Services de séquençage Oxford Nanopore — Lectures ultra-longues, décisions en temps réel, ARN direct
La seule technologie de séquençage qui fournit des lectures ultra-longues de classe Mb, diffuse des données en temps réel et séquence directement l'ARN natif — sans transcription inverse ni amplification. La plateforme Oxford Nanopore de CD Genomics vous offre les lectures les plus longues en génomique, la possibilité d'arrêter une course lorsque vous avez suffisamment de données, et un accès direct aux modifications de l'ARN que d'autres plateformes manquent.
Ce que nous proposons:
Lectures ultra-long (classe Mb) pour l'assemblage de génomes sans lacunes et la résolution de répétitions complexes
Séquençage d'ARN direct — ARN natif, pas de transcription inverse, pas de biais d'amplification
Contrôle de séquençage en temps réel — surveillez le rendement en direct, arrêtez-vous lorsque les objectifs sont atteints.
Soutien de projet de bout en bout : préparation de la bibliothèque → séquençage → bioinformatique → rapports prêts à publier
Problèmes que nous résolvons:
Résoudre les télomères, les centromères et les duplications segmentaires — des régions où les courtes lectures échouent.
Séquence des isoformes pleines longueurs et détectez les modifications de l'ARN directement à partir de molécules d'ARN natives.
Surveillez l'avancement du séquençage en temps réel et terminez les courses dès que vous avez suffisamment de données.
Confiance: QC basé sur SOP · FASTQ plus FAST5/POD5 optionnel · conception d'étude consultative
Quand les lectures ultra-longues et le temps réel comptent
Si votre projet nécessite des lectures plus longues que 20 ko — pour couvrir de grandes variantes structurelles, combler des lacunes génomiques ou résoudre des isoformes de transcrits de pleine longueur — Oxford Nanopore est votre meilleure option. Nanopore détient le record des lectures de séquençage les plus longues jamais produites (dépassant 2 Mb). C'est également la seule plateforme qui diffuse des données en temps réel — vous permettant d'arrêter une course dès que vous avez suffisamment de couverture — et la seule plateforme qui séquence directement des molécules d'ARN natif, préservant les informations de modification que les méthodes basées sur l'ADNc perdent.
Bien sûr, les lectures brutes de nanopores échangent une certaine précision par lecture pour ces capacités (généralement Q10–20 brutes, s'améliorant avec les dernières chimies et les basecallers Dorado). Pour les projets nécessitant la plus haute précision par lecture, envisagez PacBio HiFi ; pour les plus longues plages de lecture, la surveillance en temps réel et l'analyse directe de l'ARN, le nanopore n'a pas d'égal.
Comment fonctionne le séquençage par nanopore
Le séquençage par nanopore fait passer une seule molécule d'ADN ou d'ARN à travers un nanopore protéique intégré dans une membrane résistante à l'électricité. À mesure que chaque nucléotide traverse le pore, il perturbe le courant ionique de manière spécifique à la séquence. Ces variations de courant sont enregistrées en temps réel et décodées en séquences de nucléotides (A, T, C, G — ou bases d'ARN) par un appelant de bases utilisant un réseau de neurones tel que Dorado.
Contrairement à Illumina (séquençage par synthèse avec amplification en clusters) ou PacBio (détection optique de nucléotides marqués par fluorescence dans des guides d'ondes en mode zéro avec consensus circulaire), Nanopore lit directement la molécule native. Pas d'amplification, pas de synthèse et pas de mesure optique impliquées. Le signal brut porte non seulement l'identité de la base mais aussi des informations de modification (5mC, 6mA et modifications de l'ARN), qui peuvent être extraites bioinformatiquement sans préparation d'échantillon supplémentaire.
Pourquoi c'est important pour votre recherche :
Des lectures ultra-longues (dépassant régulièrement 1 Mb, avec des lectures record dépassant 2 Mb). Elles couvrent les télomères, les centromères, les duplications segmentaires et les grandes variantes structurelles qui ne peuvent pas être résolues avec des plateformes de lectures courtes ou de longueur intermédiaire.
