Développement de microsatellites

CD Genomics propose désormais un séquençage de nouvelle génération méthode basée pour développer des marqueurs de microsatellite pour votre espèce d'intérêt, au bénéfice de la communauté scientifique.

L'introduction du développement des microsatellites

Les microsatellites, également appelés SSR, se composent d'un motif répété de un à six nucléotides, et ils sont omniprésents dans la plupart des génomes eucaryotes. Les variations dans le nombre de répétitions génèrent différents allèles. Les SSR présentent un fort polymorphisme, une spécificité génomique, une abondance et une codominance. Cela en fait des marqueurs moléculaires appropriés pour la sélection assistée par marqueurs, la phylogénétique moléculaire et la génétique des populations.

Séquençage de nouvelle génération (NGS) est récemment utilisé pour développer des marqueurs de microsatellites. Les méthodes traditionnelles dépendant du séquençage capillaire sont longues et complexes. Par rapport aux méthodes traditionnelles, NGS présente les avantages d'un haut débit, augmentant massivement la production et à faible coût. Il peut analyser de manière suffisante même des organismes non-modèles. Nous avons utilisé la technologie NGS Illumina pour produire des millions de lectures de courts fragments, qui ont été filtrées avec des ensembles d'outils bioinformatiques pour identifier des amorces qui amplifient des loci microsatellites polymorphes.

Le flux de travail général pour le développement de microsatellites est décrit ci-dessous.

• Préparation de bibliothèque d'ADN et séquençage shotgun avec la plateforme Illumina.
• Analyse des résultats de séquençage avec des outils de bioinformatique et identification de loci microsatellites potentiels pour le développement de primers.
• Synthèse des amorces et sélection des loci microsatellites par des tests sur plusieurs individus pour évaluer l'amplification et le polymorphisme.
• Analyse des individus que vous aimeriez que nous génotypions uniquement avec les paires d'amorces sélectionnées qui ont amplifié des loci polymorphes.

Nous allons analyser au moins 8 échantillons sur jusqu'à 60 loci, tenterons d'optimiser la PCR pour tous les loci, et enfin nous ferons de notre mieux pour identifier 10 loci polymorphes, mais nous ne pouvons pas garantir cela car certaines populations n'ont pas de niveau de polymorphisme 'normal'.

Avantages du développement des microsatellites

L'application de Séquençage à haut débit (HTS) le développement de microsatellites augmente considérablement son efficacité et sa précision, offrant plusieurs avantages notables par rapport aux méthodes traditionnelles :

• Acquisition massive de données : le HTS peut générer un volume considérable de données de séquence génomique en peu de temps, réduisant ainsi de manière significative le délai de développement des microsatellites.
• Automatisation : De la séquence à l'analyse des données, un grand nombre de processus peuvent être automatisés, réduisant ainsi le besoin d'intervention manuelle.
• Couverture complète : Avec le potentiel de couvrir la majeure partie du génome, y compris les régions non codantes et de faible complexité, HTS augmente la portée de l'identification des microsatellites.
• Haute résolution : HTS améliore la précision dans l'identification des unités répétées et des quantités de microsatellites, réduisant ainsi les risques de mauvaise identification.
• Coûts réduits par instance unique : Malgré des coûts d'équipement initiaux plus élevés, les avancées progressives de la technologie ont continuellement réduit les coûts de séquençage par instance, rendant le développement de microsatellites à grande échelle plus économique.
• Le traitement parallèle : HTS permet le traitement simultané de plusieurs échantillons, réduisant ainsi les coûts par unité d'échantillon.
• Possibilité d'analyse multi-couches : HTS offre non seulement des informations sur les microsatellites, mais peut également être utilisée pour d'autres analyses génomiques (comme la détection de SNP, l'analyse de l'expression génique, etc.), fournissant un soutien de données pour des recherches complètes.
• Découverte de nouveaux microsatellites : Comparé aux méthodes traditionnelles, le HTS peut identifier davantage de nouveaux marqueurs de microsatellites, élargissant ainsi la bibliothèque de marqueurs de microsatellites.

Application du développement des microsatellites

Étudier la diversité génétique et la structure des populations : En tirant parti séquençage à haut débit Pour l'identification et le développement de nombreux marqueurs microsatellites, il est possible de réaliser des analyses complètes examinant la structure génétique des populations, le flux génétique et la variation génétique. Ce processus peut fournir des informations cruciales sur la dynamique des populations ainsi que sur les processus évolutifs.

