Directives de Soumission d'Échantillons
Qu'est-ce que le ChIP-Seq ?
Le ChIP-Seq, ou séquençage par immunoprécipitation de la chromatine, est une technique puissante de biologie moléculaire qui combine l'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) avec le séquençage à haut débit. Elle permet l'identification à l'échelle du génome des sites de liaison protéine-ADN. En utilisant des anticorps spécifiques pour enrichir les fragments d'ADN liés aux protéines cibles, suivis d'un séquençage de nouvelle génération, les chercheurs peuvent cartographier les interactions entre les protéines et le génome.
Cette méthode est largement utilisée pour étudier les facteurs de transcription, les modifications des histones et d'autres protéines associées à la chromatine. Elle aide les scientifiques à découvrir des processus biologiques clés tels que la régulation des gènes, les mécanismes épigénétiques, la différenciation cellulaire et le développement des maladies. Comparé au ChIP-qPCR traditionnel, le ChIP-Seq offre un débit plus élevé, une plus grande sensibilité et une meilleure résolution, permettant la découverte d'éléments régulateurs connus et nouveaux à travers le génome.
Aperçu des expériences ChIP-seq. (Hojo, Hironori, et Shinsuke Ohba., 2023)
Avantages de ChIP-Seq et comment il diffère de l'ATAC-Seq
- Haute spécificité pour une identification précise des sites de liaison protéine-ADN
La ChIP-Seq utilise des anticorps pour capturer sélectivement des fragments d'ADN liés à des protéines cibles. Cela permet une cartographie précise des facteurs de transcription, des modifications des histones et d'autres protéines régulatrices, révélant des éléments régulateurs clés et des mécanismes d'expression génique. - Couverture génomique pour déchiffrer de vastes réseaux régulateurs
En s'intégrant à des séquençages à haut débit, le ChIP-Seq analyse systématiquement les interactions protéine-ADN à travers l'ensemble du génome. Cela aide les chercheurs à acquérir une compréhension complète de la régulation de la chromatine et du contrôle de l'expression génique. - Protéine polyvalente et compatibilité des échantillons
La ChIP-Seq fonctionne avec une large gamme de cibles protéiques, y compris les facteurs de transcription et les marques d'histones, et prend en charge différents types d'échantillons tels que des cellules, des tissus et différentes espèces. Cette flexibilité répond à des besoins de recherche variés. - Analyse quantitative des interactions dynamiques protéine-ADN
Au-delà de l'identification des sites de liaison, le ChIP-Seq permet de comparer la force de liaison dans différentes conditions ou traitements, révélant des changements régulatoires dynamiques et des processus biologiques complexes.
| Caractéristique | ChIP-Seq | ATAC-Seq |
|---|---|---|
| Axes de recherche | Cartographie des sites de liaison spécifiques des protéines à l'ADN (par exemple, facteurs de transcription, marques d'histones) | Profils des régions de chromatine ouverte, reflétant l'accessibilité de la chromatine. |
| Dépendance aux anticorps | Oui, nécessite des anticorps spécifiques de haute qualité. | Non, sans anticorps. |
| Spécificité | Haute, localise précisément les interactions protéine-ADN | Inférieur, fournit un aperçu général de la chromatine accessible sans spécificité protéique. |
| Applicabilité | Idéal pour étudier des facteurs réglementaires spécifiques et leurs réseaux. | Mieux adapté pour le profilage de l'accessibilité de la chromatine à l'échelle mondiale et le dépistage initial des régions régulatrices. |
| Interprétation des données | Des sites de liaison clairs simplifient le lien avec les gènes cibles et les fonctions régulatrices. | Nécessite une intégration supplémentaire avec les données des facteurs de transcription pour une inférence fonctionnelle. |
Résumé :
- Le ChIP-Seq est préféré lorsque l'objectif est d'étudier les motifs de liaison d'un facteur de transcription particulier ou d'une modification des histones en raison de sa spécificité et de l'identification directe des sites de liaison.
- ATAC-Seq est une méthode plus rapide et plus simple pour examiner l'accessibilité de la chromatine à l'échelle du génome et identifier des régions régulatrices potentielles.