Diffusion de données en temps réel. Les résultats de séquençage sont générés au fur et à mesure que la molécule passe à travers le pore, permettant un suivi en direct des rendements, un échantillonnage adaptatif (enrichir ou appauvrir les régions cibles en temps réel) et une interruption immédiate de l'analyse lorsque des données suffisantes sont collectées.
Détection directe des ARN et des modifications natives. Séquence des molécules d'ARN sans transcription inverse ni biais d'amplification. Détectez la méthylation de l'ADN (5mC, 6mA) à partir des lectures génomiques et les modifications de l'ARN (m6A, pseudouridine, inosine) à partir des lectures d'ARN directes — tout cela à partir du signal brut, sans conversion au bisulfite ni étapes d'enrichissement requises.
Une ligneSéquençage complet de l'ARNt avec détection directe des modifications de l'ARN sur la plateforme Nanopore. Profilage complet des isoaccepteurs et isoformes d'ARNt avec capture des modifications natives, y compris m1A, m3C, m7G, pseudouridine et d'autres marques épitranscriptomiques.
Meilleur pourbiologie des ARNt, études du paysage de modification, caractérisation des tsARN, profilage épitranscriptomique.
Une ligneRésoudre des communautés microbiennes complexes avec des lectures nanopore longues pour la classification au niveau des espèces, les génomes assemblés de métagénomes (MAGs) et le profilage des gènes de résistance. Disponible sur les plateformes PacBio HiFi et Oxford Nanopore.
Meilleur pour: Communautés métagénomiques complexes, métagénomique déployable sur le terrain, surveillance des pathogènes en temps réel.
Une ligneSéquencez des molécules d'ADNc pleine longueur pour la découverte de transcrits au niveau des isoformes. Transcrivez l'ARN en ADNc, puis séquencez directement — en capturant les structures de transcrits complètes du début 5' à la fin 3' sans assemblage.
Meilleur pourDécouverte d'isoformes de transcrits complets, identification de nouveaux transcrits, quantification de l'expression des isoformes.
Séquençage d'amplification complet 16S/18S/ITS par nanopore
Une ligneAmplifiez et séquencez les régions de gènes rRNA de pleine longueur (16S, 18S, ITS) avec des lectures longues Nanopore pour une résolution taxonomique au niveau des espèces et des souches que les amplicons à courtes lectures ne peuvent pas atteindre.
Meilleur pourProfilage des communautés microbiennes, analyse du microbiome environnemental, classification taxonomique au niveau des souches.
Ce que vous recevrez
Chaque projet Oxford Nanopore est livré avec des données transparentes, une documentation détaillée et des métriques de contrôle qualité reproductibles, garantissant une confiance prête pour la publication.
Fichiers de données principaux (pour chaque projet)
FASTQ (.fastq.gz) — lectures de base appelées (Dorado).
Signal brut optionnel — FAST5/POD5 sur demande pour une réanalyse sensible aux modifications.
Mémo de projet — le protocole de séquençage par nanopore utilisé (kit de bibliothèque, cellule de flux/chimie, paramètres de course), ainsi que les versions de logiciels et les paramètres.
Rapport d'exécution et de contrôle qualité (par échantillon et par code-barres)
Rendement et débit : lectures/bases totales ; comptes de réussite/échec.
Métriques de longueur de lecture : N50/N90, histogrammes de longueur.
Qualité : distribution des scores Q, résumés de précision de lecture.
Performance de codage à barres : taux d'attribution, équilibre entre les échantillons.
Si aligné : taux de cartographie, uniformité de couverture/duplicats, résumés on-/off-target (pour ciblé/amplicon).
Si applicable : utilisation des pores au fil du temps et notes de fonctionnement pour soutenir les dossiers d'étude.
