Service DAP-Seq (séquençage par purification d'affinité de l'ADN)

CD Genomics propose des services DAP-seq utilisant des technologies génomiques avancées pour analyser la liaison des facteurs de transcription. Notre approche à haut débit identifie les interactions TF-ADN, fournissant des informations sur les réseaux régulateurs des gènes dans divers domaines de recherche. Ce service est idéal pour déchiffrer les mécanismes d'expression génique chez les plantes et les animaux, facilitant les avancées dans la recherche biologique.

L'introduction du DAP-Seq

L'identification complète des sites de liaison des facteurs de transcription (TFBS) dans l'ensemble du génome est essentielle pour caractériser les éléments régulateurs et la fonction des TF. ChIP-Seq La séquençage par immunoprécipitation de la chromatine (ChIP-seq) est une approche puissante pour déterminer in vivo les sites de liaison des facteurs de transcription (TFBS). Cependant, la méthode est limitée en échelle car elle dépend d'anticorps spécifiques pour chaque facteur de transcription, ce qui peut être techniquement difficile et coûteux. Actuellement, des méthodes alternatives comme le DAP-Seq peuvent offrir une méthode simple et à haut débit pour examiner la liaison des facteurs de transcription à leur cible cognée (ADNg) dans un contexte sans chromatine, tout en maintenant des informations importantes liées à la séquence génomique primaire et à la méthylation de l'ADN. La méthode ne nécessite pas d'anticorps spécifiques ni de primers spécifiques aux gènes, ce qui la rend adaptée à tous les eucaryotes, constituant ainsi un outil puissant pour comprendre les éléments régulateurs et la fonction des facteurs de transcription.

Le nom complet de DAP-seq signifie séquençage par purification d'affinité de l'ADN. Cette technique consiste à identifier les sites de liaison des facteurs de transcription (TFBS) grâce à l'expression in vitro des facteurs de transcription, sans être contraint par des anticorps ou des espèces, et présentant des avantages de haut débit. Depuis son apparition, cette technologie a été largement appliquée dans l'étude de la régulation transcriptionnelle et épigénomique.

Principe de l'expérience DAP-seq :

Dans les expériences DAP-seq, la protéine exprimée de manière externe et l'ADN sont soumis à une purification par affinité, suivie de séquençage à haut débit de l'ADN qui s'est lié à la protéine. Le processus fondamental consiste à construire la séquence codante (CDS) du facteur de transcription dans un vecteur contenant une étiquette d'affinité, à créer un vecteur d'expression protéique et à effectuer une expression protéique in vitro pour produire une protéine de fusion du facteur de transcription et de l'étiquette d'affinité. Par la suite, l'ADN génomique de l'échantillon est extrait, une bibliothèque d'ADN est construite, et le facteur de transcription exprimé in vitro avec l'étiquette d'affinité est combiné avec la bibliothèque d'ADN. L'ADN lié est ensuite éluté et soumis à un séquençage.

Comparaison de DAP-seq et ChIP-seq Technologies

Avantages de DAP-Seq

• Adapté au traitement d'échantillons à haut débit de l'ensemble des collections de clones ORF de TF.
• Ne nécessite pas d'anticorps spécifiques pour chaque facteur de transcription, relativement économique et adapté à tous les eucaryotes.
• Le DAP-Seq conserve de nombreuses modifications secondaires et caractéristiques spécifiques aux tissus/lignes cellulaires présentes dans l'ensemble du génome.
• Le processus d'enrichissement des fragments d'ADN aux sites de liaison des facteurs de transcription est plus simple.

Applications du DAP-Seq

• Analyse et caractérisation fonctionnelle des sites de liaison des facteurs de transcription
• Identification des types de modifications des histones à des loci spécifiques de l'ADN
• Étude sur la corrélation entre les modifications des histones et l'expression génique

Flux de travail DAP-Seq

Notre équipe d'experts hautement expérimentés exécute la gestion de la qualité en suivant chaque procédure pour garantir des résultats complets et précis. Notre flux de travail DAP-Seq est décrit ci-dessous, y compris la préparation de la bibliothèque, l'expression des protéines, la purification par affinité de l'ADN, le séquençage et l'analyse bioinformatique.