Types et spécifications des services ChIP-Seq
| Type de service | Volume de données recommandé | Plateforme de séquençage | Notes |
|---|---|---|---|
| ChIP-Seq de modification des histones | 8 Go par échantillon | Illumina NovaSeq/HiSeq | Pour les comparaisons de groupes, au moins 2 répliques biologiques par groupe sont recommandées, y compris les échantillons ChIP et Input. |
| Facteur de transcription ChIP-Seq | 6 Go par échantillon | Illumina NovaSeq/HiSeq | Les mêmes exigences pour les réplicats biologiques et les témoins que ci-dessus. |
Flux de travail du service ChIP-Seq
Discussion des exigences
Confirmation de plan
Inscription d'échantillon
Contrôle de qualité
Extraction d'ADN optionnelle
Fragmentation de la chromatine
Immunoprécipitation (ChIP)
Purification de l'ADN
Construction de bibliothèque et contrôle qualité
Sélection de méthode par type de protéine
Plateformes : NovaSeq/HiSeq PE150, DNBSEQ
Taille d'insertion : 150–300 pb
Données :
Facteurs de transcription : ≥ 20M lectures/échantillon
Modifications des histones : ≥ 50M lectures/échantillon
Données brutes (FASTQ)
Résultats de QC et d'alignement
Appel de pics et annotations
Rapport final complet
Explorez des solutions bioinformatiques détaillées ↓Analyse bioinformatique de ChIP-Seq
| Type d'analyse | Catégorie | Notes |
|---|---|---|
| Traitement des données brutes et contrôle de qualité | Un | Inclus |
| Annotation et statistiques du génome de référence | Un | Inclus |
| Alignement au génome de référence | A | Inclus |
| Appel de pics | A | Inclus. |
| Annotation de fonction GO pour les gènes liés aux pics | A | Inclus. |
| Annotation de voie KEGG pour les gènes liés aux pics | A | Inclus. |
| Analyse des pics différentiels | Un | Nécessite plus d'un échantillon |
| Analyse d'enrichissement GO des pics différentiels | A | Nécessite plus d'un échantillon |
| Analyse d'enrichissement KEGG des pics différentiels | Un | Nécessite plus d'un échantillon |
| Analyse des motifs (préférence de séquence de liaison) | Un | Inclus. |
Applications de ChIP-Seq
La ChIP-Seq est une technique fondamentale dans la recherche en épigénétique et en régulation des gènes. Elle est largement utilisée dans divers domaines pour découvrir les mécanismes de contrôle de l'expression génique et la fonction de la chromatine :
- Cartographie des sites de liaison des facteurs de transcription
La ChIP-Seq capture les régions d'ADN liées à des facteurs de transcription spécifiques. Cela aide à identifier leurs gènes cibles et révèle des réseaux de régulation génique. Elle est couramment utilisée dans des études sur la détermination du destin cellulaire, la régulation du développement et les modèles de maladies. - Profilage des paysages de modification des histones
En utilisant des anticorps contre des marques d'histones spécifiques (par exemple, H3K27ac, H3K4me3), le ChIP-Seq cartographie la distribution à l'échelle du génome des modifications de la chromatine. Cela aide à identifier des éléments régulateurs tels que les promoteurs et les enhancers. - Investigation des mécanismes de régulation épigénétique
Les pistes ChIP-Seq suivent les changements dynamiques des marques épigénétiques à travers les états cellulaires, les stades de développement ou les conditions pathologiques. Elles révèlent des motifs de silençage et d'activation des gènes, offrant des aperçus sur le cancer, la neurodégénérescence, les troubles immunitaires, et plus encore. - Découverte de cibles médicamenteuses et validation fonctionnelle
La technique évalue comment de petites molécules ou des médicaments ciblés affectent la liaison des facteurs de transcription ou des régulateurs épigénétiques à l'ADN. Cela soutient le dépistage et la validation des cibles dans le développement de médicaments. - Génomique fonctionnelle chez les plantes et les animaux
Le ChIP-Seq permet l'analyse fonctionnelle des protéines régulatrices chez des organismes non-modèles. Combiné aux données transcriptomiques, il aide à l'étude des traits complexes, de la résistance au stress et d'autres processus biologiques.
