Analyse des sites d'intégration lentiviraux/rétroviraux

Introduction à l'analyse des sites d'intégration lentiviraux/rétroviraux

Les vecteurs lentiviraux sont largement reconnus comme les systèmes de livraison de gènes prédominants pour atteindre une modification génétique stable des cellules. Ces vecteurs s'intègrent dans le génome de l'hôte pour faciliter l'expression des transgènes. Bien que le processus d'intégration du génome ARN lentiviral — d'abord transcrit inversement en ADN — soit apparemment aléatoire, la littérature existante indique la présence de points chauds d'intégration. Étant donné le potentiel de l'intégration lentivirale à perturber la fonction cellulaire, en particulier par proximité avec des oncogènes ou des gènes critiques, il est impératif d'identifier les sites d'intégration précis après l'infection. La sélection des sites d'intégration influence de manière significative à la fois l'expression des transgènes et le phénotype des cellules hôtes. Par conséquent, l'analyse des sites d'intégration est un outil essentiel pour évaluer la sécurité de ces vecteurs et surveiller la dynamique clonale des cellules modifiées in vivo.

Notre laboratoire a développé un ensemble avancé de méthodologies pour une analyse complète des sites d'intégration virale. En intégrant des techniques basées sur la PCR et le séquençage avec des pipelines bioinformatiques propriétaires, nous offrons une précision et une sensibilité inégalées dans l'identification des positions des sites d'intégration et la quantification des fréquences des vecteurs viraux. Notre service de bout en bout comprend l'amplification par PCR, la construction de bibliothèques, le séquençage en paires (PE) et une analyse bioinformatique rigoureuse. Nous nous engageons à fournir des données de la plus haute qualité et des rapports analytiques fiables, garantissant des résultats robustes et reproductibles pour nos clients.

Méthodes pour l'analyse intégrative des sites

L'exploration initiale des sites d'intégration virale a utilisé le Southern blotting et des bibliothèques génomiques pour caractériser les caractéristiques des sites d'intégration. Au fil du temps, les techniques de réaction en chaîne par polymérase (PCR) ont remplacé le Southern blotting en raison de leur simplicité et de leur précision. En fonction de la méthodologie PCR utilisée, l'analyse des sites d'intégration virale peut être catégorisée en PCR inverse, PCR médiée par ligation (LM-PCR) et PCR médiée par amplification linéaire (LAM-PCR).

• PCR inversé

La PCR inverse implique la circularisation de fragments d'ADN après digestion enzymatique. Des amorces spécifiques sont ensuite conçues pour amplifier les séquences flanquant le site d'intégration viral. Cependant, la faible efficacité de la circularisation avec la ligase limite son application généralisée.

• LM-PCR

Dans le LM-PCR, l'ADN est fragmenté enzymatiquement, et des adaptateurs sont ligaturés aux deux extrémités des fragments. Des amorces qui reconnaissent à la fois l'ADN viral et les séquences d'adaptateurs fixes sont utilisées pour amplifier les sites d'intégration, déverrouillant ainsi leur information positionnelle. Le LM-PCR se distingue par son principe simple et sa facilité d'utilisation, conservant sa pertinence depuis sa création jusqu'à aujourd'hui.

• LAM-PCR

LAM-PCR commence par l'amplification linéaire de l'ADN, produisant des produits à brin simple. Ces molécules à brin simple sont ensuite soumises à une amplification supplémentaire via LM-PCR. L'introduction de l'amplification linéaire améliore considérablement à la fois la sensibilité et la spécificité de LAM-PCR, la rendant supérieure à la PCR inverse et à la LM-PCR, ce qui conduit à son adoption généralisée.

• Séquençage de nouvelle génération pour l'intégration lentivirale

Actuellement, le séquençage à haute profondeur, ou séquençage de nouvelle génération (NGS), représente la principale plateforme pour détecter les sites d'intégration des lentivirus. La méthode la plus raffinée et largement utilisée pour créer des bibliothèques enrichies pour l'analyse des sites d'intégration dans les applications industrielles et la recherche clinique implique la fragmentation mécanique et la préparation de bibliothèques d'amplicons basée sur des adaptateurs (comme les techniques LM-PCR telles que INSPIIRED). Cette méthodologie a été largement appliquée dans l'évaluation de la sécurité de divers projets cliniques CAR-T19 ainsi que dans des analyses pharmacodynamiques rétrospectives liées à la prolifération des cellules CAR-T.

