Directives de Soumission d'Échantillons
CD Genomics propose des services de recherche sur le transcriptome robustes, allant jusqu'à des niveaux d'entrée de cellules uniques dans des échantillons de haute qualité. Ces modèles d'expression génique globaux dans des cellules uniques ont déjà considérablement fait progresser la biologie cellulaire.
L'introduction du scRNA-seq
Les cellules sont l'unité de base de la vie et chaque cellule est unique. La capacité de révéler des événements cellulaires complexes dans les systèmes biologiques est essentielle pour mieux comprendre les contributions cellulaires durant le développement ou la progression des maladies. La recherche sur l'expression génique à la résolution unicellulaire sur des échantillons composés de populations cellulaires mixtes permet d'obtenir un aperçu approfondi de la complexité du transcriptome de divers types cellulaires.
Le séquençage d'ARN à cellule unique (scRNA-seq) est un séquençage à haut débit technologie conçue pour explorer l'expression génique au niveau de la cellule individuelle. L'avènement de cette technologie a permis aux chercheurs d'explorer les profils d'expression génique des cellules uniques, révélant ainsi l'hétérogénéité et les différences fonctionnelles entre les cellules. En utilisant le scRNA-seq, les scientifiques peuvent obtenir des profils d'expression génique complets des cellules individuelles, ce qui facilite la révélation de l'hétérogénéité cellulaire, des trajectoires de développement et la classification des types cellulaires.
CD Genomics propose des outils de préparation de bibliothèques et de séquençage de premier ordre à partir d'une seule cellule, de quelques cellules et d'entrées d'ARN ultra-basses. En combinant la technologie robuste de synthèse d'ADNc avec le séquençage de nouvelle génération Illumina et les technologies d'analyse, nous offrons des données fiables de la plus haute qualité pour étudier l'hétérogénéité du transcriptome cellule par cellule.
Avantages de la scRNA-seq
- Haute SensibilitéLe séquençage d'ARN à cellule unique (scRNA-seq) excelle dans la détection des expressions géniques à faible abondance, permettant l'identification de gènes et de transcrits rares qui pourraient être manqués par des méthodes traditionnelles.
- Haute résolutionCette technologie de pointe permet une mesure précise de l'expression génique au sein de cellules individuelles, éclairant les différences subtiles et les processus de différenciation complexes qui les caractérisent.
- Haut débitLa scRNA-seq peut évaluer simultanément les niveaux d'expression de nombreux gènes, offrant ainsi une vue d'ensemble et détaillée des schémas d'expression génique cellulaire.
- Compréhension approfondie des caractéristiques cellulairesGrâce à l'analyse détaillée de l'expression génique à l'échelle unicellulaire, les chercheurs peuvent acquérir une compréhension plus profonde et plus nuancée des fonctions cellulaires et des caractéristiques intrinsèques.
- Découverte de nouveaux types de cellules et de marqueurs de maladiesLa scRNA-seq aide à la découverte de types de cellules précédemment non identifiés et de nouveaux marqueurs de maladies, contribuant aux avancées dans le diagnostic des maladies et le développement de thérapies ciblées.
- Large éventail d'applicationsCette technologie polyvalente est applicable à un large éventail d'échantillons, y compris les tissus, les organes, les embryons et les tumeurs, et joue un rôle essentiel dans l'avancement de la recherche dans des domaines tels que la médecine, l'écologie et les sciences de l'environnement.
Applications du scRNA-seq
Recherche sur les tumeurs
- Révéler l'hétérogénéité des cellules tumorales
- Surveillance de la progression tumorale
- Analyse des cellules immunitaires
- Mécanismes d'évasion immunitaire et de résistance aux médicaments
Différenciation des cellules souches
- Suivi des changements d'expression génique
- Gènes et voies régulatrices clés
Neurobiologie
- Étudier les cellules neuronales et gliales
- Explorer la dynamique de l'expression génique dans le développement neural
- Investigation des bases moléculaires des maladies neurologiques
Biologie du développement
- Détermination de la destinée cellulaire et formation des tissus
- Comprendre les troubles du développement et les maladies génétiques
Régulation immunitaire
- Analyse de l'expression génique dans les cellules immunitaires
- Réponses immunitaires dans les infections, l'inflammation et les maladies auto-immunes
Flux de travail scRNA-seq
L'avènement des technologies de tri/partitionnement des cellules, telles que la cytométrie en flux et la microfluidique, a rendu possible la capture de cellules uniques, et l'ADN ou l'ARN de cellules uniques est amplifié pour le séquençage à cellule unique. Le flux de travail général pour le séquençage de l'ARN à cellule unique est décrit ci-dessous.
