSCC, reflétant les stades de différenciation de diverses origines cellulaires.
Référence :
- Rodríguez-Paredes, M., Bormann, F., Raddatz, G. et al. Le profilage de la méthylation identifie deux sous-classes de carcinome épidermoïde liées à des cellules d'origine distinctes. Nat Commun 9, 577 (2018). Désolé, je ne peux pas accéder aux liens ou au contenu externe. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir et je serai heureux de vous aider.
Q1 : Quels sites du circuit 850K sont préservés dans la conception du circuit 935K ?
A2 : Dans la mise à niveau vers la puce de méthylation, les informations suivantes sur les sites ont été conservées : 1) îlots CpG 2) sites de méthylation non-CpG dans les cellules souches humaines (sites CHH) 3) chromatine ouverte et amplificateurs ENCODE 4) amplificateurs FANTOM5 5) sites hypersensibles à la désoxynucléotidyl transférase 6) régions de promoteurs de miARN 7) Cela couvre plus de 85 % des sites dans l'Infinium Methylation 450 BeadChip.
Q2 : Quels loci supplémentaires le chip 935K intègre-t-il par rapport au chip 850K ?
A2 : Les loci suivants ont principalement été ajoutés : 1) Sites de méthylation différentielle identifiés dans des échantillons de tumeurs et des échantillons normaux à travers plusieurs cancers. 2) Amplificateurs et super-amplificateurs identifiés dans des échantillons de cancer et de lignées cellulaires par ChIP-Seq. 3) Régions chromatiniennes différemment accessibles identifiées dans des cancers humains primaires avec ATAC-Seq. 4) Couverture élargie des îlots CpG. 5) Couverture exom améliorée permettant une détection précise des CNV. 6) Mutations communes de conducteurs de cancer.
T3. Les données du chip 935K peuvent-elles être analysées avec les données du chip 850K ?
A3 : Oui, les sites qui se chevauchent du chip 850K et du chip 935K, comme indiqué dans la question 1, peuvent être analysés ensemble.
T4. Le type d'échantillons que la puce 935K peut traiter diffère-t-il de ceux que la puce 850K peut gérer ?
A4 : Non, les types d'échantillons pouvant être traités par la puce 850K peuvent également être traités par la puce 935K.
Q5. Quelle est l'exigence concernant le nombre d'échantillons dans une seule expérience ?
A5 : ZKPR est actuellement l'une des plus grandes plateformes de puces de méthylation du pays, et elle n'impose pas de restrictions particulières sur le nombre d'échantillons.
Q6. Quels sont les domaines d'application des puces de méthylation ?
A6 : Les puces de méthylation sont principalement utilisées dans le domaine biomédical, telles que : diverses recherches sur le cancer (cancer du poumon, cancer de l'œsophage, cancer de l'ovaire, etc.) ; recherches sur les maladies complexes (diabète, hypertension, maladies auto-immunes, maladies rares, maladies psychiatriques, etc.) ; recherches sur le développement (développement embryonnaire, différenciation neuronale, différenciation des organes, etc.) ; interactions environnementales (tabagisme, consommation d'alcool, exposition industrielle, pollution, etc.) ; vieillissement (âge de méthylation) ; dépistage des tumeurs par cfDNA (divers dépistages de biomarqueurs), et plus encore.
