Séquençage d'ARN à cellule unique

CD Genomics propose un service de recherche sur le transcriptome robuste jusqu'à des niveaux d'entrée à cellule unique dans des échantillons de haute qualité. Ces modèles d'expression génique globaux dans les cellules uniques ont déjà considérablement avancé la biologie cellulaire.

L'introduction du scRNA-seq

Les cellules sont l'unité de base de la vie et chaque cellule est unique. La capacité de révéler des événements cellulaires complexes dans les systèmes biologiques est essentielle pour mieux comprendre les contributions cellulaires durant le développement ou la progression des maladies. La recherche sur l'expression génique à la résolution unicellulaire sur des échantillons composés de populations cellulaires mixtes permet d'obtenir des informations approfondies sur la complexité du transcriptome de divers types cellulaires.

Le séquençage d'ARN à cellule unique (scRNA-seq) est un séquençage à haut débit technologie conçue pour explorer l'expression génique au niveau de la cellule individuelle. L'avènement de cette technologie a permis aux chercheurs d'explorer les profils d'expression génique des cellules uniques, découvrant ainsi l'hétérogénéité et les différences fonctionnelles entre les cellules. En utilisant le scRNA-seq, les scientifiques peuvent acquérir des profils d'expression génique complets des cellules individuelles, ce qui facilite la révélation de l'hétérogénéité cellulaire, des trajectoires de développement et la classification des types cellulaires.

CD Genomics propose des outils de préparation de bibliothèques et de séquençage de premier ordre à partir d'une seule cellule, de quelques cellules et d'apports d'ARN ultra-faibles. En combinant la technologie de synthèse de cDNA robuste avec le séquençage de nouvelle génération Illumina et les technologies d'analyse, nous offrons des données fiables de la plus haute qualité pour étudier l'hétérogénéité du transcriptome cellule à cellule.

Avantages de la scRNA-seq

• Haute SensibilitéLe séquençage d'ARN à cellule unique (scRNA-seq) excelle dans la détection des expressions géniques à faible abondance, permettant l'identification de gènes et de transcrits rares qui pourraient être manqués par des méthodes traditionnelles.
• Haute RésolutionCette technologie de pointe permet une mesure précise de l'expression génique au sein de cellules individuelles, éclaircissant les différences subtiles et les processus de différenciation complexes qui les caractérisent.
• Haut DébitLa scRNA-seq peut évaluer simultanément les niveaux d'expression de nombreux gènes, offrant ainsi une vue d'ensemble et détaillée des schémas d'expression génique cellulaire.
• Compréhension approfondie des caractéristiques cellulairesGrâce à l'analyse détaillée de l'expression génique à l'échelle unicellulaire, les chercheurs peuvent acquérir une compréhension plus profonde et plus nuancée des fonctions cellulaires et des caractéristiques intrinsèques.
• Découverte de nouveaux types de cellules et de marqueurs de maladiesLa scRNA-seq aide à la découverte de types cellulaires précédemment non identifiés et de nouveaux marqueurs de maladie, contribuant aux avancées dans le diagnostic des maladies et le développement de thérapies ciblées.
• Large éventail d'applicationsCette technologie polyvalente est applicable à un large éventail d'échantillons, y compris les tissus, les organes, les embryons et les tumeurs, et joue un rôle essentiel dans l'avancement de la recherche dans des domaines tels que la médecine, l'écologie et les sciences de l'environnement.

Applications du scRNA-seq

Recherche sur les tumeurs

• Révéler l'hétérogénéité des cellules tumorales
• Surveillance de la progression tumorale
• Analyse des cellules immunitaires
• Mécanismes d'évasion immunitaire et de résistance aux médicaments

Différenciation des cellules souches

• Suivi des changements d'expression génique
• Gènes et voies régulatrices clés

Neurobiologie

• Étude des cellules neuronales et gliales
• Exploration de la dynamique de l'expression génique dans le développement neural
• Investigation de la base moléculaire des maladies neurologiques