Fig 1. Procédure expérimentale de DAP-seq. (Anna Bartlett et al., 2017)

Spécifications du service

	Exigences d'échantillon TF≥ 5 µg, Quantité minimale : 1 µg, Concentration≥20 ng/µL Cellule ≥ 5 x106 Tissu ≥ 500 mg, Quantité minimale : 200 mg Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégie de séquençage Plateforme Illumina Hiseq/NovaSeq Plage de taille d'insertion d'environ 200 pb pour la préparation de bibliothèques d'ADN ≥20 M lectures propres
	Analyse bioinformatique Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Contrôle de la qualité des données Alignement au génome de référence avec des statistiques de cartographie Appel de pics et annotation Annotation des pics différentiels Analyse fonctionnelle des gènes associés aux pics Prédiction de motifs Analyse des voies Résultats de visualisation Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails dans DAP-Seq pour votre écriture (personnalisation)

Chez CD Genomics, nous vous proposons un séquençage de haute qualité et une analyse bioinformatique complète pour votre projet DAP-Seq, permettant l'identification des TFBS (sites de liaison des facteurs de transcription) à l'échelle du génome entier. Si vous avez des exigences supplémentaires ou des questions, n'hésitez pas à nous contacter.

Références

1. Ronan C. O'Malley, S. shan C. Huang, L. Song, et al. Les caractéristiques du cistrome et de l'épicistrome façonnent le paysage régulatoire de l'ADN, Cellule, 165 (2016) 1280–1292.
2. Anna Bartlett, Ronan C. O'Malley, S. shan C. Huang, et al. Cartographie des sites de liaison des facteurs de transcription à l'échelle du génome en utilisant DAP-Seq, Protocoles de la nature, 12 (2017) 1659–1672.

Les résultats partiels sont affichés ci-dessous :

1. Comment le DAP-seq simplifie-t-il l'enrichissement des sites de liaison des facteurs de transcription ?

Le DAP-seq simplifie l'enrichissement en marquant les facteurs de transcription (TF) avec un Halo-tag et en utilisant des billes magnétiques recouvertes de ligands spécifiques au tag. Cette stratégie de capture magnétique remplace l'immunoprécipitation traditionnelle, réduisant ainsi la complexité expérimentale.

2. Le DAP-seq peut-il détecter les sites de liaison de l'ADN des facteurs régulateurs ?

Certains facteurs régulateurs se lient à l'ADN de manière indirecte via des facteurs de transcription, et le DAP-seq ne peut détecter que les sites de liaison des facteurs de transcription qui se lient directement à l'ADN. Par conséquent, il n'est pas recommandé d'utiliser le DAP-seq pour détecter les sites de liaison des facteurs régulateurs qui se lient à l'ADN de manière indirecte.

3. Y a-t-il des limitations au DAP-seq ?

Malgré ses avantages, le DAP-seq repose sur l'expression protéique in vitro, ce qui peut introduire certaines différences par rapport aux expériences entièrement in vivo.

4. En quoi le DAP-seq diffère-t-il des expériences in vivo ?

Les conditions in vitro peuvent ne pas favoriser le repliement correct des protéines ou la formation de complexes nécessaires à la liaison TF-ADN, ce qui impacte la fonctionnalité de certains TFs.

Un réseau de régulation transcriptionnelle des brassinostéroïdes participe à la régulation de l'élongation des fibres dans le coton.

