Séquençage à lecture longue

CD Genomics propose des technologies de pointe et des services d'analyse bioinformatique pour le séquençage à longues lectures, qui incluent Séquençage SMRT de PacBio et Séquençage par nanoporeNous proposons des solutions de séquençage précises et rentables pour la recherche sur les humains, les animaux, les plantes et les micro-organismes.

Qu'est-ce que le séquençage à longues lectures ?

Le séquençage à lecture longue, également connu sous le nom de séquençage de troisième génération, est un groupe en plein essor. Séquençage de l'ADN des technologies qui éliminent le besoin de techniques de séquençage traditionnelles, de clivage de l'ADN et d'amplification, et permettent la détection simultanée de longues séquences d'ADN allant jusqu'à 100 000 paires de bases. Les scientifiques ont pris conscience de l'importance des variants structurels dans le génome humain. Certains d'entre eux sont des variants d'insertion qui dépassent la longueur de lecture de nombreuses technologies de séquençage ; certains sont des régions répétitives qui rendent l'alignement des séquences difficile ; et certains sont des régions riches en GC, qui posent souvent de nombreux inconvénients dans l'étude des variants structurels par des méthodes de séquençage à courtes lectures.

Ces dernières années, de nouvelles technologies capables de détecter des séquences de longues lectures ont émergé, offrant aux chercheurs de nouvelles stratégies et outils pour l'analyse génomique. Parmi elles, les plus représentatives et largement utilisées sont Séquençage SMRT de PacBio et Séquençage par nanoporeLes technologies de séquençage à lecture longue peuvent produire des lectures très longues, ce qui n'est pas possible dans séquençage de nouvelle génération.

PacBio a lancé la plateforme de séquençage de séquençage en temps réel à molécule unique (SMRT), qui utilise une cellule de flux personnalisée avec de nombreux guides d'ondes en mode zéro pour séquencer des molécules uniques en temps réel (ZMW). La polymérase est fixée au fond du puits et permet à la chaîne d'ADN de passer à travers le ZMW. L'imagerie en temps réel des nucléotides marqués par fluorescence synthétisés aux côtés de molécules de modèles d'ADN spécifiques est possible avec le séquençage SMRT. Lorsque le cadre et la polymérase se séparent, la réaction de séquençage est complète.

Les éléments essentiels de La technologie de Nanopore diviser en la formation de canaux transmembranaires à partir de nanopores qui permettent aux courants ioniques de passer et la mesure des variations de courant. Lorsque des molécules telles que l'ADN ou l'ARN passent à travers des nanopores, elles provoquent une perturbation du courant. Les informations sur les variations de courant peuvent être utilisées pour identifier la molécule. Cela séquence directement les molécules d'ADN/ARN entières.

Avantages du séquençage à longues lectures

• Longues longueurs de lecture moyennes et haute précision de consensus
• Précision améliorée pour les séquences répétées et les variations du nombre de copies
• Détection plus précise d'un grand nombre de mutations
• Optimisation du protocole d'extraction d'ADN dans le séquençage à lecture longue
• Compatible avec l'analyse des génomes et des transcriptomes.
• Rapide et abordable

Application du séquençage à lecture longue

• Fonction des gènes : Concentrez-vous sur des échantillons portant des fonctions spécifiques pour révéler les principales causes des différentes fonctions.
• Structure des gènes : épissage alternatif, APA, gène de fusion, SSR, prédiction de CDS, identification de TSS/TES, etc.
• Quantification en longueur complète : Trouver des gènes différentiels complets et efficaces et identifier des gènes fonctionnels.
• Épigénomique: Génome complet direct et séquençage du transcriptome peut détecter les modifications de base.

Flux de travail de séquençage à lecture longue

CD Genomics utilise plusieurs plateformes pour fournir des services de séquençage à long brin rapides et précis ainsi qu'une analyse bioinformatique. Nos experts hautement expérimentés mettent en œuvre la gestion de la qualité, en suivant chaque procédure pour garantir des résultats de haute qualité. Le flux de travail général pour le séquençage à long brin est décrit ci-dessous.