Biologie du développement

• Détermination de la destinée cellulaire et formation des tissus
• Comprendre les troubles du développement et les maladies génétiques

Régulation immunitaire

• Analyse de l'expression génique dans les cellules immunitaires
• Réponses immunitaires dans les infections, l'inflammation et les maladies auto-immunes

Flux de travail scRNA-seq

L'avènement des technologies de tri/partitionnement des cellules, telles que la cytométrie en flux et la microfluidique, a permis de capturer des cellules uniques, et l'ADN ou l'ARN de ces cellules uniques est amplifié pour le séquençage à cellule unique. Le flux de travail général pour le séquençage de l'ARN à cellule unique est décrit ci-dessous.

Description des techniques

Flux de travail mRNA à cellule unique Fluidigm C1Avec le système Fluidigm C1, nous proposons un service de profilage du transcriptome à cellule unique à une échelle optionnelle. Le C1 peut capturer et traiter rapidement et de manière fiable des cellules individuelles. Les étapes du flux de travail Integrated C1 Single-Cell mRNA Seq incluent des circuits fluidiques (IFC) pour capturer les cellules, convertir l'ARN polyA+ en cDNA complet et effectuer une amplification universelle du cDNA. Avec les circuits microfluidiques personnalisables, le C1 permet une transition fluide de l'identification des populations cellulaires critiques à la génération de bibliothèques de séquençage pour le comptage de l'extrémité 3′ des transcrits, le séquençage d'ARNm complet, le séquençage d'ADN, l'analyse épigénétique, le profilage de l'expression des micro-ARN et plus encore.

SMART-seq Ultra Low Input ARN pour le séquençageLa technologie SMART fournit des informations de transcript complet, permettant l'analyse des isoformes de transcrits, des fusions de gènes, des mutations ponctuelles, etc. Le kit utilisant cette technologie permet aux utilisateurs de réaliser une synthèse de cDNA directement à partir de 1 à 1 000 cellules intactes ou d'ARN total à ultra faible entrée avec une grande reproductibilité et une représentation précise des transcrits riches en GC. Les bibliothèques de cDNA de longueur complète produites avec ce kit sont compatibles avec les plateformes Illumina.

Spécifications de service

	Exigences d'échantillon Type d'échantillon : Suspension de cellules uniques, Tissu frais Quantité et qualité recommandées : 2×106 cellules Quantité et qualité minimales : 1×106 cellules Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégie de séquençage Les options de service flexibles incluent HiSeq X et MGI DNBSEQ-T7/DNBSEQ-G400.
	Analyse bioinformatique Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Caractérisation avancée des types cellulaires Affinage des populations cellulaires cibles par reclustering Analyse de la variation des ensembles de gènes (GSVA) Analyse différentielle d'expression intégrée (iDEA) Évolution des états de population cellulaire Analyse de timing proposée Analyse des taux pour les transitions cellulaires Exploration de trajectoire Plus d'exploration de données à votre demande. Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage d'ARN à cellule unique pour votre rédaction (personnalisation)

La conférence de séquençage unicellulaire de CD Genomics se concentre sur les liens entre la variation cellulaire dans les tissus et la fonction des organes, et éclaire davantage les origines des maladies. Si vous avez des exigences supplémentaires ou des questions, n'hésitez pas à nous contacter.

Références

1. Wu, AR et al.Évaluation quantitative des méthodes de séquençage d'ARN à cellule unique. Méthodes de la natureJanvier 2014 ; 11(1) : 41–46.
2. Picelli, S et al.Séquençage RNA complet à partir de cellules uniques en utilisant Smart-seq2.Protocoles de la nature. Jan 2014;9(1):171-81.

Les résultats partiels sont affichés ci-dessous :

1. Quel est le but du séquençage de l'ARN à cellule unique ?

Le but du séquençage d'ARN à cellule unique (scRNA-seq) est d'explorer le monde complexe des profils d'expression génique des cellules individuelles. Contrairement au séquençage d'ARN en vrac traditionnel qui moyenne les signaux d'un mélange de cellules, le scRNA-seq permet aux chercheurs de disséquer la composition génétique unique de chaque cellule. Cette technologie est essentielle pour découvrir l'hétérogénéité cellulaire, identifier des types de cellules rares, suivre les processus de développement à un niveau granulaire et élucider comment les cellules réagissent différemment dans divers contextes biologiques, y compris les maladies.