Exigences pour les échantillons ChIP-Seq
| Type d'échantillon | Montant de départ recommandé | Montant de départ minimum | Exigences supplémentaires |
|---|---|---|---|
| ADN ChIP | ≥ 10 ng | 5 ng | Concentration ≥ 1 ng/µl ; rapport OD 260/280 entre 1,8 et 2,0 ; traité avec de la RNase ; pas de dégradation ni de contamination. |
| Échantillons de cellules | ≥ 2 × 10⁷ cellules | 1 × 10⁵ cellules | Réticulé avec 1% de formaldéhyde ; lavé 3 fois avec du PBS ; les culots collectés par centrifugation ; congelé instantanément dans de l'azote liquide ; stocké à -80°C. |
| Échantillons de tissu | ≥ 500 mg | - | Immédiatement congelé à l'azote liquide après collecte ; éviter les cycles de congélation-dégel répétés ; transporter sur de la glace carbonique. |
Pourquoi CD Genomics est votre partenaire de confiance en ChIP-Seq
- Soutien à la validation rigoureuse des anticorps
La spécificité des anticorps peut faire ou défaire une expérience de ChIP-Seq. Nos experts vous aident à évaluer la performance des anticorps et les données des fournisseurs ou recommandent des anticorps ayant une performance ChIP-Seq prouvée, réduisant le bruit de fond et le risque d'échecs d'expériences. - Des décennies d'expertise à travers les espèces
Notre équipe possède des années d'expérience pratique avec le ChIP-Seq sur une large gamme de types d'échantillons : cellules, tissus, plantes et animaux. Vous bénéficiez de protocoles scientifiquement solides adaptés aux besoins de votre étude, allant des projets pilotes aux conceptions complexes multi-cohortes. - Données de haute qualité prêtes pour publication
Nous appliquons des points de contrôle de qualité rigoureux tout au long du flux de travail, de la préparation des échantillons à l'analyse finale, pour garantir que vos données répondent aux normes de publication évaluées par des pairs. Les données ChIP-Seq générées sur notre plateforme ont été publiées dans des revues de premier plan telles que Communications Nature. - Manipulation d'échantillons flexible
Que vous travailliez avec un matériel limité ou des groupes expérimentaux complexes, nos protocoles s'adaptent à votre type d'échantillon et à votre conception de recherche. Nous examinons vos informations sur l'échantillon à l'avance pour confirmer la faisabilité et suggérer des stratégies qui maximisent la qualité des données. - Support bioinformatique de bout en bout
Recevez un rapport bien structuré comprenant à la fois des données brutes et une analyse approfondie. De la détection de pics et de la découverte de motifs à l'annotation fonctionnelle et des voies, nous vous aidons à comprendre les données rapidement et avec confiance.
Référence
- Nakato, Ryuichiro et Toyonori Sakata. "Méthodes pour l'analyse ChIP-seq : un flux de travail pratique et des applications avancées." Méthodes 187 (2021) : 44-53. Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder aux liens ou aux contenus externes. Si vous avez un texte spécifique à traduire, veuillez le fournir ici et je serai heureux de vous aider.
- Jiang, Shan, et Ali Mortazavi. "Intégration de ChIP-seq avec d'autres données de génomique fonctionnelle." Briefings en génomique fonctionnelle 17.2 (2018) : 104-115. Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder aux liens ou au contenu externe. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici et je serai heureux de vous aider.
- Steinhauser, Sebastian, et al. "Une comparaison complète des outils pour l'analyse différentielle de ChIP-seq." Briefings en bioinformatique (2016) : bbv110. Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder à des liens ou à des contenus externes. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir et je serai heureux de vous aider.
- Ma, Shaoqian et Yongyou Zhang. "Profilage du paysage régulateur de la chromatine : perspectives sur le développement de ChIP-seq et ATAC-seq." Biomédecine moléculaire 1.1 (2020) : 9. Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder ou traduire le contenu d'un lien externe. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici.
- Muhammad, Isiaka Ibrahim, et al. "RNA-seq et ChIP-seq comme approches complémentaires pour la compréhension des mécanismes de régulation transcriptionnelle des plantes." Journal international des sciences moléculaires 21.1 (2019) : 167. Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder aux liens ou au contenu externe. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici et je serai heureux de vous aider.
- Hojo, Hironori, et Shinsuke Ohba. "Facteurs de transcription liés à Runt et mécanismes de régulation génique dans le développement squelettique et les maladies." Rapports actuels sur l'ostéoporose 21.5 (2023) : 485-492. Désolé, je ne peux pas accéder aux liens ou au contenu externe. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici.