Spécifications de service

	Exigences d'échantillon ADNg, ARN total, tissu, cellule, et al. Veuillez sélectionner la page de service de séquençage à long-lecture appropriée en fonction de vos objectifs. Chaque page contient des exigences spécifiques pour les échantillons. Par exemple, séquençage du génome entier (PacBio), ADN génomique ≥ 3 µg, concentration ≥ 80 ng/µL Séquençage du génome entier (Nanopore), ADN génomique ≥ 5 µg, Concentration ≥ 20 ng/µL Séquençage de plasmides (Nanopore), ADN génomique ≥ 1 µg, Quantité minimale : 500 ng, Concentration ≥ 10 ng/µL Séquençage d'amplicons complet 16S/18S/ITS et Séquençage métagénomique à lecture longue Remarque : Les montants d'échantillons sont donnés à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégie de séquençage Plateformes ONT, Bibliothèque : 8K, 2G/par échantillon Plateformes PacBio, bibliothèque de 20 K
	Analyse bioinformatique Basecalling Contrôle de qualité (FastQC / PycoQC / MinIONQC) Filtrage de lecture / découpage / suppression d'adaptateur Assemblage de génome Séquences de consensus et correction d'erreurs Appel de variantes Analyse des variants structurels Analyse SNP/CNV Analyse de la régulation des gènes Analyse du splicing alternatif …et plus encore Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Aperçu des outils et des pipelines d'analyse des longues lectures. (Amarasinghe et al., 2020)

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse de données
• Détails sur le séquençage à lecture longue pour votre rédaction (personnalisation)

CD Genomics propose un package complet de services de séquençage à long lecteur incluant la préparation des échantillons, la construction de bibliothèques, séquençage SMRT et/ou Séquençage par nanopore, et analyse bioinformatique. Nous pouvons adapter ce pipeline à vos intérêts de recherche. Si vous avez des exigences supplémentaires ou des questions, n'hésitez pas à nous contacter.

Référence

1. Amarasinghe S L, Su S, Dong X, et al. Opportunités et défis dans l'analyse des données de séquençage à longue lecture. Biologie du génome, 2020, 21(1) : 30.

En utilisant les résultats de séquençage à lecture longue du génome entier à cellule unique comme exemple. (Hård et al., 2023)

Référence

1. Hård J, Mold J E, Eisfeldt J, et al. Analyse du génome entier à lecture longue des cellules humaines uniques[J]. Nature Communications, 2023, 14(1) : 5164.

Quelle est la différence entre le séquençage Illumina et le séquençage à longues lectures ?

Le séquençage Illumina, appelé séquençage à courte lecture, produit des lectures de séquence plus courtes, généralement comprises entre 100 et 300 paires de bases. En revanche, les technologies de séquençage à longue lecture, comme celles proposées par Technologies Oxford Nanopore et Pacific Biosciences, générer des lectures significativement plus longues, s'étendant de milliers à des dizaines de milliers de paires de bases. Cette variation dans la longueur des lectures permet au séquençage à long terme d'améliorer la résolution des régions génomiques complexes, y compris les séquences répétées et les variants structurels, conduisant à une compréhension génomique plus approfondie par rapport au séquençage Illumina. L'application du séquençage à long terme aide grandement à déchiffrer les génomes bactériens complexes, en particulier lorsqu'il est combiné avec des données de séquençage Illumina à courtes lectures via des méthodes d'assemblage hybride.

2. Dans quels domaines de recherche le séquençage à longues lectures est-il adapté ?

Le séquençage à lecture longue est applicable à divers domaines de recherche au sein de génomique, y compris la génétique humaine, la biologie évolutive, la microbiologie et la botanique. Cela permet aux chercheurs d'acquérir une compréhension plus complète de la structure et de la fonction du génome, ce qui favorise les avancées dans ces domaines.

3. Quels sont les avantages et les inconvénients de la plateforme PacBio ?

Le Plateforme PacBio se vante d'une précision élevée à l'échelle de la molécule unique, avec plus de 90 % des séquences atteignant un score de qualité (Q) supérieur à 30, et offre des données de séquençage avec une précision d'alignement dépassant celle de NGS plateformes. De plus, elle offre une longueur de lecture moyenne qui dépasse NGS des plateformes de plus de deux ordres de grandeur. Cependant, ses inconvénients incluent des coûts de séquençage significativement plus élevés par rapport à des plateformes comme Novaseq, des dépenses d'équipement élevées et l'incapacité à interpréter les données de séquençage en temps réel, ne répondant donc pas aux exigences des scénarios nécessitant une grande rapidité.