2. Quelle est la différence entre RNA-Seq et scRNA-seq ?

Traditionnel Séquençage de l'ARN (RNA-Seq) requiert généralement un grand nombre de cellules en entrée, ce qui entraîne un profil d'expression moyen d'une population cellulaire mixte. Cette approche néglige les différences entre les cellules individuelles. En revanche, le séquençage d'ARN à cellule unique (scRNA-seq) analyse l'expression génique au niveau des cellules individuelles. Cela est réalisé en amorçant et en amplifiant de manière aléatoire les transcrits d'ARN de chaque cellule, suivi par séquençage à haut débitPar conséquent, le scRNA-seq permet l'examen détaillé de l'expression génique dans chaque cellule, révélant ainsi l'hétérogénéité cellulaire que le RNA-Seq traditionnel ne peut pas.

3. Quelle est l'utilité de l'analyse du pseudotemps ?

Dans de nombreux processus biologiques, les cellules ne sont pas toutes synchronisées au même stade temporel. Lors de l'étude de la différenciation cellulaire en utilisant l'expression génique à cellule unique, les cellules capturées couvrent souvent une large gamme de stades différents : certaines cellules n'ont pas encore commencé leur différenciation, certaines sont dans des états intermédiaires, et d'autres peuvent avoir terminé leur différenciation. En conséquence, les profils d'expression génique parmi les cellules d'un échantillon peuvent présenter une variabilité considérable, rendant l'analyse assez complexe. L'analyse de pseudotemps utilise les données d'expression génique pour estimer la distance temporelle entre les cellules. En calculant cette distance, elle peut organiser les cellules le long d'une trajectoire de développement inférée, représentant le chemin le plus court à travers toutes les cellules dans leur progression de pseudotemps. Cette méthode aide à comprendre les types de cellules présentes dans l'échantillon et le processus global de différenciation cellulaire.

4. Comment déterminer les types de cellules spécifiques dans un cluster ?

(1) Utilisation de gènes marqueurs connus

a. Basé sur des gènes marqueurs établisD'après des recherches et de la littérature antérieures, certains types de cellules sont connus pour exprimer spécifiquement certains gènes marqueurs, tels que CD3/CD4 dans les cellules T ou CD19/CD20 dans les cellules B.

b. Identification de l'expression des gènes marqueurs au sein des clustersEn utilisant des outils comme Loupe Cell Browser ou d'autres logiciels, les chercheurs peuvent étiqueter les cellules exprimant des gènes marqueurs spécifiques pour déduire quel cluster correspond à un type cellulaire particulier.

c. Utilisation de gènes différemment exprimés ou de gènes marqueurs identifiés par des logicielsDes logiciels comme Cell Ranger et monocle2 (ou d'autres outils d'analyse unicellulaire) fournissent des résultats sur les gènes exprimés différemment au sein des clusters. S'il existe des gènes marqueurs connus pour un type cellulaire, ils peuvent être recherchés dans la liste des gènes exprimés différemment pour inférer si un cluster représente ce type cellulaire.

(2) Détermination basée sur les voies fonctionnelles

a. Lorsque les gènes marqueurs spécifiques sont inconnusSi des gènes marqueurs spécifiques ne sont pas clairs ou ne peuvent pas être trouvés dans certains clusters, les chercheurs peuvent déduire les fonctions cellulaires en fonction des voies dans lesquelles les gènes exprimés différemment ou les gènes co-exprimés sont impliqués, en utilisant les analyses de voies KEGG et GO. Cette approche aide à déduire les caractéristiques fonctionnelles et donc l'identité des types cellulaires au sein des clusters.

Le profilage du transcriptome à cellule unique révèle l'hétérogénéité des neutrophiles dans l'homéostasie et l'infection.

