Séquençage bisulfite à représentation réduite

CD Genomics propose un service de séquençage bisulfite à représentation réduite (RRBS) à une résolution d'un seul nucléotide en réduisant la quantité de séquençage nécessaire tout en capturant la majorité des promoteurs et d'autres régions génomiques pertinentes. Le RRBS est favorable à la découverte de biomarqueurs par l'identification et l'analyse des régions méthylées différemment (DMRs) entre les échantillons.

L'introduction du RRBS

La méthylation de l'ADN de la cytosine est une modification épigénétique impliquée dans la régulation de l'expression génique. La méthylation de l'ADN se produit principalement dans des contextes CpG, et ces di-nucléotides CpG sont plus abondants dans certaines régions du génome. Le RRBS est une approche puissante pour l'analyse de la méthylation de l'ADN à l'échelle du génome qui combine la digestion par des enzymes de restriction avec le séquençage au bisulfite pour enrichir une fraction dense en CpG du génome. Cette combinaison permet au RRBS d'améliorer l'efficacité de l'utilisation des échantillons et constitue une plateforme idéale pour les études pilotes et les applications cliniques.

RRBS ne séquence que les fragments concernant les régions riches en CpG à un coût considérablement réduit par rapport à séquençage bisulfite de tout le génome (WGBS)La RRBS est très rentable, étant donné qu'environ 1 à 5 % du génome est séquencé, couvrant environ 12 % des sites CpG à l'échelle du génome et environ 84 % des îlots CpG dans les promoteurs. Les plantes présentent une distribution des CpG différente : (i) absence d'îlots CpG caractéristiques dans les promoteurs ; (ii) présence à des bases de cytosine dans tous les contextes de séquence. Par conséquent, bien que l'enzyme MspI soit couramment utilisée chez les animaux et les humains, l'enzyme SacI/MseI est souvent utilisée chez les plantes.

Avantages de RRBS

• Exigence en ADN à faible apport
• Modèle de méthylation de la région riche en CpG à travers le génome
• Couvrant jusqu'à 5 millions de sites CpG chez l'humain
• Détection simultanée de la méthylation de l'ADN et des SNPs.
• Découverte de biomarqueurs épigénétiques
• Résolution à un seul nucléotide et rentabilité

Applications de RRBS

Le séquençage bisulfite à représentation réduite peut être utilisé pour, mais sans s'y limiter, les recherches suivantes :

Recherche sur le cancerLa recherche sur le cancer utilise la technologie RRBS pour cartographier méticuleusement les profils de méthylation de l'ADN à travers différents types de cancers. En scrutant les disparités dans les motifs de méthylation entre les tissus cancéreux et sains, le RRBS aide à identifier des marqueurs de méthylation spécifiques au cancer. Cela éclaire les processus épigénétiques impliqués dans l'apparition et le développement du cancer. De plus, le RRBS révèle des altérations spécifiques de la méthylation de l'ADN qui pourraient potentiellement être utilisées comme indicateurs précoces pour des stratégies de diagnostic innovantes. Cette approche souligne le rôle crucial de l'épigénétique dans la recherche sur le cancer et met en avant la recherche de nouveaux biomarqueurs pour la détection précoce et l'intervention.

Biologie du développementLa technologie RRBS est un atout précieux pour étudier les changements multifacettes de la méthylation de l'ADN qui se produisent pendant le développement embryonnaire. Elle permet une analyse complète des motifs de méthylation spécifiques aux stades et aux types cellulaires, éclairant les dynamiques complexes de la régulation épigénétique. De plus, le RRBS permet d'observer les modifications de la méthylation de l'ADN tout au long de la différenciation des cellules souches, déchiffrant les mécanismes épigénétiques qui orchestrent de manière complexe la détermination du destin cellulaire et l'expression des gènes.

NeurosciencesDans le domaine des neurosciences, le RRBS examine les profils de méthylation de l'ADN dans les troubles neurologiques tels que la maladie d'Alzheimer et l'autisme, révélant leur base épigénétique et améliorant les stratégies diagnostiques et thérapeutiques. De plus, le RRBS explore les changements de méthylation de l'ADN liés à la formation de la mémoire et aux processus d'apprentissage, faisant progresser la compréhension de la régulation épigénétique dans la fonction neuronale et le comportement.

Études évolutives et écologiquesLa technologie RRBS constitue un outil puissant pour mener des études comparatives sur les motifs de méthylation de l'ADN parmi diverses espèces ou populations dans le domaine de la recherche évolutive et écologique. Grâce à cette méthodologie, les chercheurs peuvent explorer les impacts de l'épigénétique sur les dynamiques évolutives et les réponses adaptatives. De plus, le RRBS examine les répercussions des facteurs environnementaux, tels que la pollution et les variations nutritionnelles, sur la modulation complexe de la méthylation de l'ADN, révélant ainsi l'interaction complexe entre les altérations épigénétiques et les influences environnementales.

