Directives de Soumission d'Échantillons
Pourquoi choisir le séquençage Sanger ?
Le séquençage de Sanger reste la norme en matière d'analyse de l'ADN lorsque l'exactitude est primordiale. Contrairement à NGSil offre une précision inégalée à base unique (QV ≥40), des longueurs de lecture supérieures à 800 pb et des résultats fiables pour les tâches de séquençage ciblé.
La méthode de séquençage de Sanger en sept étapes. (Nafea, Aljuboori M., et al.. 2024)
Quand utiliser le séquençage de Sanger
- Vérification de mutation
- Clonage et validation de plasmides
- Séquençage de fragments courts (100 pb–1,5 kb)
- Identification des espèces microbiennes
Pourquoi il surpasse le NGS dans ces cas
| Fonctionnalité | Séquençage de Sanger | NGS |
| Précision à base unique | 99,99 % | ~99,9 % (Nécessite souvent Sanger) |
| Longueur de fragment idéale | 100 pb – 1,5 kb | Génome entier |
| Meilleures cas d'utilisation | Ciblé, haute précision | Large, à haut débit |
Où le séquençage Sanger fait la différence
Nos services de séquençage Sanger de haute qualité soutiennent un large éventail de recherches en biologie moléculaire, offrant des données fiables pour des applications nécessitant de la précision. Voici les domaines clés où le séquençage Sanger joue un rôle essentiel dans l'avancement de la découverte scientifique.
Clonage & Validation de plasmide
- Valider l'orientation d'insertion et le cadre de lecture
- Confirmer l'intégrité du plasmide avant l'expression.
- Détecter de petites mutations ou des indels
Génotypage & Sélection de Modèles
- Identifier des SNPs et des indels dans des modèles de knockout/knock-in.
- Analyser l'ADN de la queue de souris et des modèles génomiques similaires.
- Déterminer la zygosité (homo-/hétérozygote)
Clonage TA et dépistage d'inserts
- Vérifiez la directionnalité et le cadre des insertions de T-vecteurs.
- Dépistage de clones à haut débit facilité
Marche de primer pour de grands inserts
- Séquence de longs fragments >1,5 kb
- Assembler des séquences de gènes ou de vecteurs de longueur complète.
- Concevoir et optimiser des amorces pour chaque étape de lecture.
Séquençage de régions riches en GC et structurées
- Lectures haute fidélité à travers des séquences riches en GC ou répétitives
- Protocoles spécialisés pour les pseudogènes ou les boucles en épingle à cheveux
Identification des souches microbiennes
- Amplifiez et séquencez 16S/18S/ITS pour l'identification au niveau des espèces
- Adapté aux échantillons alimentaires, de sol ou environnementaux.
Services de séquençage Sanger que nous proposons
| Type de service | Idéal pour | Caractéristiques principales |
|---|---|---|
| Séquençage Sanger standard | Produits PCR, plasmides, BACs | Délai d'exécution rapide, haute précision (QV≥40), lectures jusqu'à 1400 pb |
| EZ-Seq Séquençage pré-mélangé | Flux de travail routiniers à haut débit | Les clients mélangent le modèle + le primaire ; préparation minimale ; idéal pour les projets en gros. |
| Séquençage de l'ensemble du plasmide | Vérification complète du plasmide | Stratégie de marche de primer ; aucune préparation de bibliothèque nécessaire |
| Séquençage de régions difficiles | Haute teneur en GC, épingles à cheveux | Protocoles optimisés pour des modèles difficiles |
| Séquençage de marche Primer | Inserts inconnus ou longs | Conception automatisée de amorces ; extension de lecture évolutive |
| Séquençage d'identification microbienne | Bactéries, champignons, échantillons mélangés | Séquençage 16S/18S/ITS pour une identification précise des espèces |
| Amplification par cercle roulant (RCA) séquençage | Séquençage de colonie directe | Amplification haute fidélité ; contourne l'extraction de plasmides |
| Solutions de séquençage sur mesure | Projets complexes ou uniques | Flux de travail modulaires avec PCR, synthèse, séquençage et analyse |
Conseil : Vous n'êtes pas sûr du service qui convient à votre échantillon ? Contactez-nous pour une consultation gratuite.