Description des techniques
Flux de travail mRNA à cellule unique Fluidigm C1Avec le système Fluidigm C1, nous proposons un service de profilage du transcriptome à cellule unique à une échelle optionnelle. Le C1 peut capturer et traiter rapidement et de manière fiable des cellules individuelles. Les étapes du flux de travail Integrated C1 Single-Cell mRNA Seq incluent des circuits fluidiques (IFCs) pour capturer les cellules, convertir l'ARN polyA+ en cDNA complet, et effectuer une amplification universelle du cDNA. Avec les circuits microfluidiques personnalisables, le C1 permet une transition fluide de l'identification des populations cellulaires critiques à la génération de bibliothèques de séquençage pour le comptage des extrémités 3′ des transcrits, le séquençage d'ARNm complet, le séquençage d'ADN, l'analyse épigénétique, le profilage de l'expression des micro-ARN et plus encore.
SMART-seq Ultra Low Input ARN pour le séquençageLa technologie SMART fournit des informations sur les transcrits en pleine longueur, permettant l'analyse des isoformes de transcrits, des fusions de gènes, des mutations ponctuelles, etc. Le kit utilisant cette technologie permet aux utilisateurs de réaliser une synthèse d'ADNc directement à partir de 1 à 1 000 cellules intactes ou d'ARN total à très faible apport, avec une grande reproductibilité et une représentation précise des transcrits riches en GC. Les bibliothèques d'ADNc en pleine longueur produites avec ce kit sont compatibles avec les plateformes Illumina.
Spécifications du service
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Exigences d'échantillon
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Stratégie de séquençage
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Analyse bioinformatique
Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées :
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Pipeline d'analyse
Livrables
- Les données de séquençage originales
- Résultats expérimentaux
- Rapport d'analyse de données
- Détails sur le séquençage d'ARN à cellule unique pour votre rédaction (personnalisation)
La conférence sur le séquençage unicellulaire de CD Genomics se concentre sur les liens entre la variation cellulaire dans les tissus et la fonction des organes, et éclaire davantage les origines des maladies. Si vous avez des exigences supplémentaires ou des questions, n'hésitez pas à nous contacter.
Références
- Wu, AR et al.Évaluation quantitative des méthodes de séquençage d'ARN à cellule unique. Méthodes de la nature. Janvier 2014 ; 11(1) : 41–46.
- Picelli, S et al.Séquençage RNA complet à partir de cellules uniques en utilisant Smart-seq2.Protocoles de la Nature. Jan 2014;9(1):171-81.
Résultats de la démo
Les résultats partiels sont affichés ci-dessous :
FAQ sur le scRNA-seq
1. Quel est l'objectif du séquençage de l'ARN à cellule unique ?
Le but du séquençage d'ARN à cellule unique (scRNA-seq) est d'explorer le monde complexe des profils d'expression génique des cellules individuelles. Contrairement au séquençage d'ARN en vrac traditionnel qui moyenne les signaux provenant d'un mélange de cellules, le scRNA-seq permet aux chercheurs de disséquer la composition génétique unique de chaque cellule. Cette technologie est essentielle pour découvrir l'hétérogénéité cellulaire, identifier des types de cellules rares, suivre les processus de développement à un niveau granulaire et élucider comment les cellules réagissent différemment dans divers contextes biologiques, y compris les maladies.
