Directives de Soumission d'Échantillons
L'analyse du site d'intégration devrait aller au-delà d'une liste de coordonnées.
Un tableau de coordonnées peut vous indiquer où se trouve une insertion candidate. Il ne montre pas toujours comment le vecteur se connecte au génome hôte, si la jonction a suffisamment de soutien de lecture, si la séquence insérée est partielle ou réarrangée, ou si le motif change d'un échantillon à l'autre.
Pour de nombreux projets, ces détails sont la raison pour laquelle l'analyse est importante. Les échantillons AAV, lentiviraux, rétroviraux, CAR-T et d'ingénierie génomique peuvent contenir des motifs d'intégration qui nécessitent plus qu'une simple sortie d'alignement standard. Votre équipe peut avoir besoin d'examiner le point de rupture du côté de l'hôte, le point de rupture du côté du vecteur, l'orientation, le contexte des gènes voisins, le soutien des lectures et si l'insertion semble simple ou complexe.
Pourquoi les coordonnées génomiques ne sont que le point de départ.
Les coordonnées génomiques sont essentielles, mais elles ne constituent pas la réponse complète. Une coordonnée peut identifier un site d'intégration candidat ; les preuves environnantes déterminent à quel point ce site est utile pour l'interprétation.
Un livrable plus solide devrait relier le coordonné à :
- Emplacement du génome hôte
- Position de séquence vectorielle ou de breakend
- Séquence de jonction
- Soutien de niveau lecture
- Annotation des gènes ou des caractéristiques génomiques à proximité
- Distribution au niveau des échantillons lorsque plusieurs échantillons sont comparés
- Revue de la structure d'insertion lorsque soutenue par les données.
C'est pourquoi notre flux de travail est construit autour d'une interprétation consciente de l'intégration, et pas seulement d'une liste de sites.
Pourquoi les jonctions hôte-vecteur ont besoin de preuves au niveau de la lecture
Les jonctions hôte-vecteur sont souvent la partie la plus informative d'une analyse d'intégration. Une séquence de jonction peut montrer comment le vecteur inséré ou la séquence modifiée se connecte au génome hôte.
Le séquençage à lecture longue peut apporter de la valeur lorsque les lectures couvrent les frontières hôte-vecteur ou fournissent un contexte plus long autour d'une insertion. Cela aide à la révision des jonctions, à l'évaluation de la structure des insertions et à la visualisation. Les méthodes à lecture courte ou ciblées peuvent encore être précieuses pour la profondeur de découverte des sites, mais elles nécessitent souvent une analyse complémentaire lorsque la question de recherche dépend de l'architecture des insertions.
Lorsque la structure d'insertion compte plus que le nombre de sites
Certaines études nécessitent principalement la distribution des sites d'intégration. D'autres doivent comprendre la forme d'insertion. Un projet peut avoir besoin d'examiner l'insertion partielle de vecteurs, le réarrangement de vecteurs, des structures de type concatémère, des jonctions multiples ou des motifs d'insertion complexes.
Dans ces cas, compter les sites ne suffit pas. Le projet a besoin d'une stratégie qui relie la découverte de sites à la structure d'insertion, au support de niveau de lecture et à l'annotation.
Ce que les longues lectures apportent à l'analyse des jonctions hôte-vecteur
Le séquençage à lecture longue n'est pas un substitut à chaque méthode de site d'intégration. Sa valeur est la plus forte lorsque la question nécessite un contexte structurel.
Les approches de séquençage à lecture courte, LAM-PCR, PCR ciblée et enrichissement de cibles peuvent soutenir la découverte de sites d'intégration et l'analyse de leur distribution. Le séquençage à lecture longue devient particulièrement utile lorsque le projet nécessite des lectures plus longues à travers les jonctions hôte-vecteur, la longueur d'insertion, les motifs de recombinaison ou l'architecture d'insertion complexe.
Méthodes de séquençage à court terme pour une profondeur de découverte de sites plus élevée
Les méthodes de séquençage à court read peuvent être utiles lorsque la priorité est de détecter un plus grand nombre de sites d'intégration candidats à travers les échantillons. Dans certains designs, le séquençage par enrichissement de cibles à court read peut offrir une couverture plus profonde par base et soutenir la découverte de sites d'intégration.
Cela peut aider lorsque la question principale concerne le nombre de sites, la distribution génomique ou la comparaison d'échantillon à échantillon. Cependant, les lectures courtes peuvent fournir un contexte limité pour les séquences insérées longues, les fragments de vecteur réarrangés ou les structures à multi-jonction.
Méthodes de lecture longue pour le contexte de jonction et l'architecture d'insertion
Les longues lectures peuvent montrer davantage de la connexion hôte-vecteur dans une seule molécule. Cela peut soutenir l'interprétation au niveau des jonctions, la révision des extrémités de rupture du vecteur, l'estimation de la longueur d'insertion et l'analyse de structures complexes lorsque la qualité des données et la conception du flux de travail sont appropriées.