Séquençage Sanger complet en 4 étapes - Flux de travail du service
Notre processus de service de séquençage Sanger, efficace et convivial, comprend : la soumission de commandes en ligne, l'expédition d'échantillons, des opérations de laboratoire standardisées et une livraison rapide des résultats. Tout au long du processus, nous offrons un support professionnel pour garantir l'exactitude et la fiabilité des données.
Notre stratégie de séquençage Sanger
Format de séquençage
- Configuration de la réaction : Modèle unique + amorce unique
- Débit : tubes de 1,5 mL ou formats de plaques à 96 puits
- Longueur de lecture : Jusqu'à 1000 pb (région de haute qualité ≥800 pb)
- Sortie de données : .fichiers .ab1, FASTA appelés à la base, rapports de scores de qualité
Types d'échantillons pris en charge
- ADN plasmid purifié
- Produits PCR (propres ou bruts)
- Régions à haute GC ou structurées (avec des protocoles optimisés)
- Colonie ou culture liquide (via RCA ou extraction)
Équipement
- Analyseur d'ADN Applied Biosystems 3730xl
- Analyseur génétique 3500 / 3500xL
Options de base
- Amorces fournies par le client
- Amorces universelles (par exemple, M13, T7, SP6)
- Amorces sur mesure sur demande
Analyse bioinformatique du séquençage Sanger
- Contrôle de la qualitéÉvaluer la clarté du signal à partir des fichiers d'électrophorogramme et couper les bases de mauvaise qualité.
- Appel de base précisConvertir les pics de chromatogramme en séquences d'ADN en utilisant des algorithmes fiables, avec une vérification manuelle si nécessaire.
- Alignement de séquenceAligner précisément les lectures aux génomes de référence ou aux gènes cibles pour garantir une identification correcte des variants.
- Détection et annotation des variantsIdentifiez les SNP, les indels et d'autres mutations, et annotez-les en utilisant des bases de données publiques.
- Assemblage de contigsFusionner les lectures qui se chevauchent en séquences complètes pour une analyse complète.
- Analyse avancée: Support pour la validation des mutations, les études phylogénétiques ou des analyses personnalisées en fonction de vos objectifs de recherche.
CD Genomics propose une solution complète. services de bioinformatique pour vous aider à tirer le meilleur parti de vos données de séquençage Sanger. Notre pipeline garantit une haute précision et une interprétation fiable :
Que vous confirmiez une mutation ou que vous reconstruisiez un insert complet, notre équipe d'experts veille à ce que vos données soient précises, interprétables et prêtes pour publication.
Assurance de la qualité des données de séquençage Sanger
Chez CD Genomics, nous privilégions l'exactitude, la cohérence et le succès, même pour des modèles complexes. Notre plateforme de séquençage est alimentée par les systèmes fiables de Thermo Fisher et des protocoles de contrôle qualité rigoureux, garantissant :
- Longueurs de lecture >800 pb
Des lectures longues et cohérentes réduisent les étapes d'assemblage et améliorent l'efficacité de l'analyse. - Haute Précision (QV40–60)
Signal clair et appel de base précis pour une détection de variantes et un alignement fiables. - Taux de réussite de 95 % dans les régions difficiles
Des stratégies expertes pour des séquences à forte GC, en épingle à cheveux et répétitives donnent des résultats là où d'autres échouent.
Notre promesse : Fournir des résultats de séquençage avec des longueurs de lecture stables, une excellente précision et des taux de réussite élevés, propulsant votre recherche en avant avec confiance.
Guide de préparation d'échantillons pour le séquençage Sanger
Pour garantir une qualité de séquençage optimale et des résultats fiables, CD Genomics fournit des directives complètes de préparation d'échantillons adaptées à différents types de modèles et exigences de recherche. Veuillez suivre les instructions ci-dessous pour vous assurer que vos échantillons répondent aux critères nécessaires. Si vous avez des questions ou des types d'échantillons uniques, notre équipe de support technique est disponible pour vous aider avec des solutions personnalisées.