Sorties d'analyse optionnelles (Choisir par service)
Application
Livrables
Génomes (WGS standard / ultra-long)
Assemblage de novo (FASTA / GFA) avec des statistiques (N50, NG50, BUSCO ou QC de k-mer si applicable)
Ensembles de variantes : SNV / indel / SV au format VCF avec des instantanés de preuves de soutien.
Haplotypes phasés optionnels sur demande
Épigénétique (méthylation de l'ADN)
Tables d'appel 5mC / 6mA par site (bedMethyl / TSV)
Résumé des régions différentiellement méthylées (DMR)
Rapports d'enrichissement de motifs et d'analyse de contexte
Sites de début de transcription (TSS) / sites de terminaison (TES) et graphiques de distribution des queues poly(A) (pour les flux de travail TAIL)
Amplicon / Ciblé (Cas9 ou Échantillonnage Adaptatif)
Résumé de validation des séquences de primers / guides
Séquences consensuelles par amplicon
Fichier d'appel de variantes (VCF) avec des estimations de fréquence allélique
Tableaux récapitulatifs de la couverture ciblée / non ciblée
Génome 3D (Pore-C)
Matrices de contact traitées (.cool / .mcool / .hic)
Tableaux récapitulatifs Loop et TAD
Pistes de visualisation du navigateur génomique (bigWig / bigBed)
Protocole de séquençage par nanopore
Entrée et contrôle qualité: Qubit quant; A260/280 ~1,8–2,0, A260/230 ≥2,0. ADN gDNA HMW pour Ultra-Long ; RIN RNA ≥8.
Préparation de la bibliothèque (par application): Standard WGS; Ultra-long (manipulation douce HMW) ; Amplicon ; Ciblé (Cas9 ou échantillonnage adaptatif) ; cDNA/lncRNA plein longueur ; RNA direct ; Pore-C ; TAIL Iso-Seq.
Cellule de flux et codes-barres: Dimensionné pour produire/cibles ; équilibrer les entrées avec codes-barres.
Séquençage et contrôle1–72 h typique ; surveillance en direct ; arrêter/étendre ou recharger si nécessaire ; activer l'échantillonnage adaptatif lorsque cela est pris en charge.
Basecalling et démultiplexage: MinKNOW + Dorado → FASTQ ; FAST5/POD5 optionnel pour une réanalyse sensible aux modifications.
Contrôle qualité post-course: rendement/réussite-échec ; longueur de lecture N50/N90 ; distribution du score de qualité ; cartographie/couverture et ciblé/non ciblé (si aligné).
Documentation et passation: mémo de protocole (kits/chimie/logiciel), rapport QC, résultats d'analyse ciblée ; appel de révision optionnel.
Bioinformatique et analyse de données
Notre service propose une technologie de séquençage par nanopores complète, ainsi que du soutien en bioinformatique et des applications pour les données de séquençage longue lecture d'Oxford Nanopore.
Bioinformatique Standard
Basecalling et démultiplexage : Dorado/MinKNOW pour produire des fichiers FASTQ par échantillon.
Exécuter des tableaux de bord QC : rendement, longueur de lecture N50, distribution des scores Q, équilibre des codes-barres.
Préparation de lecture : découpage des adaptateurs/amorces, filtrage.
Alignement de référence (optionnel) : cartographie consciente des longues lectures avec résumés de couverture ; BAM/CRAM si demandé.
Conservation du signal (optionnel) : POD5/FAST5 préservé pour une réanalyse sensible aux modifications.
Analyse Avancée
Assemblage de génome de novo — première lecture longue ou hybride ; assemblages polis avec des statistiques de continuité.
Variation structurelle (SV) et appel de CNV — grands indels, inversions, translocations ; résumés du nombre de copies.
Analyse et quantification des transcrits complets (isoformes) — découverte d'isoformes, tableaux d'expression, détection de fusions.
Analyse de la modification de l'ADN/ARN (épigénétique) — grade de recherche 5mC/6mA ; résumés des signaux de modification de l'ARN pour l'ARN direct.