Journal : Revue internationale des sciences moléculaires

Facteur d'impact : 31,250

Publié : 27 juillet 2020

Contexte

Les neutrophiles sont des cellules immunitaires diversifiées qui migrent vers les tissus infectés, répondant à l'inflammation en englobant et en détruisant les pathogènes. Ils présentent une hétérogénéité due à la différenciation, aux influences microenvironnementales et au vieillissement rapide, ce qui influence leur fonction et leur classification. Le séquençage d'ARN à cellule unique révèle leurs profils transcriptionnels variés, offrant des aperçus sur les sous-populations de neutrophiles dans différents états physiologiques et d'infection.

Matériaux et Méthodes

Résultats

Dans cette étude, les neutrophiles de souris provenant de la moelle osseuse, du sang périphérique et de la rate ont été analysés à l'aide de la cytométrie en flux (FACS). Des données contrôlées en qualité provenant de 19 582 cellules ont identifié sept principales populations cellulaires et huit clusters de neutrophiles en différenciation et matures. L'analyse de l'expression génique a mis en évidence 2 922 gènes exprimés de manière différentielle et 24 gènes signatures, soulignant les gènes liés au cycle cellulaire dans les phases précoces de maturation des neutrophiles.

Figure 1. Analyse de l'ARN-seq à cellule unique des neutrophiles de la moelle osseuse (BM), du sang périphérique (PB) et de la rate (SP) en état d'équilibre.

Cette étude examine l'hétérogénéité des granules des neutrophiles et confirme l'hypothèse du timing de biosynthèse pour certaines protéines, mais identifie des incohérences, suggérant des mécanismes de tri alternatifs. La comparaison avec les classifications basées sur la morphologie aligne les signatures moléculaires, validant le scRNA-seq aux côtés du RNA-seq en vrac pour comprendre les stades de maturation des neutrophiles.

Figure 2. (a-f) Paysage transcriptionnel des neutrophiles le long des trajectoires de différenciation et de maturation.

Cette étude a lié les populations de neutrophiles de la moelle osseuse (BM) définies par scRNA-seq (G0-G4) avec des sous-populations basées sur la morphologie. Les marqueurs CXCR2 et IFIT1 ont distingué les sous-populations G3/G4 et G5 dans la moelle osseuse et le sang périphérique (PB), respectivement, confirmant les identités par l'expression des gènes signatures. L'analyse FACS a validé les résultats de scRNA-seq concernant les proportions des sous-populations de neutrophiles.

Figure 3. Analyse des sous-populations de neutrophiles par cytométrie en flux.

L'infection bactérienne modifie les populations de neutrophiles dans la moelle osseuse (MO). Elle augmente la prolifération des cellules en phase G1 et stabilise les cellules en phase G2. Les cellules en phase G3 se différencient principalement en cellules en phase G4, avec une diminution des cellules G4 dans la MO mais une augmentation dans le sang périphérique (SP) et la rate (S). Les transitions entre G5a, G5b et G5c sont supprimées pendant l'infection, réduisant particulièrement les populations de G5c. L'analyse de la vélocité met en évidence des dynamiques altérées parmi les sous-populations de neutrophiles dans la MO, le SP et la S pendant l'infection.

Figure 4. L'infection bactérienne reprogramme la structure de la population de neutrophiles et la transition dynamique entre chaque sous-population.

Conclusion

Cette étude utilise le profilage du transcriptome à cellule unique pour délimiter l'hétérogénéité et la maturation des neutrophiles dans des conditions de repos et d'infection bactérienne. Elle corrèle les populations de neutrophiles définies par scRNA-seq avec des sous-populations de moelle osseuse identifiées traditionnellement sur la base de la morphologie, tout en mettant en évidence des profils transcriptionnels distincts des neutrophiles matures dans le sang périphérique.

Référence

1. Xie X, Shi Q, Wu P, et al. Le profilage du transcriptome à cellule unique révèle l'hétérogénéité des neutrophiles dans l'homéostasie et l'infection. Immunologie de la nature2020, 21(9) : 1119-33.