4. Quels sont les avantages et les inconvénients de la technologie ONT ?

Les avantages de technologie ONT réside dans sa grande rapidité de séquençage et ses coûts de séquençage relativement plus bas par rapport à Plateforme PacBioDe plus, sa longueur de lecture moyenne dépasse celle de NGS les plateformes de plus de deux ordres de grandeur. Cependant, ses inconvénients proviennent d'erreurs systématiques dans la détection des signaux, telles que des difficultés à identifier les homopolymères de bases, entraînant des différences significatives tant en précision de molécule unique qu'en précision d'alignement par rapport aux plateformes PacBio et NGS. Ces limitations restreignent ses applications.

Le paysage de la variation structurelle génomique chez les Australiens autochtones

Journal : Nature
Facteur d'impact : 45,16
Publié : 13 décembre 2023

Contexte

L'Australie abrite des centaines de nations aborigènes, chacune avec une riche diversité culturelle et linguistique. Malgré une documentation extensive de leur patrimoine culturel, la diversité génomique des Australiens autochtones est peu explorée, avec une représentation significative sous-représentée dans les bases de données génomiques mondiales. Le Centre national pour la génomique autochtone (NCIG) comble cette lacune en engageant les communautés aborigènes dans des recherches génomiques éthiques et dirigées par la communauté. Dans cette étude, un séquençage à grande échelle par longues lectures a été réalisé sur des communautés aborigènes en utilisant Technologies Oxford Nanopore, révélant des variations génomiques et des variants structurels auparavant inexplorés, qui sont essentiels pour faire progresser la médecine génomique.

Méthodes

Résultats

Le génome de référence complet T2T-chm13 a été utilisé pour évaluer la mappabilité et la détection des variants structurels (SV), montrant la supériorité de l'alignement et de la détection des SV par ONT. Cela a révélé 159 912 SV uniques et 136 797 grands indels, et a identifié 11 variants de nombre de copies (CNV) de haute confiance par individu, soulignant les avantages du séquençage à longues lectures pour un profilage génomique détaillé.

Fig. 1 Séquençage à long terme dans les communautés autochtones australiennes.

Pour caractériser la variation structurelle du génome, les auteurs ont classé les variants par type, taille et contexte. La plupart des variants (84,9 %) étaient des séquences répétitives, y compris des STR, des TR et des insertions/délétions d'éléments mobiles. Les CNV étaient moins nombreux mais couvraient des régions significatives du génome. Les variants étaient distribués de manière inégale, avec une densité plus élevée près des télomères, en particulier pour les SV associés aux TR. La taille variait selon le type, les SV-TR étant plus grands que les STR et les SV non répétitifs. Les SV d'éléments mobiles montraient des pics de taille correspondant à des familles de répétitions majeures comme Alu, L1 et SVA. De nombreux SV étaient uniques à cette étude, surtout compte tenu de l'inclusion de communautés australiennes sous-représentées et de l'utilisation du séquençage à lecture longue. En comparant les SV de cette étude aux bases de données mondiales, les auteurs ont trouvé environ 38 % de similarité avec les SV annotés, indiquant une forte proportion de SV nouveaux.

Fig. 2 Paysage de la variation structurelle génomique.

Les auteurs ont analysé les variations structurelles génomiques (SV) parmi les Australiens autochtones et non autochtones, constatant que la plupart des SV étaient privées ou polymorphes. Notamment, 48,5 % des SV étaient uniques aux individus autochtones, tandis que 9,2 % étaient uniques aux individus non autochtones. Les SV uniques chez les individus autochtones étaient souvent non annotés et spécifiques à certaines communautés. Des distinctions génétiques étaient évidentes, avec des clusters distincts pour différentes communautés dans l'analyse des coordonnées principales, et les SV partagés parmi les individus autochtones étaient rares, soulignant leur diversité génomique unique.

Fig. 3 Distribution des SV dans les individus autochtones et non autochtones.

Fig. 4 Distribution des SV entre les communautés autochtones.

Conclusion

Cette étude dévoile le paysage de variation structurelle des Australiens autochtones en utilisant le séquençage à lecture longue, révélant des variations diverses uniques à cette population. Cela souligne la nécessité de données de référence spécifiques à l'ascendance dans la médecine génomique. Nous mettons en évidence l'hétérogénéité génétique parmi les communautés autochtones et fournissons des aperçus sur des modèles plus larges de variation structurelle génomique dans les populations humaines, en particulier dans les répétitions en tandem courtes (STR), qui ont des implications pour le diagnostic et le traitement des maladies.

Référence

1. Reis, A.L.M., Rapadas, M., Hammond, J.M. et al. Le paysage de la variation structurelle génomique chez les Australiens autochtones. Nature 624, 602–610 (2023).