Classification métagénomique — profilage taxonomique ; support d'assemblage lorsque cela est applicable.
(Add-ons) Appel de consensus et de variantes ciblées/amplicon, cartes de contact du génome 3D Pore-C.
Applications de séquençage par nanopore
Où le séquençage Oxford Nanopore apporte le plus de valeur dans la recherche :
Assemblage et finition de génomes de novo
Répétitions de séquences et régions complexes ; résoudre les télomères/centromères.
Services recommandés : Séquençage ultra-long, séquençage standard de lecture longue WGS.
Variation structurelle (VS) et réarrangements complexes
Détecter les grandes insertions/délétions, inversions, translocations, expansions de répétitions.
Pour des cohortes de petites variantes à haute profondeur, le séquençage à lecture courte peut être rentable ; les conceptions hybrides (lecture courte + Nanopore) capturent à la fois la profondeur et le contexte à longue portée.
Nanopore vs PacBio HiFi vs Illumina — Comparaison des plateformes
Choisir la bonne plateforme pour votre projet ? Voici comment Nanopore se compare à PacBio HiFi et Illumina sur les dimensions qui comptent pour les résultats de recherche.
Dimension
Nanopore (ONT)
PacBio HiFi
Illumina
Principe
Courant ionique à travers un nanopore protéique ; appel de base par réseau de neurones
Détection optique dans les ZMW ; consensus circulaire (CCS)
Séquençage par synthèse ; imagerie de clusters
Longueur de lecture (typique)
Routine de 10 à 100 Ko ; ultra-long jusqu'à plus de 2 Mo
~15–20 kb lectures HiFi ; sous-lectures jusqu'à ~100 kb
Jusqu'à 2×300 pb
Précision par lecture (brute)
Q10–Q20 brut ; amélioration avec R10.4.1 + Dorado ; haute précision avec profondeur de consensus
QV ≥30 (≥99,9%) selon le consensus CCS
≥99,9 % brut
Synchronisation des données
Diffusion en temps réel ; arrêter ou prolonger une diffusion en direct
Lot (analyse après la fin de l'exécution)
Lot
Biologie native
Séquençage direct de l'ARN ; 5mC/6mA à partir du signal brut ; modifications de l'ARN sans RT ni amplification.
5mC provenant de la cinétique de la polymérase ; pas de bisulfite nécessaire
Aucune détection de modification native (flux de travail standard)
Là où il brille
Ultra-long portée (télomères, SV massifs, fermeture de lacunes) ; travail en temps réel / sur le terrain ; ARN direct
La plus haute précision des longues lectures ; assemblages et méthylation à partir d'un seul ensemble de données.
Cohortes de SNV/indel profondes ; études à grande échelle rentables
Compromis
Précision brute inférieure à HiFi ou Illumina ; bioinformatique consciente du signal requise.
Durées d'exécution plus longues ; pas de contrôle en temps réel ni de diffusion.
Pas de contexte à long terme ; impossible de détecter les modifications natives.
Guide de décision rapide :
Besoin de lectures de plus de 100 Ko ou de séquençage déployable sur le terrain → Nanopore.
Besoin de la plus haute précision dans les longues lectures pour les assemblages et l'appel de variants → PacBio HiFi.
Besoin de séquençage direct de l'ARN ou de données en temps réel → Nanopore est la seule option.
Cohortes importantes de SNV/indel avec un budget limité → Illumina pour la profondeur ; ajouter des lectures longues Nanopore pour les SV et le phasage.
Conceptions hybrides : Nanopore ultra-long + PacBio HiFi pour des assemblages complets T2T ; lectures longues Nanopore + lectures courtes Illumina pour la détection des SV avec validation approfondie des SNV.
La performance réelle varie en fonction de la qualité de l'échantillon, de la préparation de la bibliothèque, de la profondeur de séquençage et du pipeline d'analyse.