Avantages de notre service d'analyse des sites d'intégration lentiviraux/rétroviraux

• Techniques d'analyse des sites d'intégration matures.
• Échantillons multiplex pour des résultats rentables.
• Flux de travail efficace et temps de réponse rapide.
• Analyse qualitative et quantitative.
• Analyse bioinformatique complète.
• Plusieurs approches pour atteindre différents objectifs.

Applications de l'analyse des sites d'intégration lentiviraux/rétroviraux

Évaluation de la sécurité

• Éviter la mutagenèse d'insertion
• Suivi des effets à long terme

Recherche en virologie

• Comprendre le cycle de vie viral
• Développement de vaccins et de médicaments antiviraux

Optimisation des modèles animaux transgéniques

• Amélioration de la stabilité et de l'expression
• Réduction des effets indésirables

Médecine régénérative et recherche cellulaire

• Améliorer l'efficacité de la recherche
• Suivi du destin cellulaire

Recherche biologique fondamentale

• Explorer la structure et la fonction du génome
• Enquête sur les réarrangements génomiques

Flux de travail d'analyse des sites d'intégration lentiviraux/rétroviraux

Notre équipe d'experts hautement expérimentés exécute la gestion de la qualité en suivant chaque procédure pour garantir des résultats complets et précis. Notre flux de travail d'analyse des sites d'intégration lentiviraux est décrit ci-dessous, y compris la préparation de la bibliothèque, le séquençage et l'analyse bioinformatique.

Spécifications du service

	Exigences d'échantillon échantillon d'ADNg ≥ 500 ng Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégie de séquençage Plateforme Illumina Hiseq/NovaSeq PE150 Pour la méthode LM-PCR (adaptée aux échantillons avec des séquences LTR connues) : construire une bibliothèque avec une taille d'insertion de 400 à 600 pb ; sortie de données de 1 Go. Pour la méthode WGS (uniquement adaptée aux lignées cellulaires monoclonales) : construire une bibliothèque de 350 pb, ~50X de couverture.
	Analyse bioinformatique Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Contrôle de la qualité des données Alignement au génome de référence et séquences d'insertion Détection de site d'intégration Annotation de site d'intégration Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur l'analyse des sites d'intégration lentiviraux/rétroviraux pour votre rédaction (personnalisation)

Le service d'analyse des sites d'intégration lentivirale de CD Genomics utilise la puissance de la plateforme Illumina pour la détection des sites d'intégration et a développé une approche à faible coût et à haut débit en utilisant le séquençage par enrichissement ciblé ou la méthode LM-PCR. Nous sommes ravis d'utiliser notre vaste expérience et notre plateforme avancée pour offrir le meilleur service et les produits les plus qualifiés afin de satisfaire chaque demande de nos clients.

Référence

1. Dawes JC, Webster P, Iadarola B, et al. LUMI-PCR : un protocole de PCR médiée par ligation sur plateforme Illumina pour le clonage de sites d'intégration, fournit une quantification moléculaire des sites d'intégration. ADN de la mafia. 2020 ; 11:7.

Les résultats partiels sont affichés ci-dessous :

1. Qu'est-ce que l'analyse du site d'intégration des lentivirus/retrovirus ?

L'analyse des sites d'intégration des lentivirus/retrovirus est une technique sophistiquée utilisée pour examiner comment les génomes des lentivirus et des retrovirus s'intègrent dans le génome des cellules hôtes. En identifiant et en cartographiant ces sites d'intégration, les chercheurs obtiennent des informations cruciales sur les mécanismes d'intégration virale, évaluent la sécurité des vecteurs et surveillent le comportement in vivo des cellules transgéniques.

2. Pourquoi l'analyse du site d'intégration est-elle nécessaire ?

L'analyse du site d'intégration est essentielle pour évaluer la sécurité des vecteurs viraux. Elle garantit que ces vecteurs ne s'insèrent pas dans des régions critiques du génome de l'hôte, ce qui pourrait potentiellement déclencher une oncogenèse ou d'autres troubles génétiques. De plus, cette analyse aide les chercheurs à comprendre les préférences et les mécanismes de l'intégration virale, fournissant ainsi un soutien essentiel pour le développement d'approches basées sur des vecteurs plus sûres et plus efficaces.

