Séquençage des circARN

Pour soutenir l'émergence récente de la recherche sur les ARN circulaires (circRNA), CD Genomics propose un service de séquençage de circRNA qui utilise les dernières plateformes Illumina pour une caractérisation rapide, économique et précise.

L'introduction du séquençage des circARN

Les circARN sont un nouveau membre des ARN non codants (ARNnc), générés par un épissage inversé non séquentiel des exons, des introns ou des deux. Ils se caractérisent par une boucle fermée covalente, manquant ainsi de coiffe 5' et de queues poly-A 3'. Les circARN sont des formes d'ARNnc hautement stables en raison de leurs propriétés de résistance aux nucléases. Lorsqu'ils ont été identifiés pour la première fois dans les années 1970, les circARN étaient considérés comme des génomes viraux ou des sous-produits d'événements d'épissage erronés. Mais les recherches récentes ont révélé que les circARN sont évolutivement conservés chez les plantes, les animaux et les êtres humains, et que les circARN ont des fonctions biologiques importantes.

Les circARN peuvent agir comme des éponges à miARN et remplir une fonction régulatrice dans l'expression génique. Fait remarquable, une large gamme de circARN est exprimée de manière anormale dans des contextes de maladies spécifiques, ce qui suggère leur association avec l'apparition et le développement de maladies humaines. Les circARN remplissent également de multiples fonctions dans les processus cellulaires, y compris des modèles pour la traduction, la régulation de l'épissage alternatif et de l'expression génique, des échafaudages pour l'assemblage de complexes protéiques, et des modulateurs de la biogenèse des ARN ribosomiques et des ARN de transfert. De plus, ils peuvent être utilisés pour stimuler l'activation immunitaire à des fins thérapeutiques antivirales en raison de leur intervention dans la régulation immunitaire et l'infection virale.

La détection complète des circARN à partir de données de transcriptome à haut débit est une étape initiale et cruciale pour étudier leur biogenèse et leur fonction. Le séquençage à haut débit L'utilisation de l'ARNr/ARN linéaire appauvri en combinaison avec des outils informatiques a conduit à l'identification de milliers de nouvelles circARN et à l'analyse de leurs transcrits hôtes linéaires de manière quantitative dans divers organismes. Contrairement aux miARN et autres petits ARN, les circARN ne sont pas facilement séparés des autres espèces d'ARN par taille ou mobilité électrophorétique. Par conséquent, ils sont généralement retenus dans des bibliothèques appauvries en ARNr et enrichis dans des bibliothèques traitées avec RNase R qui ne digère que l'ARN linéaire.

Avantages du séquençage des circARN

• Identifie des circARN connus et nouveaux
• Permet le profilage des circARN sur une large gamme dynamique.
• Explore de nouveaux biomarqueurs et des réseaux de régulation des circARN.

Applications du séquençage des circRNA

Le séquençage des circRNA peut être utilisé pour, mais sans s'y limiter, les recherches suivantes :

• L'étude des mécanismes pathogènes de maladies telles que le cancer ;
• Explorer les changements de régulation de l'expression génique pendant la croissance et le développement ;
• Recherche d'autres aspects liés à la transcription des gènes et à la régulation de l'expression.

Flux de travail de séquençage des circRNA

Le flux de travail général pour le séquençage des circRNA est décrit ci-dessous. Pour construire une bibliothèque de séquençage de circRNA, la première étape consiste à éliminer l'ARNr, suivie de la digestion de l'ARN linéaire et de la préparation de la bibliothèque spécifique à un brin. Notre équipe d'experts hautement expérimentés exécute la gestion de la qualité, suivant chaque procédure pour garantir des résultats fiables et impartiaux.