Cartographie des séquences génomiques et localisation des loci de traits quantitatifs (QTL) : Les marqueurs microsatellites jouent un rôle essentiel dans la construction de cartes de liaison génétique ainsi que dans la localisation des loci de traits quantitatifs (QTL). La précision et la densité des marqueurs, renforcées par le séquençage à haut débit, ont élevé le niveau en termes de résolution réalisable dans la cartographie génomique.

Identification des espèces et classification taxonomique : Les marqueurs microsatellites développés grâce à la technologie de haute capacité peuvent être utilisés efficacement dans les efforts liés à l'identification des espèces et à la recherche taxonomique. Ils aident à reconnaître les différences génétiques entre des espèces ou des populations distinctes, soutenant ainsi les efforts de conservation et de gestion de la biodiversité.

Recherche en biologie évolutive : marqueurs microsatellites, obtenables par séquençage à haut débit, peuvent être instrumentaux dans la conduite d'études évolutives à travers diverses espèces ou groupes de population. Ils peuvent révéler l'histoire évolutive et les relations phylogénétiques des sujets d'étude, enrichissant ainsi notre compréhension des mécanismes derrière l'évolution biologique.

Applications agricoles et de reproduction : Dans les domaines de l'agriculture et de la reproduction, des marqueurs de microsatellites développés à l'aide de séquençage à haut débit peut être utilisé pour la confirmation de l'identité des races, la sélection dans les programmes d'élevage et la mise en œuvre d'améliorations génétiques tant chez les espèces végétales qu'animales. Cela améliore l'efficacité et la précision des efforts agricoles et d'élevage.

Flux de travail de développement de microsatellites

L'implémentation de Séquençage de nouvelle génération (NGS) la technologie dans la culture des microsatellites a considérablement renforcé leur efficacité, leur précision et leur rentabilité. Grâce à une progression systématique qui englobe la préparation des échantillons, Séquençage de l'ADN, le traitement des données, l'identification des microsatellites, la conception des amorces, la validation des amorces et le test du polymorphisme, nous pouvons rapidement et efficacement favoriser le développement de marqueurs de microsatellites.

Spécification de service

	Exigences d'échantillon Échantillon d'ADN ou de tissu isolé Les échantillons de tissu peuvent être préservés en utilisant de l'éthanol, du gel de silice, la congélation ou d'autres méthodes appropriées. 1 µg d'ADN de haute masse moléculaire Veuillez soumettre toutes les données de contrôle qualité (soit une copie de l'image de l'électrophorèse sur gel, soit les mesures Qubit) pour l'échantillon.
	Stratégies de séquençage Plateforme Illumina Jusqu'à 50 millions de lectures Jusqu'à 15 Go
	Analyse de données Assemblage de novo Alignement de génome de référence Identification de microsatellites Analyse du polymorphisme Analyse génétique des populations En fonction des spécificités de votre projet, nous pourrions avoir besoin d'échantillons d'ADN supplémentaires représentant la population d'intérêt pour évaluer la polymorphie et la fonctionnalité des candidats marqueurs.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse de données

CD Genomics s'engage à vous fournir des SSR polymorphes garantis et testés, prêts à l'emploi, et nous n'avons aucun droit légal sur vos marqueurs SSR. Si vous avez des exigences supplémentaires ou des questions, n'hésitez pas à nous contacter.

Référence :

1. Feng S, He R, Lu J, et al.Développement de marqueurs SSR et évaluation de la diversité génétique des cultivars médicinaux de Chrysanthemum morifolium. Frontières en Génétique2016, 7:113.

(Feng et al.., 2016)

1. Pourquoi les microsatellites sont-ils importants dans la recherche génétique ?

Les microsatellites ont une valeur substantielle en tant que marqueurs génétiques dans une gamme d'investigations génétiques, compte tenu de leur grande variabilité, de leur héritage co-dominant et de leur présence prolifique au sein des génomes. Ils sont fréquemment utilisés dans les études de génétique des populationsbiologie évolutive, examens judiciaires, tests de paternité, et cartographie de liaison.

2. Comment les microsatellites sont-ils développés ?

La dérivation des microsatellites commence généralement par le séquençage à haut débit d'ADN génomique, progressant vers une analyse bioinformatique pour identifier les séquences répétées. Par la suite, les séquences sont examinées pour leur adéquation aux loci de microsatellites, en fonction de facteurs déterminants tels que la longueur des motifs répétés, la quantité de répétitions et les caractéristiques des régions flanquantes.