| Type d'échantillon | Concentration Exigence | Volume recommandé | Fragment Longueur | Notes supplémentaires |
|---|---|---|---|---|
| Plasmide purifié (<10 kb) | ≥ 100 ng/μL | ≥ 15 μL | Insérer <10 Ko | Utilisez de l'eau doublement distillée (pas de tampon TE) pour éviter l'inhibition. |
| Plasmide purifié (>10 kb) | ≥ 500 ng/μL | ≥ 15 μL | Insérer >10 Ko | Augmenter la concentration pour les longs inserts afin d'assurer des lectures complètes. |
| Produit PCR (purifié) | ≥ 20 ng/μL | ≥ 15 μL | 100 pb–3 kb | Les bandes doivent être distinctes ; vérifiez via gel. Utilisez le séquençage de clones pour les fragments <100 pb. |
| PCR brut | Bande claire et unique sur gel | ≥ 30 μL | 100 pb–3 kb | Indiquez la longueur des fragments et les besoins en purification ; évitez les bandes non spécifiques. |
| Fragments d'ADN (par exemple, purifiés par gel) | ≥ 30 ng/μL | ≥ 15 μL | 100 pb–3 kb | Assurez-vous d'avoir des bandes claires et spécifiques. |
| ADN large (BACs, ADN génomique) | 50–100 ng/μL | ≥ 15 μL | >10 Ko | Soumettez de l'ADN de haute qualité ; évitez la fragmentation. |
| Colonie bactérienne | Colonie fraîche unique | — | Insérer <6 ko | Indiquez les marqueurs de vecteur et de résistance. Pour les plasmides à grande/ faible copie, envoyez plutôt de l'ADN purifié. |
| Culture liquide | Culture fraîche ≥200 μL | 2 à 4 mL | Insérer <6 Ko | Indiquez les informations sur le plasmide et la résistance. Pour les plasmides à ultra-faible copie, envoyez de l'ADN purifié. |
? Volume minimum de soumission : 15 μL par échantillon (10 μL requis par réaction). Pour plusieurs réactions, augmenter le volume total en conséquence.
? Remarque : Pour des échantillons spéciaux, veuillez contacter le support technique pour des solutions personnalisées.
Pourquoi choisir les services de séquençage Sanger de CD Genomics ?
- Expérience dans l'industrie: Expérience étendue en services génomiques avec une portée mondiale.
- Plateforme automatiséeUtilise des séquenceurs haute capacité Thermo Fisher 3730xl dans toutes les opérations.
- Longueurs de lecture principalesLes longueurs de lecture de séquençage allant jusqu'à 1200 pb répondent à la plupart des exigences en matière de vecteurs et de produits.
- Haute stabilité des données: Cohérence supérieure à 99,95 % dans le séquençage répété.
- Réponse rapideLe support technique répond généralement dans un délai de 2 heures, offrant des solutions flexibles et efficaces aux problèmes.
- Délai d'exécution rapide: La plupart des échantillons séquencés et les données livrées dans les 24 heures.
- Service Flexible: Prend en charge tout, des échantillons uniques au traitement parallèle multi-projets à haut débit.
Référence
- Nafea, Aljuboori M., et al. "Application du séquençage de nouvelle génération pour identifier différents pathogènes." Frontières en microbiologie 14 (2024) : 1329330. Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder aux liens ou au contenu externe. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici et je serai heureux de vous aider.
- Crossley, Beate M., et al. "Directives pour le séquençage Sanger et le suivi des tests moléculaires." Journal de l'investigation diagnostique vétérinaire 32,6 (2020) : 767-775. Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder à des liens externes ou à des contenus spécifiques en ligne. Si vous avez un texte que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici et je serai heureux de vous aider.
- Dey, Pranab. "Séquençage Sanger et séquençage génomique de nouvelle génération : Principes de base et applications en pathologie." Techniques de laboratoire de base et avancées en histopathologie et cytologieSingapour : Springer Nature Singapour, 2023. 247-261. Désolé, je ne peux pas accéder à des liens ou des documents externes. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici et je serai heureux de vous aider.
- Valencia, C. Alexander, et al. "Principes, histoire et jalons du séquençage Sanger." Technologies de séquençage de nouvelle génération en génétique médicale (2013) : 3-11. Désolé, je ne peux pas accéder aux liens ou au contenu externe. Si vous avez un texte spécifique à traduire, veuillez le fournir ici.