Sciences agricolesDans le domaine de la science agricole, le RRBS sert d'outil essentiel pour examiner les profils de méthylation de l'ADN au sein des systèmes de culture pertinents pour des attributs cruciaux tels que la résistance aux maladies, la capacité de rendement et la qualité des produits. De telles analyses fournissent des orientations critiques pour les initiatives de sélection visant à améliorer les qualités des variétés de cultures. De plus, dans le domaine de l'élevage, le RRBS distingue les indicateurs épigénétiques associés aux traits de production recherchés et au bien-être général, contribuant ainsi à des éclairages qui informent les choix de sélection stratégiques et élèvent l'efficacité des régimes de sélection.

Flux de travail RRBS

Le flux de travail général pour le séquençage RRBS est décrit ci-dessous. RRBS utilise l'enzyme de restriction MspI pour couper aux sites CCGG à travers le génome, enrichissant ainsi les régions riches en CpG. Les régions contenant des CpG sont ensuite récupérées par purification sur gel. Après la ligature des adaptateurs méthylés, la réparation des extrémités et l'ajout d'une queue dA, ces fragments sont ensuite convertis par bisulfite, amplifiés et séquencés. Notre équipe d'experts hautement expérimentés exécute la gestion de la qualité, suivant chaque procédure pour garantir des résultats fiables et impartiaux.

Spécification de service

	Exigences d'échantillon ADN génomique ≥ 1 μg, Quantité minimale : 20 ng, Concentration ≥ 20 ng/µl Cellules ≥ 5×106Quantité minimum : 3×103 Tissu ≥ 30 mg OD 260/280=1,8~2,0 Tout l'ADN doit être traité avec de l'ARNase et ne doit montrer aucune dégradation ni contamination. Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégies de séquençage Préparation de bibliothèque RRBS Illumina HiSeq X Ten, paire de 150 pb Profondeur de séquençage > 50M de lectures propres Plus de 80 % des bases avec un score de qualité ≥Q30
	Analyse des données Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Alignement par rapport au génome de référence Analyse de la couverture des promoteurs et des îlots CpG Analyse du niveau de méthylation des promoteurs et des îlots CpG Analyse des régions différemment méthylées (DMR) Annotation fonctionnelle des gènes exprimés de manière différentielle Relation entre le niveau de méthylation et la longueur des éléments fonctionnels Distribution des régions CpG Distribution régionale des gènes Remarque : Les sorties de données recommandées et les contenus d'analyse affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur la représentation réduite du séquençage par bisulfite pour votre rédaction (personnalisation)

En combinant la digestion enzymatique, la conversion au bisulfite et technologie NGSCD Genomics est en mesure de fournir le RRBS comme une alternative pour générer et profiler des méthylomes à l'échelle du génome à un coût réduit. Si vous avez des exigences supplémentaires ou des questions, n'hésitez pas à nous contacter.

Références :

1. Guo H, Zhu P, Guo F, et al.Profilage des paysages de méthylome ADN des cellules mammifères avec le séquençage bisulfite à représentation réduite à cellule unique. Protocoles de la nature, 2015, 10(5) : 645.
2. Meissner A, Gnirke A, Bell G W, et al.Séquençage bisulfite à représentation réduite pour une analyse comparative de la méthylation de l'ADN à haute résolution. Recherche sur les acides nucléiques, 2005, 33(18) : 5868-5877.

Résultats de la démo

Les résultats partiels sont affichés ci-dessous :

FAQs sur la séquençage bisulfite à représentation réduite

1. Quel est le flux de travail pour RRSB ?

Le flux de travail de la RRBS est illustré dans la Figure 1 ci-dessous. En résumé, l'ADN est d'abord digéré, typiquement avec MspI qui est insensible à la méthylation et coupe aux sites CCGG, enrichissant ainsi les régions riches en CpG du génome. Les extrémités des fragments sont ensuite réparées et dotées d'une queue en dA, et des adaptateurs sont ligaturés. Par la suite, les fragments sont sélectionnés par taille, convertis par bisulfite, amplifiés et séquencés.

Figure 1. Le schéma de flux pour RRBS.

2. Quelles sont les exigences pour le séquençage des échantillons ?

Vous pouvez soumettre des cellules (au moins 5*10).⁶), tissus frais (au moins 2~3 g), ou ADN (au moins 5 μg ; concentration ≥ 100 ng/µl ; OD = 1,8~2,0 ; sans dégradation ni contamination par l'ARN ou dégradation sévère). Avant l'expédition, les cellules doivent être conservées à -80°C, et l'ADN doit être dissous dans de l'eau et conservé à -20°C. Veuillez éviter les cycles de congélation-dégel répétés. Lors de l'expédition, les échantillons doivent être scellés avec du parafilm et maintenus dans un état congelé, probablement avec des packs de glace.