3. Quels facteurs doivent être pris en compte lors de la conception de primers pour les microsatellites ?

La conception de primers de microsatellites implique une considération scrupuleuse de plusieurs paramètres importants. Ceux-ci incluent la longueur des primers, qui se situe généralement entre 18 et 25 nucléotides, la température de fusion (Tm), la teneur en paires de Guanine-Cytosine (contenu en GC) et la spécificité envers la cible. Ensemble, ces facteurs aident à garantir l'amplification réussie du locus microsatellite cible par la réaction en chaîne par polymérase (PCR).

4. Comment les marqueurs de microsatellites sont-ils validés ?

La validation des marqueurs de microsatellites peut être réalisée par amplification PCR ciblant les loci souhaités, avec des amorces générées spécifiquement pour cette tâche. Cette étape est ensuite suivie par des analyses d'électrophorèse qui examinent et confirment les tailles attendues des amplicons. Un examen ultérieur pour le polymorphisme est effectué afin de vérifier les disparités des allèles de microsatellites à travers divers organismes ou populations.

5. Quels sont les défis associés au développement et à l'application des microsatellites ?

Le processus de développement des microsatellites peut rencontrer certains défis, tels que la localisation de loci appropriés qui présentent un degré élevé de polymorphisme, et la réduction du risque de génotypage des erreurs pouvant résulter de bandes de bégaiement ou de perte d'allèle. De plus, des défis d'ordre technique peuvent survenir en ce qui concerne la transférabilité entre espèces et le développement d'essais PCR multiplex.

Développement de nouveaux marqueurs SSR pour le linLinum usitatissimum L.) Utilisation du séquençage génomique à représentation réduite

Journal : Fronts Plant Sci
Facteur d'impact : 4,298
Publié : 13 janvier 2017

Contexte

La sélection de lin dans le nord-est de la Chine fait face à des défis pour développer des variétés adaptables avec un rendement et une qualité améliorés. La sélection assistée par marqueurs (SAM) offre une solution, avec des avancées récentes dans la découverte de marqueurs SSR montrant des promesses. Utiliser séquençage de nouvelle génération Des méthodes ont permis d'identifier rapidement de nombreux marqueurs SSR, aidant ainsi les programmes de sélection. La plateforme de séquençage Illumina, choisie pour son débit élevé et sa précision, a facilité l'identification systématique des marqueurs SSR pour une utilisation immédiate dans la sélection du lin.

Méthodes

Résultats

Dans le génome du lin, les auteurs ont identifié 1 720 loci de répétitions de séquences simples (SSR), dont 1 574 sont des découvertes novatrices. Les types de motifs SSR se composent principalement de répétitions de trinucleotides (56,1 %) et de dinucleotides (35,23 %), selon nos données présentées dans le Tableau 1.

Tableau 1. Fréquences des différents types de motifs de répétition SSR.

Fig 1. Nombres de SSRs dinucléotidiques et trinucléotidiques classés en fonction de leurs motifs.

En utilisant 62 paires de primers, l'identification de polymorphisme a été réalisée sur 48 variétés de lin du nord-est de la Chine, révélant leur classification principalement en types fibre et huile (Fig 2). Remarquablement, au sein du type fibre, les cultivars "NEW1" et "Venus" ont montré des antécédents génétiques significativement distincts. De même, l'antécédent génétique de "A0529" différait des autres types huile. Par conséquent, ces trois cultivars de lin ont des implications significatives pour les efforts de sélection du lin.

Fig 2. Diversité génétique de 48 cultivars/accès de lin basée sur des marqueurs SSR.

Conclusion

Les auteurs ont développé 1574 nouveaux SSR dans le lin en utilisant le séquençage génomique à représentation réduite. Parmi ceux-ci, 62 sites SSR ont été sélectionnés pour la conception de primers afin d'évaluer la diversité génétique dans 48 variétés de lin. Les résultats ont montré une claire différenciation entre les variétés de lin à fibre et de lin à graines. Ces SSR seront cruciaux pour l'analyse génétique et le cartographie dans le lin et d'autres cultures.

Référence :

1. Wu J, Zhao Q, Wu G, et al.Développement de nouveaux marqueurs SSR pour le linLinum usitatissimum L.) en utilisant le séquençage du génome à représentation réduite. Frontières en science des plantes. 2017(7):2018.