Spécification de service

	Exigences d'échantillon ARN total ≥ 5 μg, Quantité minimale : 2 μg, Concentration ≥ 50 ng/µl Cellules ≥ 2×106 Tissu ≥ 500 mg, Quantité minimale : 100 mg OD A260/A280 ratio ≥ 1,8, A260/230 ratio ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Tous les échantillons d'ARN total doivent être dépourvus d'ADN. L'ARN doit être conservé dans de l'eau sans nucléase ou dans RNA Stable. Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégies de séquençage Préparation de bibliothèque spécifique à un brin Illumina HiSeq PE150 Plus de 80 % des bases avec un score de qualité ≥Q30
	Analyse des données Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Contrôle de la qualité des données brutes Cartographie basée sur des références Identification et annotation des circRNA Analyse de l'expression des circRNA connus et nouveaux Analyse de l'expression différentielle, analyse d'enrichissement et analyse fonctionnelle Analyse de l'origine des circRNA, y compris la prédiction des miRNA cibles et l'analyse du réseau d'interaction circRNA-miRNA. Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage des circARN pour votre rédaction (personnalisation)

Soutenu par nos scientifiques expérimentés et une technologie avancée, CD Genomics peut vous aider à acquérir les informations de séquence circRNA avec une résolution à base unique en une seule fois grâce au séquençage à haut débit par un contrôle qualité strict et des analyses bioinformatiques avancées. Si vous avez des exigences ou des questions supplémentaires, n'hésitez pas à contactez-nous.

Référence :

1. Wang M, Yu F, Wu W, et al.ARN circulaires : un nouveau type d'ARN non codant et leurs implications potentielles dans l'immunité antivirale. Revue internationale des sciences biologiques, 2017, 13(12) : 1497.

Résultats de la démo

Des résultats partiels sont présentés ci-dessous :

Distribution de la qualité de séquençage

Distribution A/T/G/C

Interface du navigateur IGV

Analyse de corrélation entre les échantillons

Graphique des scores PCA

Diagramme de Venn

Graphique en volcan

Résultats statistiques de l'annotation GO

Classification KEGG

FAQ sur le séquençage des circRNA

1. Comment est généré le circRNA ?

Les circARN sont généralement générés par le rétro-épissage des exons dans un ordre non séquentiel. La circularisation de l'ARN peut être générée par des séquences répétitives pour faciliter le rétro-épissage des exons non séquentiels.

Figure 1. Biogenèse des circRNA (Fischer & Leung 2016).

2. Pourquoi utiliser la technologie de haut débit pour analyser les circARN plutôt que les microarrays ?

Séquençage à haut débit est une méthode qui permet d'économiser du temps et des coûts, avec de nombreux avantages par rapport à l'ADN. microarrays.

i. Détection de nouveaux transcrits. Les microarrays dépendent de l'hybridation avec des sondes spécifiques à des espèces ou à des transcrits qui sont limitées aux circARN connus. Cependant, Séquençage de l'ARN peut détecter des transcrits nouveaux, des fusions géniques, des variants de nucléotides uniques, de petites insertions et suppressions, ainsi que d'autres changements auparavant inconnus.

ii. Plage dynamique plus large. Les microarrays sont limités par le bruit de fond à l'extrémité inférieure et la saturation du signal à l'extrémité supérieure, tandis que le séquençage d'ARN peut quantifier des comptes de lecture de séquençage discrets et numériques, offrant une plage dynamique plus large.

iii. Sensibilité et spécificité accrues. Comparé aux microarrays, le séquençage de l'ARN offre une sensibilité et une spécificité accrues, permettant une détection améliorée des gènes, des transcrits et de l'expression différentielle.

iv. Détection des transcrits de faible abondance et rares. La profondeur de couverture du séquençage peut facilement être augmentée pour la détection de transcrits rares, de transcrits uniques par cellule ou de gènes faiblement exprimés.

3. Y a-t-il des conseils pour construire un vecteur d'expression de circRNA ?

Oui. Des séquences pour la circularisation et des séquences qui activent la circularisation sont nécessaires pour construire un vecteur d'expression de circRNA portant des circRNAs.

Référence :

1. Fischer J W, Leung A K L. CircARNs : un régulateur du stress cellulaire. Revues critiques en biochimie et biologie moléculaire, 2017, 52(2) : 220-233.