Les résultats partiels sont affichés ci-dessous :
Distribution de pointe
Enrichissement des voies KEGG
Analyse des motifs
1. Qu'est-ce qu'un échantillon d'entrée et pourquoi est-il important ?
Un échantillon d'entrée est de l'ADN total provenant de chromatine soniquée qui n'a pas subi d'immunoprécipitation. Il sert de contrôle pour vérifier la qualité de fragmentation et aide à filtrer le bruit de fond, garantissant un appel de pics précis.
2. Comment un échantillon d'entrée est-il lié à l'échantillon IP (immunoprécipité) ?
Les échantillons d'entrée et d'IP sont traités en parallèle mais séquencés séparément. Leurs données sont ensuite intégrées pour identifier avec précision les véritables sites de liaison protéine-ADN.
3. Quelle quantité de données de séquençage est recommandée par échantillon ?
Nous recommandons au moins 20 millions de lectures propres par échantillon pour atteindre une profondeur suffisante pour une détection fiable des sites de liaison.
4. L'amplification par PCR est-elle nécessaire pour la préparation de la bibliothèque, et cela affecte-t-il les données ?
Oui, la PCR est généralement nécessaire pour amplifier l'ADN en vue du séquençage. Cependant, si l'ADN d'entrée est suffisant, moins de cycles peuvent être utilisés pour minimiser le biais. Dans l'ensemble, la PCR a un impact minimal sur les résultats.
5. La taille des fragments d'ADN affecte-t-elle la qualité du séquençage ?
Absolument. La taille de fragment idéale est de 200 à 300 pb, avec une plage totale entre 100 et 500 pb. Une taille de fragment cohérente améliore l'efficacité du séquençage et la qualité des données.
6. Un contrôle négatif est-il nécessaire pour le ChIP-Seq ?
Oui, l'échantillon d'entrée sert généralement de contrôle négatif. Des contrôles supplémentaires peuvent être inclus en fonction du budget et des objectifs de l'étude.
7. Quels facteurs affectent la qualité des données ChIP-Seq ?
Les facteurs clés incluent la spécificité des anticorps, la cohérence de la fragmentation de la chromatine, la préparation des échantillons, la profondeur de séquençage et le contrôle de la qualité des données.
8. Quelle est la différence entre la sonication et la digestion enzymatique pour la fragmentation de la chromatine ?
La sonication utilise l'énergie sonore et est idéale pour les études liées aux histones. La digestion enzymatique est plus douce et offre une meilleure reproductibilité, en particulier pour les facteurs de transcription à faible abondance.
9. Qu'est-ce qui cause des faux positifs dans le ChIP-Seq ?
Les sources incluent une mauvaise qualité de la chromatine, un biais de PCR, des régions répétitives ou des erreurs de séquençage. L'utilisation de contrôles d'entrée et d'analyses de motifs peut aider à réduire ces artefacts.
10. Quelles espèces sont adaptées pour le ChIP-Seq ?
Le ChIP-Seq est le mieux adapté aux organismes diploïdes avec des assemblages de génomes au niveau des chromosomes et des références bien annotées (y compris les fichiers GTF). Pour d'autres espèces, contactez-nous pour évaluer la faisabilité.
Mise en avant des publications clients
Identification d'un sous-complexe de protéine associée à l'ARN polymérase II et régulation épigénétique des caractéristiques cellulaires
Journal : Communications Nature
Facteur d'impact : ~12,1
Publié : 14 septembre 2023
DOI : 10.1038/s41467-023-41297-4
Contexte
Les populations cellulaires indifférenciées présentent des mécanismes moléculaires uniques qui maintiennent leurs fonctions régulatrices. Les modifications épigénétiques, en particulier la méthylation des histones, jouent un rôle crucial dans la modulation de ces processus. Cette étude identifie un nouveau sous-complexe protéique associé à l'ARN polymérase II impliquant KMT2A, PHF5A, PHF14, HMG20A et RAI1, qui régule épigénétiquement des propriétés cellulaires clés.
Objectif du projet
L'étude visait à :
- Caractériser les interactions protéine-protéine (IPP) de PHF5A dans des cellules de type souche en utilisant la protéomique et la génomique.
- Identifier des régulateurs épigénétiques influençant le maintien cellulaire par le biais de dépistage de petites molécules.