Qualité et Conception de l'Étude
Répliques et ContrôlesRecommandez ≥2 réplicats biologiques par condition ; incluez des témoins négatifs pour l'amplicon/ciblé ; des ajouts optionnels pour la méthylation.
Planification de la couverture: Ajustez la profondeur de lecture longue à la complexité du génome/objectifs de SV ; planifiez la profondeur ciblée pour le ciblage/amplicon ; dimensionnez les lectures/échantillon pour les isoformes ou l'ARN direct.
Critères d'acceptation: Objectifs préétablis pour le rendement par code-barres, fraction conforme, taux de cartographie et profil de longueur de lecture (par exemple, objectifs N50 pour Ultra-Long).
Décisions à l'exécutionUtilisez des tableaux de bord en temps réel pour arrêter/étendre/recharger efficacement ; documentez toute variation dans le mémo du projet.
L'avantage de CD Genomics
1
Ciblage basé sur les applications
Cartographiez votre question biologique au bon service Oxford Nanopore (Ultra-Long, Direct RNA, Transcript complet/lncRNA, Ciblé/Cas9 ou adaptatif, Amplicon, Pore-C, TAIL Iso-Seq).
2
Modélisation de conception et faisabilité
Modélisation de la couverture, équilibre des codes-barres et vérifications de la faisabilité des cibles/amorces avant de vous engager.
3
Analytique reproductible
Pipelines conteneurisés/ verrouillés par version ; emballage de résultats propre avec rapport d'analyse et dictionnaire de données.
4
Efficacité de course en temps réel
Tableaux de bord en direct pour arrêter/étendre/recharger lorsque les objectifs sont atteints ; échantillonnage adaptatif lorsque cela est approprié.
5
Intégrité et sécurité des données
Dossiers structurés, vérification de l'intégrité des données, et transfert sécurisé avec une politique de conservation définie.
6
Soutien de qualité publication
Assistance optionnelle pour les résultats, préparation de figures/tableaux et aide à la rédaction/revue du manuscrit.
7
Neutralité multiplateforme
Orientation objective sur les situations où les stratégies hybrides (courtes lectures + ONT, ou HiFi + ONT) apportent de la valeur.
Exigences d'échantillon
Service
Montant et Intégrité
Pureté
Stockage / Expédition
Notes clés
WGS (Standard)
≥1–3 μg d'ADNg, ≥30 kb
A260/280 1,8–2,0 ; A260/230 ≥2,0
−20°C sur la glace
Fournir une méthode d'extraction ; sans vortexage.
WGS Ultra-Long
≥3–5 μg d'ADNg HMW, ≥50 kb de préférence
A260/280 1,8–2,0 ; A260/230 ≥2,0
−20°C
Manipulation douce critique ; uniquement des embouts à large diamètre.
Séquençage direct de l'ARN
≥500 ng–1 μg d'ARN poly(A)+ ; RIN ≥7
A260/280 ~2,0 ; A260/230 ≥2,0
−80°C glace carbonique
Ne pas chauffer ni dénaturer avant l'expédition.
Transcription intégrale
≥500 ng–1 μg d'ARN total ; RIN ≥8
A260/280 ~2,0 ; A260/230 ≥2,0
−80°C glace carbonique
Poly(A)+ ou appauvri en rRNA par conception
LncRNA de longueur complète
≥500 ng–1 μg d'ARN total ; RIN ≥7
Identique à ce qui précède.
−80°C glace carbonique
épuisement de l'ARNr ou sélection par poly(A)
Séquençage d'amplicons
≥50–200 ng d'amplicons en pool
PCR propre ; pas de dimères de primers
pack froid à 4°C
Fournir une table de primers et un gène cible.
Ciblé (Cas9/Adaptatif)
≥1–3 μg d'ADNg
A260/280 1,8–2,0
−20°C
Fournissez un fichier BED de la région cible ou une liste de gènes.
