RNA-Seq à entrée ultra-basse (SMART-seq)

L'introduction du séquençage RNA ultra-bas.

Nous proposons un service de séquençage d'ARN à ultra faible entrée qui permet l'étude d'échantillons avec un nombre limité de cellules ou avec une quantité d'ARN d'entrée ultra faible. Le séquençage d'ARN à ultra faible entrée permet aux chercheurs d'explorer la véritable diversité de l'expression génique au sein de petites populations cellulaires dans des tissus complexes et de comprendre les réponses des sous-populations cellulaires aux signaux environnementaux. Il fournit un nouvel outil puissant pour l'analyse d'échantillons exceptionnellement rares ou précieux, y compris les cellules souches, les cellules tumorales circulantes et les biopsies de tissu cérébral.

CD Genomics utilise la technologie éprouvée de l'industrie pour générer des cDNA de haute qualité avec des niveaux d'ARN ultra-bas, combinée à un séquençage Illumina, afin de fournir un nouvel outil puissant pour l'analyse de ces échantillons extrêmement limités. Nous proposons plusieurs services différents pour obtenir un portrait précis des niveaux d'expression des ARN codants et non codants à partir de petites quantités d'échantillons.

À partir de quantités de picogrammes d'ARN ou de quelques centaines de cellules, la technologie actuelle offre une sensibilité sans précédent et une amplification non biaisée des transcrits d'ADNc, enrichissant pour transcriptions complètes et maintient la véritable représentation de l'original transcrits d'ARNm.

Alors que NGS La technologie a grandement contribué à notre compréhension de l'ARNm cellulaire, elle a également révélé l'existence d'un vaste assortiment d'ARN non codants qui jouent des rôles divers dans des processus tels que la régulation de l'expression génique. Le séquençage d'ARN total à ultra faible entrée permet de fournir des données incluant à la fois l'ARNm et l'ARNlnc, permettant l'analyse de cette importante classe d'ARN régulateurs.

Nous proposons également un service de petits ARN à ultra faible entrée, qui fonctionne directement avec de l'ARN total ou enrichi. petit ARN des intrants allant de quantités de nanogrammes d'ARN. Cela permet aux chercheurs d'analyser une large gamme d'espèces de smRNA et de générer des bibliothèques de séquençage d'une complexité considérable à partir de seulement 1 ng de matériel d'entrée, garantissant que diverses espèces de smRNA sont représentées avec un biais minimal.

Avantages et caractéristiques du séquençage d'ARN ultra-faible

• Exemple de solution de données avec la meilleure qualité de données et un coût réduit.
• Quantification précise des gènes et sensibilité inégalée pour des entrées d'ARN ultra-basses.
• Analyse puissante des niveaux d'expression génique et des isoformes alternativement épissées, caractérisation des petits ARN et découverte de gènes.
• La méthode de séquençage RNA à ultra faible entrée vise à minimiser les biais d'amplification tout en préservant la représentation des espèces d'ARN présentes dans l'échantillon original. En optimisant les étapes de la transcription inverse et de l'amplification par PCR, les artefacts artificiels sont minimisés, garantissant une compréhension complète du transcriptome.

Flux de travail de séquençage RNA ultra-basse.

Nos services complets de séquençage d'ARN ultra bas offrent le Séquençage de l'ARN flux de travail de la préparation des échantillons à l'analyse des données, permettant un profilage rapide et une compréhension approfondie de l'ARN.

Spécification de service

	Exigences d'échantillon ARN total ≥ 20 ng, Quantité minimum : 20 pg, Concentration ≥ 1 pg/µL OD A260/A280 ratio ≥ 1,8, A260/230 ratio ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Tous les échantillons d'ARN total doivent être exempts d'ADN. L'ARN doit être conservé dans de l'eau sans nucléase ou dans RNA Stable. Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégies de séquençage llumina NovaSeq 6000 PE 50/75/100/150 Score de qualité Q30 de≥80% 20 millions de lectures
	Analyse de données Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Analyse différentielle de l'expression génique Analyse de la structure de l'ARN Prédiction des gènes cibles et analyse fonctionnelle Détection de transcrits et de mutations nouveaux et rares Prédiction de transcript de roman Graphique PCA, carte thermique, analyse des voies Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage RNA à ultra faible pour votre rédaction (personnalisation)

En s'appuyant sur notre équipe d'experts chevronnés et notre technologie de pointe, CD Genomics propose un service de séquençage d'ARN ultra faible. Notre plateforme fournit des données de séquence d'ARN à haute résolution grâce à un contrôle qualité rigoureux et à des analyses bioinformatiques avancées, garantissant une précision et une sensibilité inégalées.