Journal : Physiologie des Plantes

Facteur d'impact : 7,479

Publié : 21 décembre 2022

Contexte

Les brassinostéroïdes (BR) sont des substances essentielles présentes dans le colza, régulant divers processus de développement et physiologiques dans le règne végétal. Une carence ou une insensibilité aux BR entraîne des changements morphologiques significatifs. Dans le coton, les BR jouent un rôle crucial dans l'élongation des fibres, affectant l'expression des gènes liés à la biosynthèse de la paroi cellulaire et à la dynamique du cytosquelette. Le facteur de transcription GhBES1.4 régule positivement l'élongation des fibres de coton en se liant à des gènes cibles spécifiques, comme identifié par DAP-seq et RNA-seq analyses.

Matériaux et Méthodes

Résultats

Dans cette étude, les auteurs ont utilisé DAP-seq pour identifier 9 894 régions de liaison à haute confiance de GhBES1.4 dans le coton, principalement situées près des sites de début de transcription. Ils ont également caractérisé les motifs de liaison de GhBES1.4, révélant une préférence pour les éléments E-box et une liaison à des motifs BRRE et nouveaux (MEME-3/4/5). Des essais de levure un-hybride et de BLI ont confirmé l'affinité de GhBES1.4 pour ces motifs, soulignant son rôle dans la régulation de l'expression génique, y compris GhCPD, GhCYP90D1 et GhBRL, essentiels pour le développement des fibres de coton.

Figure 1 Identification des gènes cibles directs de GhBES1.4 utilisant DAP-seq.

Figure 2 Caractérisation du site cible pour GhBES1.4.

Les auteurs ont généré des plantes de coton transgéniques GhBES1.4-OE et RNAi, découvrant que GhBES1.4 régule positivement l'élongation des fibres. Les plantes GhBES1.4-OE ont montré une augmentation de la longueur des fibres et une régulation à la baisse des gènes liés aux BR, tandis que les plantes RNAi ont présenté l'inverse. L'analyse RNA-seq a révélé 1 788 gènes exprimés différemment (DEGs) dans les plantes GhBES1.4-OE et 1 566 dans les plantes RNAi, impliquant des gènes liés à l'élongation de la paroi cellulaire, à la synthèse de la paroi primaire et à l'assemblage de la tubuline, indiquant le rôle de GhBES1.4 dans la régulation de l'expression des gènes liés à l'élongation des fibres.

Figure 3 L'intégration de DAP-seq, RNA-seq et des études d'association à l'échelle du génome (GWAS) identifie les gènes cibles pour GhBES1.4 afin de réguler l'élongation des fibres.

Cette étude a intégré DAP-seq, RNA-seq et GWAS pour identifier les gènes cibles de GhBES1.4 régulant l'élongation des fibres de coton. Le GWAS a identifié 390 gènes avec des loci SNP, dont 35 étaient fortement associés à la longueur des fibres (FL). L'analyse du transcriptome et la qPCR ont validé l'expression différentielle de 7 gènes dans des matériaux transgéniques. Des essais d'interférence de biofilm ont confirmé la liaison de GhBES1.4 aux promoteurs des gènes candidats, et des essais d'activité LUC ont montré une activation directe par GhBES1.4. Ces gènes, y compris RVE5, HMG1 et CYP84A1, influencent le développement des fibres via des voies telles que l'élongation cellulaire et la synthèse de la paroi cellulaire. Le silençage de GhCYP84A1 et GhHMG1 a considérablement raccourci la longueur des fibres, soulignant leur importance dans la régulation médiée par GhBES1.4 de l'élongation des fibres de coton.

Figure 4 Mécanisme de l'élongation des fibres médiée par GhBES1.4.

Conclusion

Cette étude démontre l'efficacité de DAP-seq pour identifier les gènes cibles de GhBES1.4 dans le coton, révélant 1 531 cibles potentielles. Cette approche offre une méthode rapide et robuste pour déchiffrer les réseaux régulateurs médiés par des facteurs de transcription dans des plantes comme le coton.

Référence

1. Liu L, Chen G, Li S, et al. Un réseau de régulation transcriptionnelle des brassinostéroïdes participe à la régulation de l'élongation des fibres dans le coton. Physiologie des plantes. 2023, 191(3) :1985-2000.