3. Quelles espèces sont adaptées au séquençage bisulfite de représentation réduite ?

Les espèces soumises à RRBS doivent répondre à trois exigences : (i) eucaryotes ; (ii) son génome de référence doit avoir été assemblé au niveau des échafaudages au moins ; (iii) des annotations génomiques relativement complètes.

Études de cas sur la séquençage bisulfite à représentation réduite

Les changements de méthylation de l'ADN induits par des photopériodes longues et courtes dans Nasonia

Journal : Recherche sur le génome
Facteur d'impact : 11,922
Publié : 15 décembre 2015

Résumé

Frelon Nasonia vitripennis est un organisme modèle émergent qui présente une forte réponse photopériodique et peut être utilisé pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents à la synchronisation photopériodique. Les auteurs ont tenté de comprendre comment les femelles Nasonia contrôler la trajectoire de développement de leur progéniture pour survivre à l'hiver en tirant parti de la méthode RRBS. Il a été démontré que l'inhibition de la méthyltransférase de l'ADN ou le blocage de la méthylation de l'ADN perturbe largement la réponse de diapause photopériodique des guêpes, ce qui suggère le rôle de Méthylation de l'ADN dans le chronométrage photopériodique des insectes.

Matériaux et Méthodes

Résultats

1. Le Nasonia méthylome

Les auteurs ont profilé la méthylation de l'ADN dans l'ADN génomique extrait de femelles. N. vitripennis maintenus dans des conditions de jour long ou court en utilisant RRBS. La méthylation des CpG représente une grande partie du chevauchement entre les deux échantillons, contrairement à d'autres contextes de séquence (Figure 1B), ce qui peut suggérer que la méthylation non-CpG représente en grande partie du bruit expérimental. Les CpG semblent être soit fortement soit légèrement méthylés (Figure 1C). La majorité des CpG méthylés étaient situés dans des exons, et la majorité étaient situés dans des introns, des régions promotrices et des régions intergéniques (Figure 1D, E).

Figure 1. Le Nasonia méthylome.

2. Identification des gènes différemment méthylés

Les auteurs ont identifié 51 sites CpG différentiellement méthylés (DMC) qui ont été mappés à 37 gènes. Environ la moitié des DMC (23/51) ont montré une hypométhylation en jour long par rapport au jour court, tandis que les autres ont montré la tendance inverse. Des qPCR ont été réalisées pour valider l'analyse RRBS.

Figure 2. Méthylation différentielle de l'ADN associée à la photopériode dans Nasonia.

3. Tests fonctionnels démontrant un rôle causal de la méthylation de l'ADN

Les auteurs ont réduit l'expression de Dnmt1a-c et Dnmt3 en injectant de l'ARN double brin dans des pupes femelles de N. vitripennis souche AsymC. La réduction d'expression a été vérifiée par qPCR. La réduction de Dnmt1a a conduit à des femelles produisant des descendants en diapause, indépendamment de la durée du jour. Le silence de Dnmt3 a entraîné une différence non significative (mais proche de la signification) dans la réponse en diapause, suggérant que l'effet de Dnmt3 est beaucoup plus faible ou plus difficile à résoudre.

Ils ont également testé l'impact de la méthylation de l'ADN de manière pharmacologique en utilisant l'inhibiteur de méthylation de l'ADN 5-aza-2'-désoxycytidine (5-aza-dC), et ont observé une réduction de la diapause chez la progéniture des guêpes maintenues en jour court, ainsi qu'une augmentation de la progéniture en jour long.

Figure 3. La méthylation de l'ADN est nécessaire pour la réponse de diapause médiée par le photopériodisme.

Figure 4. Tests pharmacologiques utilisant 5-aza-dC.

Conclusion

Les auteurs ont trouvé que la méthylation de l'ADN dans Nasonia vitripennis les changements avec le photopériode saisonnier. La perturbation des enzymes de méthylation clés (Dnmt1a ou l'utilisation de 5-aza-dC) modifie la façon dont les femelles réagissent aux photopériodes. Leurs données de méthylome haute résolution montrent que les motifs de méthylation de Nasonia sont centrés sur le corps des gènes, similaires à d'autres insectes. Cela confirme le rôle de la méthylation de l'ADN dans la réponse au photopériode et suggère que différentes méthyltransférases ont des fonctions distinctes dans ce processus.

Référence :

1. Pegoraro M, Bafna A, Davies N J, et al.Des changements de méthylation de l'ADN induits par des photopériodes longues et courtes dans Nasonia. Recherche génomique, 2016, 26(2) : 203-210.