Études de cas sur le séquençage des circARN

CircHLA-C joue un rôle important dans la néphrite lupique en absorbant miR-150.

Journal : Thérapie Moléculaire : Acide Nucléique
Facteur d'impact : 6,392
Publié : 12 janvier 2018

Résumé

Les ARN circulaires participent à la pathogénie de plusieurs maladies en agissant comme miARNs éponges. Les études précédentes ont rapporté que le miR-150 était positivement corrélé avec l'indice de chronicité rénale chez les patients atteints de néphrite lupique (LN). Les auteurs ont ensuite étudié le profilage des circRNA rénaux et l'interaction entre les circRNA et le miR-150 chez les patients atteints de LN. bioinformatique L'analyse a prédit que miR-150 était régulé par circHLA-C et que circHLA-C jouait probablement un rôle important dans la pathogénèse du LN en absorbant miR-150.

Matériaux et Méthodes

Résultats

1. Profilage et caractéristiques des circARN dans les biopsies rénales des patients atteints de LN

Un total de 18505 transcrits circRNA ont été identifiés, dont 11411 circRNAs régulés à la hausse et 7094 circRNAs régulés à la baisse. La carte thermique de clustering hiérarchique a montré que les niveaux d'expression des circRNAs étaient regroupés entre les biopsies rénales LN et les reins témoins normaux. 171 circRNAs ont été trouvés pour exprimer différemment de manière significative entre le groupe LN et le groupe témoin normal.

Figure 1. Profilage et caractéristiques des circARN. (A) Carte thermique groupée. Le rouge représente les circARN surexprimés et le vert représente les circARN sous-exprimés. (B) Diagramme en volcan. (C-F) Les caractéristiques des circARN différemment exprimés.

2. Le réseau d'interaction CircARN/miARN

Le réseau d'interaction CircRNAs/miRNAs a été prédit par des séquences de correspondance de graines conservées. Il a révélé que les 40 circRNAs contenaient tous leurs éléments de réponse aux miRNAs (MREs) respectifs. Les cinq principaux miRNAs régulés par chacun des 40 circRNAs ont été affichés sous forme de réseau (Figure 2).

Figure 2. Le réseau d'interaction entre les circARN et les miARN.

3. Prédiction des fonctions et des voies

Les fonctions des circARNs différemment exprimés ont été prédites par l'analyse de GO et de KEGG. L'analyse d'enrichissement GO a révélé que les rôles fonctionnels des gènes hôtes cibles étaient liés aux processus biologiques, aux composants cellulaires et aux fonctions moléculaires. L'analyse KEGG a trouvé 23 voies liées aux fonctions de 142 circARNs surexprimés, et à la fois la voie de signalisation du facteur inductible par l'hypoxie-1 (HIF-1) et la voie de signalisation des neurotrophines ont participé à la régulation de l'expression de NF-kB.

Figure 3. Fonctions prédites des circARNs surexprimés dans le LP.

4. Interaction entre circHLA-C et miR-150

CircHLA-C était positivement corrélé avec les paramètres d'activité de la maladie LN. Et miR-150 a montré une tendance à une corrélation négative avec circHLA-C (Figure 4).

Figure 4. L'interaction entre le circHLA-C rénal et le miR-150 dans le LN.

Conclusion

Les auteurs ont identifié 171 circARN exprimés de manière différentielle et validé sept circARN significativement régulés à la hausse dans les reins des patients atteints de LN de classe IV, avec circHLA-C corrélant positivement avec l'activité de la maladie LN. circHLA-C était significativement augmenté tandis que miR-150 était diminué, affichant une corrélation négative et une correspondance parfaite de la séquence de liaison. L'étude a également fourni le premier profilage des circARN rénaux et un réseau d'interaction entre les circARN et les miRs dans la LN.

Référence :

1. Luan J, Jiao C, Kong W, et al.circHLA-C joue un rôle important dans la néphrite lupique en absorbant miR-150. Thérapie Moléculaire-Acides Nucléiques, 2018, 10 : 245-253.