Les résultats partiels sont affichés ci-dessous :

Distribution de la qualité de séquençage

Distribution A/T/G/C

Interface du navigateur IGV

Analyse de corrélation entre les échantillons

Graphique des scores PCA

Diagramme de Venn

Diagramme de volcan

Résultats statistiques de l'annotation GO

Classification KEGG

1. Qu'est-ce que le séquençage d'ARN ultra faible ?

Le séquençage RNA ultra faible (ULRS) représente une technologie de pointe conçue pour produire des données de séquençage hautement précises à partir de quantités minimes d'échantillons d'ARN. Cette méthode est stratégiquement positionnée pour répondre à des questions biologiques complexes, telles que le séquençage d'ARN à cellule unique (scRNA-seq), l'analyse de populations cellulaires rares et le profilage de l'ARN extrait d'échantillons cliniques.

2. Quelles sont les applications du séquençage RNA à très faible entrée ?

Le séquençage d'ARN à faible entrée ultra (ULRS) est essentiel dans plusieurs domaines : il permet au séquençage d'ARN unicellulaire (scRNA-seq) d'explorer les transcriptomes cellulaires, d'identifier des types cellulaires rares et d'extraire de l'ARN à partir d'échantillons cliniques pour des insights diagnostiques. En biologie du développement et en recherche sur les cellules souches, l'ULRS élucide les dynamiques d'expression génique, offrant un profilage ARN nuancé dans divers contextes biologiques, faisant ainsi progresser la compréhension scientifique.

3. Quelles sont les exigences pour les échantillons dans le séquençage d'ARN à ultra basse température ?

Dans le séquençage RNA ultra faible (ULRS), l'intégrité des échantillons est un facteur critique pour éviter la détérioration de l'ARN, nécessitant des intrants d'ARN de haute qualité. La sensibilité de la méthode aux quantités infimes d'ARN souligne la compatibilité des échantillons allant de picogrammes à nanogrammes. Le maintien de la pureté des échantillons constitue une protection essentielle contre les contaminants qui pourraient fausser les résultats de séquençage.

4. Quelles doivent être les considérations lors de l'analyse des données pour le séquençage d'ARN ultra faible ?

Lors de l'analyse des données en séquençage RNA à ultra faible, un prétraitement minutieux des données devient impératif pour valider la qualité et minimiser le bruit, afin d'augmenter la précision des analyses ultérieures. L'évaluation des niveaux d'expression génique se concentre sur une quantification précise, tandis qu'une plongée approfondie dans l'annotation fonctionnelle aide à déchiffrer la signification biologique des gènes exprimés de manière différentielle. L'analyse d'intégration renforce encore les perspectives en amalgamant Séquençage de l'ARN des données avec d'autres ensembles de données omiques, fournissant ainsi une compréhension complète des mécanismes biologiques.

Évaluation du séquençage d'ARN à ultra-faible entrée pour l'étude du transcriptome des cellules T humaines

Journal : Scientific Reports
Facteur d'impact : 4,996
Publié : 11 juin 2019

Résumé

Comprendre la biologie des cellules T est essentiel pour le développement thérapeutique. Cette étude a évalué des méthodes de séquençage d'ARN à ultra faible entrée, constatant qu'AmpliSeq détectait de manière constante des gènes codants même à faibles entrées, tandis que SMART détectait des gènes non codants mais montrait une variabilité à des entrées très faibles. Toutes les méthodes ont identifié des signatures d'activation des cellules T à 1 000 cellules, AmpliSeq étant plus performant à 100 cellules.

Matériaux et Méthodes

Résultats

Les auteurs ont évalué trois kits d'extraction d'ARN (PicoPure, Zymogen, Qiagen RNeasy micro kit) sur des cellules T CD4 naïves humaines primaires (5K, 1K, 100 cellules). Le kit Qiagen RNeasy micro a fourni la meilleure cohérence, en particulier à 100 cellules, et a été choisi pour des études ultérieures. Les cellules T traitées avec α-CD3 ou α-CD3 et B7-1 Fc ont été utilisées pour la préparation de bibliothèques d'ARN avec les technologies SMART-Seq (Nextera : SMART_Nxt, Clontech : SMART_CC) et AmpliSeq. AmpliSeq a montré des taux d'alignement plus élevés (81-92 %) que SMART-Seq (59-74 %), avec une détection stable des gènes à travers différents intrants. SMART-Seq a détecté moins de gènes avec des intrants décroissants et pouvait détecter des gènes non codants, ce qu'AmpliSeq ne peut pas évaluer.