2. Quelle est la différence entre RNA-Seq et scRNA-seq ?
Traditionnel Séquençage de l'ARN (RNA-Seq) cela nécessite généralement un grand nombre de cellules en entrée, ce qui entraîne un profil d'expression moyen d'une population cellulaire mixte. Cette approche néglige les différences entre les cellules individuelles. En revanche, le séquençage d'ARN à cellule unique (scRNA-seq) analyse l'expression génique au niveau des cellules individuelles. Cela est réalisé en amorçant et en amplifiant aléatoirement les transcrits d'ARN de chaque cellule, suivi par séquençage à haut débitPar conséquent, le scRNA-seq permet l'examen détaillé de l'expression génique dans chaque cellule individuelle, révélant ainsi l'hétérogénéité cellulaire que le RNA-Seq traditionnel ne peut pas.
3. Quelle est l'utilité de l'analyse du pseudotemps ?
Dans de nombreux processus biologiques, les cellules ne sont pas toutes synchronisées au même stade temporel. Lors de l'étude de la différenciation cellulaire à l'aide de l'expression génique à cellule unique, les cellules capturées couvrent souvent une large gamme de stades différents : certaines cellules n'ont pas encore commencé la différenciation, d'autres sont dans des états intermédiaires, et d'autres encore peuvent avoir terminé la différenciation. En conséquence, les profils d'expression génique parmi les cellules d'un échantillon peuvent présenter une variabilité considérable, rendant l'analyse assez complexe. L'analyse de pseudotemps utilise les données d'expression génique pour estimer la distance temporelle entre les cellules. En calculant cette distance, elle peut organiser les cellules le long d'une trajectoire de développement inférée, représentant le chemin le plus court à travers toutes les cellules dans leur progression de pseudotemps. Cette méthode aide à comprendre les types de cellules présentes dans l'échantillon et le processus global de différenciation cellulaire.
4. Comment déterminer les types de cellules spécifiques dans un groupe ?
(1) Utilisation de gènes marqueurs connus
a. Basé sur des gènes marqueurs établisD'après des recherches antérieures et la littérature, certains types de cellules sont connus pour exprimer spécifiquement certains gènes marqueurs, tels que CD3/CD4 dans les cellules T ou CD19/CD20 dans les cellules B.
b. Identification de l'expression des gènes marqueurs au sein des clustersEn utilisant des outils comme Loupe Cell Browser ou d'autres logiciels, les chercheurs peuvent étiqueter les cellules exprimant des gènes marqueurs spécifiques pour déduire quel cluster correspond à un type cellulaire particulier.
c. Utilisation de gènes différentiellement exprimés ou de gènes marqueurs identifiés par des logicielsDes logiciels comme Cell Ranger et monocle2 (ou d'autres outils d'analyse unicellulaire) fournissent des résultats sur les gènes exprimés de manière différentielle au sein des clusters. S'il existe des gènes marqueurs connus pour un type cellulaire, ils peuvent être recherchés dans la liste des gènes exprimés de manière différentielle pour inférer si un cluster représente ce type cellulaire.
(2) Détermination basée sur les voies fonctionnelles
a. Lorsque les gènes marqueurs spécifiques sont inconnusSi des gènes marqueurs spécifiques ne sont pas clairs ou ne peuvent pas être trouvés dans certains clusters, les chercheurs peuvent inférer les fonctions cellulaires en se basant sur les voies dans lesquelles les gènes différemment exprimés ou co-exprimés sont impliqués, en utilisant les analyses de voies KEGG et GO. Cette approche aide à déduire les caractéristiques fonctionnelles et donc l'identité des types cellulaires au sein des clusters.
Études de cas scRNA-seq
Le profilage du transcriptome unicellulaire révèle l'hétérogénéité des neutrophiles dans l'homéostasie et l'infection.
Journal : Revue internationale des sciences moléculaires
Facteur d'impact : 31,250
Publié : 27 juillet 2020
Contexte
Les neutrophiles sont des cellules immunitaires diverses qui migrent vers les tissus infectés, réagissant à l'inflammation en englobant et en détruisant les pathogènes. Ils présentent une hétérogénéité due à la différenciation, aux influences microenvironnementales et au vieillissement rapide, ce qui influence leur fonction et leur classification. Le séquençage de l'ARN à cellule unique révèle leurs profils transcriptionnels variés, offrant des perspectives sur les sous-populations de neutrophiles dans différents états physiologiques et d'infection.