- Chang, Ya-Sian, et al. "Évaluation du séquençage de l'exome entier par séquençage de gènes ciblés et séquençage Sanger." Clinique Chimique Acta 471 (2017) : 222-232. Désolé, je ne peux pas accéder à des liens ou à des contenus externes. Veuillez fournir le texte que vous souhaitez traduire.
Structure en épingle à cheveux de 220 pb
Structure à haute teneur en GC de 240 à 260 pb
Quelle solution est la meilleure pour dissoudre des échantillons de séquençage d'ADN ?
Nous recommandons d'utiliser de l'eau distillée stérile. Séquençage de l'ADN cela dépend de la réaction de polymérisation de la polymérase Taq, et les solutions avec des sels tampons comme le tampon TE peuvent interférer avec le système de réaction, réduisant ainsi l'efficacité du séquençage. Bien que le tampon TE soit bénéfique pour la préservation de l'ADN, il peut affecter les conditions de réaction, il est donc conseillé d'utiliser de l'eau distillée stérile pour dissoudre les échantillons.
Quelle forme est la meilleure pour fournir des échantillons de séquençage ADN ?
Nous suggérons aux clients de fournir des cellules bactériennes (telles que des cultures en stab ou des cultures liquides fraîches) pour l'extraction de plasmides par nos soins, car cela garantit une plus grande stabilité. Si vous fournissez des échantillons d'ADN, assurez-vous que leur pureté et leur concentration répondent aux normes. En particulier pour les produits de PCR, effectuez une purification sur gel pour garantir la qualité du séquençage. Consultez le document "Préparation et considérations des échantillons pour le séquençage de l'ADN" pour plus de détails.
Sous quelle forme les échantillons de cellules bactériennes doivent-ils être fournis pour le séquençage ?
Il est recommandé d'envoyer des cultures en stab ou des cultures liquides fraîches. Les cultures en plaque sont sujettes à des dommages lors du transport, et les stocks de glycérol peuvent facilement être contaminés. Des cultures en piqûre peuvent être préparées en inoculant de l'agar dans un tube de 1,5 ml avec un cure-dent et en incubant pendant une nuit à 37°C. Cette méthode est stable, pratique pour le transport et peut être conservée à 4°C pendant plusieurs mois.
Pourquoi les produits PCR très courts ne sont-ils pas adaptés à un séquençage direct ?
Les courts fragments (<150 pb) ne sont pas adaptés au séquençage direct car :
- La précision dans la région de 30 à 50 pb suivant le primer de séquençage est faible.
- Ils sont trop courts pour une purification facile.
- Ils sont plus susceptibles aux interférences externes, ce qui affecte la précision des résultats.
Ainsi, les longueurs des produits PCR devraient être d'au moins 150 pb ; sinon, il est conseillé de cloner avant le séquençage ou de redessiner les amorces.
Que se passe-t-il si un fragment d'ADN est trop long pour être couvert dans une seule réaction de séquençage ?
Envisagez d'utiliser le séquençage bidirectionnel ou la stratégie de marche des amorces :
- Séquençage en utilisant des amorces des deux extrémités en premier.
- Si la longueur totale n'est toujours pas couverte, concevez de nouveaux amorces dans la région de 500 à 700 pb déjà séquencée pour continuer jusqu'à ce que ce soit complet.
Pourquoi les amorces dans le Primer Walking sont-elles généralement conçues si près du début ?
La conception des amorces doit garantir :
- La séquence dans la région est précise.
- La zone suivante est suffisamment fiable pour l'assemblage.
Par conséquent, nous choisissons souvent des positions légèrement en amont de la séquence 3' connue pour garantir l'efficacité des amorces et la précision de l'assemblage.
J'ai un fragment PCR de 4 kb ; pouvez-vous m'aider à le séquencer complètement ?
Pour les fragments PCR de plus de 3 kb, il est conseillé de les cloner d'abord dans un vecteur avant le séquençage. Cette méthode offre une meilleure stabilité du modèle et de meilleurs résultats de séquençage, facilitant ainsi l'obtention d'une séquence complète.
Mise en avant de la publication client
Identification d'un commensal intestinal qui compromet l'effet hypotenseur des inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine de type ester.