Pore-C
≥1–2 μg d'ADNg HMW, ≥50 kb
A260/280 1,8–2,0
−20°C
Manipulation douce ; pas de vortexage
TAIL Iso-Seq
≥500 ng–1 μg d'ARN total ; RIN ≥7
A260/280 ~2,0
−80°C glace carbonique
Sélection de Poly(A)+ requise
Séquençage de nano tRNA
≥500 ng d'ARN total ; RIN ≥7
A260/280 ~2,0 ; A260/230 ≥2,0
−80°C glace carbonique
Fournir une méthode d'enrichissement en tRNA si auto-enrichie.
Longues lectures Amplicon
≥100 ng d'amplicons regroupés ; cible de ≥500 pb
PCR propre ; pas de dimères de primers
pack de froid à 4°C
Fournir un tableau de amorce + coordonnées cibles
Remarques générales
Évitez les inhibiteurs (phénol, héparine, EDTA, polysaccharides) et les cycles répétés de congélation-dégel ; ne desséchez pas excessivement les billes.
Utilisez des embouts à large ouverture et évitez le vortexage pour l'ADN HMW.
Inclure une méthode d'extraction brève et tout contaminant connu.
Des matrices à faible apport/FFPE ou inhabituelles peuvent être réalisables—contactez-nous pour un protocole personnalisé.
Auteurs : Bin Sun, Kaushal Kumar Bhati, Peizhe Song, et al.
Date de publication : 27 septembre 2022
Journal : PLOS Génétique
Question de recherche (Attention):
Quelle enzyme installe m^6A au 3′UTR de l'ARNm du FLOWERING LOCUS C (FLC), et comment cette modification affecte-t-elle la stabilité du transcript FLC et la floraison ?
Approche
Un design multi-omique a intégré le séquençage Direct RNA d'Oxford Nanopore, le mRNA-seq et le meRIP-seq pour profiler l'expression différentielle et la méthylation différentielle de l'ARN dans des plantes de type sauvage par rapport aux mutants FIONA1 (FIO1). Le séquençage Direct RNA a capturé les caractéristiques du signal natif tandis que le meRIP-seq a cartographié les régions enrichies en m^6A ; les preuves combinées ont localisé le site de modification au 3′UTR du FLC.
Principales conclusions:
FIO1 est la méthyltransférase responsable de la m^6A sur l'ARNm FLC dans la région 3′UTR.
La perte de cette méthylation à l'extrémité 3′ dans les mutants fio1 déstabilise l'ARNm FLC (niveaux réduits de FLC) et contribue à un phénotype à floraison précoce.
Les auteurs ont publié des données RNA direct Nanopore (GEO : GSE212766) et des ensembles de données mRNA/meRIP correspondants, soutenant la reproductibilité.
Analyse de séquençage RNA direct.
Ce que cela démontre:
Cette étude évaluée par des pairs montre comment le séquençage d'ARN direct par nanopore, associé à l'analyse des modifications de l'ARN (m^6A), répond à des questions biologiques qui dépendent de l'ARN natif et de la régulation post-transcriptionnelle. C'est un excellent exemple de "technologie de séquençage par nanopore, bioinformatique et applications" pour l'épitrancriptomique et les mécanismes de régulation génique.
Comment CD Genomics définirait l'étendue d'un projet similaire.
ServiceSéquençage d'ARN direct par nanopore (+ meRIP-seq optionnel via un flux de travail partenaire)
Analyseprofilage des isoformes, résumés de signaux associés aux modifications, expression différentielle, intégration avec les pics m^6A basés sur l'immunoprécipitation
Livrables: FASTQ (ARN direct), POD5/FAST5 optionnel, rapport de QC, résumés des modifications, figures/tableaux adaptés à la publication
FAQ — Séquençage Nanopore
À des fins de recherche uniquement, non destiné à un diagnostic clinique, un traitement ou des évaluations de santé individuelles.
Publications
FIONA1-mediated methylation of the 3’UTR of FLC affects FLC transcript levels and flowering in Arabidopsis
Directives de Soumission d'Échantillons
Analyse de séquençage RNA direct.