- Valider les mécanismes fonctionnels à travers ChIP-seq et RNA-seq analyse.
Services de CD Genomics
Cette étude a utilisé des méthodologies alignées avec L'expertise de CD Genomics:
- Profilage ChIP-Seq
- Cartographie à l'échelle du génome des sites de liaison de PHF5A, PHF14 et KMT2A.
- Identifié 171 cibles géniques co-occupées (par exemple, PAK3, FLT4, LINGO2).
- Appel de pics (MACS3) et analyse de motifs (HOMER).
- Analyse RNA-Seq
- Profilage transcriptomique des cellules inhibées par KMT2A (traitement par MM-102).
- Analyse d'expression différentielle (DESeq2) révélant 768 gènes surexprimés et 1317 gènes sous-exprimés.
- Intégration en bioinformatique
- Enrichissement des voies (signalisation Wnt, remodelage de la chromatine).
- Analyse de la distribution génomique (48,7 % dans le corps des gènes, 38,1 % dans les régions intergéniques).
Principales conclusions
- Sous-complexe PHF5A-PHF14-HMG20A-RAI1
- LC-MS/MS et Co-IP ont confirmé les interactions physiques entre ces protéines.
- Le ChIP-seq a révélé une co-occupation dans les régions régulatrices des gènes associés à l'entretien cellulaire.SOX2, NANOG).
- KMT2A en tant que régulateur épigénétique
- L'inhibition (via OICR-9429/MM-102) a réduit les niveaux de H3K4me3 et altéré l'auto-renouvellement.
- L'ARN-seq a montré une régulation transcriptionnelle à la baisse des voies de pluripotence.
- Validation fonctionnelle
- In vitro : L'inhibition de KMT2A a diminué la prolifération cellulaire (P < 0,001).
- In vivo : Croissance réduite dans des modèles de xénogreffe (50 mg/kg MM-102, P < 0,01).
Chiffres référencés
Fig. 3 : PHF14 occupe des sites de liaison à l'ADN communs avec PHF5A dans les PCSC.
Fig. 5 : KMT2A régule épigénétiquement les cellules PC et s'associe physiquement avec le sous-complexe protéique PHF5A-PHF14-HMG20A-RAI1 associé à l'ARN Pol II dans les PCSC.
Pour similaire études épigénétiques ou transcriptionnelles, explorez CD Genomics' ChIP-seq et RNA-seq services.
Référence
- Mouti, M.A., Deng, S., Pook, M. et al. KMT2A s'associe au sous-complexe PHF5A-PHF14-HMG20A-RAI1 dans les cellules souches cancéreuses du pancréas et régule épigénétiquement leurs caractéristiques. Nat Commun 14, 5685 (2023). Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder aux liens ou au contenu externe. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici et je serai heureux de vous aider.
Voici quelques publications qui ont été publiées avec succès en utilisant nos services ou d'autres services connexes :
Le PITX1 régulé à la baisse modifié par MiR-19a-3p favorise la malignité cellulaire et prédit un mauvais pronostic du cancer gastrique en affectant l'activation transcriptionnelle de PDCD5.
Journal : Physiologie Cellulaire et Biochimie
Année : 2018
Désolé, je ne peux pas accéder à des liens ou à des contenus externes.
L'IL-4 entraîne l'épuisement des CD8.+ Cellules CART
Journal : Nature Communications
Année : 2024
Les régimes riches en graisses pendant la grossesse entraînent des modifications de la méthylation de l'ADN et de l'expression des protéines dans le tissu pancréatique des descendants : une approche multi-omique.
Journal : Revue internationale des sciences moléculaires
Année : 2024
KMT2A s'associe au sous-complexe PHF5A-PHF14-HMG20A-RAI1 dans les cellules souches cancéreuses pancréatiques et régule épigénétiquement leurs caractéristiques.
Journal : Communications Nature
Année : 2023
L'hyperméthylation de l'ADN associée au cancer des cibles de Polycomb nécessite la double reconnaissance par DNMT3A de l'ubiquitination de l'histone H2AK119 et de la zone acide du nucléosome.
Journal : Science Advances
Année : 2024
L'expression paternelle monoallélique de type empreinte génomique détermine le sexe du poisson-chat à canal.
Journal : Science Advances
Année : 2022
Voir plus articles publiés par nos clients.