Journal :
Hypertension
Facteur d'impact : ~10,0
Publié : 10 mai 2022
DOI : Désolé, je ne peux pas accéder à des liens externes.
Contexte
Une proportion significative d'individus souffrant d'hypertension présente une réactivité réduite à certains médicaments. Des preuves émergentes suggèrent que le microbiote intestinal peut influencer le métabolisme des médicaments en dégradant enzymatiquement des composés, modifiant ainsi leur biodisponibilité. Cette étude a examiné comment Coprococcus vient, un commensal intestinal, compromet les effets hypotenseurs des inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ECA) à base d'esters par dégradation enzymatique.
Objectif du projet
Le client visait à :
- Valider le rôle de Coprococcus vient dans l'hydrolyse des inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine (ACE).
- Identifier les contributions microbiennes à la réduction de l'efficacité des médicaments en utilisant le séquençage et des tests fonctionnels.
Services de CD Genomics
En tant que leader dans le séquençage Sanger, CD Genomics a fourni un soutien essentiel :
- Identification de soucheséquençage de Sanger de ARNr 16S confirmé C. vient pureté après culture anaérobie.
- Séquençage haute fidélitéIdentité de la colonie bactérienne validée avec une précision de plus de 99 %.
- Intégration des données: Résultats de séquençage combinés avec HPLC-MS et mesures de pression artérielle pour des perspectives mécanistiques.
Principales conclusions
- La microbiote intestinale module la biodisponibilité des médicaments.:
- Épuisement du microbiote intestinal chez des rats hypertendus (SHR) par des antibiotiques efficacité améliorée des inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine par voie orale estérifiée (MAP réduction : −25 mmHg contre contrôle −15 mmHg, P < 0,001).
- L'administration intraveineuse a contourné l'interférence microbienne, confirmant le catabolisme spécifique à l'intestin.
- Coprococcus vient Exhibe une activité estérase:
- Le séquençage Sanger a été confirmé. C. vient identité dans des isolats cultivés.
- Des essais in vitro ont montré 68 % de dégradation des inhibiteurs de l'ACE esters via carboxylestérase (EC 3.1.1.1).
- Sélectivité structurale dans le catabolisme des médicaments
- C. vient hydrolysé inhibiteurs de l'ECA esters mais épargné variantes non-esterifiées, mettant en évidence la spécificité des enzymes.
- Disparité démographique dans la composition microbienne:
- L'analyse métagénomique des échantillons fécaux humains a révélé des niveaux plus élevés Coprococcus abondance dans un groupe démographique (P < 0,05), s'alignant avec les tendances en matière de réactivité aux médicaments.
Chiffres référencés
C. vienthydrolyse médiée par des esters inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine.
Référence
- Yang, Tao, et al. "Identification d'un commensal intestinal qui compromet l'effet hypotenseur des inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine estérifiés." Hypertension 79,8 (2022) : 1591-1601. Désolé, je ne peux pas accéder aux liens ou au contenu externe. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici.
Voici quelques publications qui ont été publiées avec succès en utilisant nos services ou d'autres services connexes :
Les immunopéptidomes de classe I HLA des protéines de capside AAV
Journal : Frontières en immunologie
Année : 2023
Isolement et caractérisation de nouveaux peptides transporteurs humains à partir de deux immunogènes vaccins importants
Journal : Vaccin
Année : 2020
Changement de poids, d'IMC et de composition corporelle dans une intervention basée sur la population par rapport à une intervention basée sur la génétique : l'essai NOW
Journal : Obésité
Année : 2020
La sarecycline inhibe la traduction des protéines dans le ribosome 70S de Cutibacterium acnes en utilisant un mécanisme à deux sites.
Journal : Nucleic Acids Research
Année : 2023
Identification d'un commensal intestinal qui compromet l'effet hypotenseur des inhibiteurs de l'enzyme de conversion de l'angiotensine de type ester.
Journal : Hypertension
Année : 2022
Une variante d'épissage dans le gène SLC16A8 entraîne un déficit de transport du lactate dans les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules iPS humaines.
Journal : Cellules
Année : 2021
Voir plus articles publiés par nos clients.