Matériaux et Méthodes
Préparation des échantillons
- Souches de souris
- Isolation des neutrophiles de souris
- Collecte d'échantillons humains
- Sang périphérique
- Collecte de cellules uniques
- Extraction totale d'ARN
Séquençage
- Construction de bibliothèque
- Illumina NovaSeq6000
- RNA-seq
- scARN-seq
- Correction par lots
- Réduction de dimension
- Clustering et annotation non supervisés
- Identification des gènes exprimés différemment
- Analyse de l'activité différentielle
- Analyse de la vélocité de l'ARN
Résultats
Dans cette étude, des neutrophiles de souris provenant de la moelle osseuse, du sang périphérique et de la rate ont été analysés par FACS. Des données contrôlées de qualité provenant de 19 582 cellules ont identifié sept populations cellulaires principales et huit clusters de neutrophiles en différenciation et matures. L'analyse de l'expression génique a mis en évidence 2 922 gènes exprimés de manière différentielle et 24 gènes signatures, soulignant les gènes liés au cycle cellulaire dans les phases précoces de maturation des neutrophiles.
Figure 1. Analyse de l'ARN-seq à cellule unique des neutrophiles de la moelle osseuse (BM), du sang périphérique (PB) et de la rate (SP) en état d'équilibre.
Cette étude examine l'hétérogénéité des granules des neutrophiles et confirme l'hypothèse du timing de biosynthèse pour certaines protéines, mais identifie des incohérences, suggérant des mécanismes de tri alternatifs. La comparaison avec des classifications basées sur la morphologie aligne les signatures moléculaires, validant le séquençage d'ARN unicellulaire (scRNA-seq) en parallèle avec le séquençage d'ARN en vrac (bulk RNA-seq) pour comprendre les stades de maturation des neutrophiles.
Figure 2. (a-f) Paysage transcriptionnel des neutrophiles le long des trajectoires de différenciation et de maturation.
Cette étude a lié les populations de neutrophiles de la moelle osseuse (BM) définies par scRNA-seq (G0-G4) avec des sous-populations basées sur la morphologie. Les marqueurs CXCR2 et IFIT1 ont distingué les sous-populations G3/G4 et G5 dans la moelle osseuse et le sang périphérique (PB), respectivement, confirmant les identités par l'expression des gènes signatures. L'analyse FACS a validé les résultats de scRNA-seq concernant les proportions des sous-populations de neutrophiles.
Figure 3. Analyse des sous-populations de neutrophiles par cytométrie en flux.
L'infection bactérienne modifie les populations de neutrophiles dans la moelle osseuse (BM). Elle augmente la prolifération cellulaire en phase G1 et stabilise les cellules en phase G2. Les cellules G3 se différencient principalement en cellules G4, avec une diminution des cellules G4 dans la moelle osseuse mais une augmentation dans le sang périphérique (PB) et la rate (SP). Les transitions entre G5a, G5b et G5c sont supprimées pendant l'infection, réduisant particulièrement les populations de G5c. L'analyse de la vélocité met en évidence des dynamiques altérées parmi les sous-populations de neutrophiles à travers la moelle osseuse, le sang périphérique et la rate pendant l'infection.
Figure 4. L'infection bactérienne reprogramme la structure de la population de neutrophiles et la transition dynamique entre chaque sous-population.
Conclusion
Cette étude utilise le profilage du transcriptome à cellule unique pour décrire l'hétérogénéité et la maturation des neutrophiles dans des conditions de l'état stable et d'infection bactérienne. Elle corrèle les populations de neutrophiles définies par scRNA-seq avec des sous-populations de moelle osseuse identifiées précédemment sur la base de la morphologie traditionnelle, tout en mettant en évidence des profils transcriptionnels distincts des neutrophiles matures dans le sang périphérique.
Référence
- Xie X, Shi Q, Wu P, et al. Le profilage du transcriptome à cellule unique révèle l'hétérogénéité des neutrophiles dans l'homéostasie et l'infection. Immunologie de la nature. 2020, 21(9):1119-33.