3. Quelles sont les étapes de base de l'analyse d'intégration du site ?

La procédure fondamentale pour l'analyse des sites d'intégration lentiviraux/rétroviraux comprend les étapes suivantes :

• Infection des cellules ciblesInfecter les cellules cibles avec le vecteur viral.
• Isolation de l'ADN génomique: Extraire l'ADN génomique des cellules infectées.
• Digestion par des enzymes de restrictionDigérez l'ADN génomique isolé à l'aide d'endonucléases de restriction.
• Ligation des séquences d'adaptateursLiguez les séquences d'adaptateurs aux fragments d'ADN digérés.
• Amplification par PCRRéalisez une amplification PCR pour enrichir les fragments d'ADN contenant des sites d'intégration virale.
• Construction de bibliothèque: Construire des bibliothèques de séquençage à partir des produits PCR enrichis.
• Séquençage à haut débit: Conduite séquençage à haut débit, comme le séquençage Illumina.
• Identification de site pour l'analyse et l'intégration des donnéesAnalyse les données de séquençage pour identifier et caractériser les sites d'intégration virale.

4. Quels outils et techniques sont nécessaires ?

L'analyse du site d'intégration implique généralement les outils et techniques suivants :

• Endonucléases de restrictionEnzymes utilisés pour digérer l'ADN génomique à des séquences spécifiques.
• Amplification par PCRTechniques pour l'amplification sélective de séquences d'ADN contenant des sites d'intégration virale.
• Ligation d'adaptateurLa méthode d'attachement de séquences d'adaptateurs aux fragments d'ADN pour faciliter le séquençage.
• Séquençage à haut débitDes plateformes telles que le séquençage Illumina pour générer d'importantes données de séquence.
• Outils d'analyse en bioinformatiqueLogiciels et algorithmes pour l'alignement de séquences (par exemple, BLAST, Bowtie) et l'analyse de données (par exemple, R, Python) pour élucider les emplacements des sites d'intégration et leurs caractéristiques.

Détection des sites d'intégration à l'échelle du génome utilisant le séquençage à longue portée sans amplification enrichi par Cas9.

Journal : Recherche sur les acides nucléiques
Facteur d'impact : 8,278
Publié : 22 février 2021

Contexte

Les vecteurs de livraison de gènes, en particulier les lentivirus, sont utilisés pour insérer du matériel génétique dans les cellules. Les avancées dans la technologie des vecteurs et les méthodes de séquençage ont amélioré leur sécurité et leur précision. De nouvelles techniques comme le séquençage Nanopore MinION permettent une cartographie précise des sites d'intégration des vecteurs, améliorant notre compréhension de leurs effets.

Matériaux et Méthodes

Résultats

L'analyse des sites d'intégration révèle que les vecteurs lentiviraux s'intègrent de manière aléatoire dans différents modèles cellulaires et espèces. La plupart des intégrations se produisent dans des régions géniques, avec une préférence pour les introns par rapport aux exons, mais ne montrent aucun schéma significatif ou chevauchement entre les différents types de vecteurs ou lignées cellulaires. Cette randomité indique que les vecteurs lentiviraux ne ciblent pas des régions génomiques spécifiques, suggérant une distribution large sans biais envers les oncogènes.

Figure 1. Analyse positionnelle des systèmes d'information identifiés.

Figure 2. Identification de plusieurs sites d'intégration (MIS).

Conclusion

La méthode utilisée dans cette étude détecte les sites d'intégration lentivirale sans amplification de l'ADN, en utilisant Cas9 pour attacher des adaptateurs pour le séquençage Nanopore à longues lectures. Cette approche fournit des résultats plus rapides que les méthodes traditionnelles et évite les biais liés à la PCR. Elle offre une cartographie détaillée des sites d'intégration avec de longues lectures, bien qu'elle nécessite plus d'ADN et puisse manquer certains sites en raison de l'apport élevé requis. La méthode peut également être adaptée à d'autres analyses génomiques et révèle des détails génétiques supplémentaires non capturés par les méthodes actuelles.

Référence

1. van Haasteren J, Munis AM, Gill DR, et al. Détection des sites d'intégration à l'échelle du génome utilisant le séquençage long-range sans amplification enrichi par Cas9. Recherche sur les acides nucléiques. 2021, 49(3): e16-.