L'analyse de l'expression génique différentielle dans le RNA-seq fournit des informations cruciales sur les processus biologiques. En utilisant 100 000 échantillons de cellules comme référence, SMART_Nxt, SMART_CC et AmpliSeq ont identifié respectivement 7762, 7923 et 6662 gènes exprimés de manière différentielle (DEGs) entre les traitements α-CD3 + B7-1 Fc et α-CD3 (FDR < 0,05). 4261 DEGs étaient communs à toutes les plateformes, montrant des changements de pli cohérents (R2 = 0,94 pour SMART_Nxt/SMART_CC, R2 = 0,84 pour AmpliSeq/SMART_CC, R2 = 0,85 pour SMART_Nxt/AmpliSeq). Les DEGs spécifiques à chaque plateforme ont présenté des motifs d'expression distincts et une variabilité entre les répliques techniques.

Fig 1. Trois plateformes différentes ont détecté des gènes exprimés différemment de manière commune ; cependant, une détection spécifique à chaque plateforme a également été observée.

Les auteurs ont évalué la détection des DEG à travers différents apports cellulaires, constatant qu'AmpliSeq identifiait systématiquement plus de DEG que SMART_Nxt et SMART_CC à des apports cellulaires plus faibles, avec un nombre décroissant de DEG corrélant avec des quantités d'apport réduites. Par exemple, AmpliSeq a détecté 6662 DEG à 100 K cellules, 3382 à 5 K, 844 à 1 K, et 90 à 100 cellules, montrant une chute significative du nombre de DEG à mesure que l'apport cellulaire diminuait. AmpliSeq a également démontré une sensibilité plus élevée dans la détection de DEG significatifs à des apports plus faibles par rapport à SMART_Nxt et SMART_CC. De plus, GSEA a révélé un enrichissement des voies liées à l'activation des cellules T dans des échantillons traités avec α-CD3 + B7-1 Fc, mettant en évidence les processus biologiques impactés par l'activation cellulaire.

Fig 2. Le nombre de gènes exprimés différemment a diminué avec une réduction de l'apport, la précision de détection est restée robuste et AmpliSeq a démontré une plus grande sensibilité.

Dans cette étude, les auteurs ont comparé 15 gènes impliqués dans l'activation des cellules T à travers différentes technologies. À des entrées plus élevées (100 K, 5 K, 1 K), toutes les technologies ont montré des performances similaires dans la détection des changements d'expression génique. À une entrée de 100 cellules, AmpliSeq a identifié une régulation significative à la hausse de 7 gènes (CD200, CD69, EGR1, FASLG, IL2, MYC, TNF), tandis que SMART_Nxt et SMART_CC ont détecté moins de gènes (1 chacun). Notamment, TNFSF14 n'a été détecté que par SMART_Nxt et SMART_CC, même à des entrées plus élevées. La qRT-PCR a confirmé l'expression différentielle pour 12 des 16 gènes, soulignant des problèmes de détection de l'IL-21, probablement dus à des limitations des amorces.

Fig 3. La détection des marqueurs d'activation des cellules T bien connus a été réalisée à partir d'un apport de 1 K cellules et plus, et AmpliSeq a détecté un pourcentage plus élevé de ces gènes à un apport de 100 cellules.

Conclusion

Dans cette étude, les technologies RNA-seq (SMART_Nxt, SMART_CC et AmpliSeq) ont été évaluées pour étudier les changements d'expression génique dans les cellules T lors de l'activation. AmpliSeq a montré une performance supérieure dans la détection des gènes de manière cohérente à travers différents niveaux d'entrée, maintenant la sensibilité pour les gènes à faible expression. Cependant, SMART_Nxt et SMART_CC ont démontré une plus grande concordance entre elles dans la détection de gènes spécifiques, probablement en raison de leur technologie SMART partagée. À des niveaux d'entrée extrêmement bas (100 cellules), AmpliSeq a présenté une meilleure sensibilité pour détecter les changements d'expression génique biologiquement pertinents par rapport aux technologies SMART.

Référence :

1. Wang, J., Rieder, S.A., Wu, J. et al. Évaluation du séquençage d'ARN à ultra-faible entrée pour l'étude du transcriptome des cellules T humaines. Sci Rep, 2019, 9, 8445.