Quand l'enrichissement ciblé ou les preuves hybrides sont utiles
Les événements d'intégration peuvent être de faible fréquence ou difficiles à capturer. L'enrichissement ciblé peut aider à concentrer le séquençage sur des régions liées aux vecteurs ou aux jonctions. Une stratégie hybride peut également être utile lorsque le projet nécessite à la fois une profondeur de découverte de sites et un contexte structurel.
Nous vous aidons à décider si le projet doit privilégier la profondeur de lecture courte, la structure de lecture longue, l'enrichissement ciblé ou une stratégie d'évidence combinée.
Cas d'utilisation que nous prenons en charge : AAV, lentiviral, CAR-T et ingénierie génomique.
Différents systèmes de vecteurs et modèles cellulaires ingénierés nécessitent des logiques d'analyse différentes. Nous concevons le flux de travail en fonction du type de vecteur, du génome hôte, du contexte de l'échantillon et de la question à laquelle votre équipe doit répondre.
Recherche sur le site d'intégration des AAV et la jonction hôte-vecteur
L'analyse de l'intégration des AAV peut nécessiter une attention particulière à la séquence du vecteur, aux extrémités de rupture liées aux ITR, au contexte du vecteur épisomal, aux fragments partiels du vecteur et aux formes réarrangées du vecteur. Le séquençage à lecture longue peut être utile lorsque le projet nécessite la structure des jonctions, la longueur d'insertion ou le contexte de recombinaison.
Pour les projets axés sur l'AAV, notre Analyse des sites d'intégration des AAV peut être considéré comme un service lié au cœur. Lorsque le génome vecteur lui-même nécessite également une révision, Séquençage du génome AAV peut être inclus en tant que module connexe.
Cartographie des sites d'intégration lentiviraux et rétroviraux
Les systèmes lentiviraux et rétroviraux sont largement utilisés dans la recherche sur les cellules modifiées par des gènes. Le cartographie des sites d'intégration peut être utilisée pour étudier la distribution génomique, la proximité des gènes, le soutien des lectures et les motifs au niveau des échantillons.
Notre Analyse des sites d'intégration lentiviraux/viraux rétro. peut soutenir des projets nécessitant l'intégration de tables de site, l'hébergement d'annotations génomiques, des preuves de lecture et des sorties prêtes pour la visualisation.
Détection des sites d'intégration CAR-T in vivo
Pour les échantillons de recherche sur les cellules CAR-T in vivo et modifiées par des gènes, la détection des sites d'intégration peut devoir tenir compte des populations cellulaires hétérogènes, de la diversité des jonctions vecteur-hôte et des schémas d'intégration d'un échantillon à l'autre.
Pour ce cas d'utilisation, nous maintenons l'analyse axée sur les échantillons de recherche, les preuves de jonction hôte-vecteur, la distribution des sites d'intégration, la comparaison au niveau des échantillons et l'annotation. La portée doit suivre le plan d'étude et les preuves disponibles.
Insertion de CRISPR, insertion de transposons et jonctions d'ingénierie génomique
L'analyse consciente de l'intégration peut également soutenir des questions d'ingénierie génomique. Un projet peut avoir besoin d'examiner les jonctions de knock-in CRISPR, les motifs d'insertion de modèles, les sites d'insertion de transposons ou des jonctions inattendues après l'édition.
Lorsque c'est pertinent, Validation des effets hors cible de CRISPR et Édition et séquençage du génome peuvent être considérés comme des modules connexes.
Suivi unicellulaire ou spatial uniquement lorsque le design de l'étude le justifie.
Les technologies à cellule unique et spatiales peuvent être utiles pour des questions liées à l'état cellulaire ou au contexte tissulaire, mais elles ne sont pas des méthodes principales pour la découverte de sites d'intégration. Nous ne recommandons que Séquençage d'ARN à cellule unique ou Service de séquençage transcriptomique spatial 10x en tant que suivi optionnel lorsque le projet soulève une question crédible concernant le contexte des types cellulaires, l'état d'expression ou la distribution tissulaire.
Cela maintient le flux de travail du site d'intégration ancré dans la question d'insertion tout en permettant un suivi multi-omique lorsque cela apporte réellement de la valeur.
Capacités de service pour les projets d'intégration à long terme
Un projet d'intégration de site solide nécessite plus que du séquençage. Il a besoin d'informations sur le vecteur, d'un contexte de référence de l'hôte, de métadonnées d'échantillon, d'une stratégie de séquençage ou d'enrichissement appropriée, et d'une bioinformatique consciente de l'intégration.
Revue des références des vecteurs et des hôtes
Avant de recommander un flux de travail, nous examinons le type de vecteur, la séquence du vecteur, l'espèce hôte, le génome de référence de l'hôte, le type d'échantillon, le contexte d'intégration attendu et l'objectif de recherche.
Cette information nous aide à déterminer si le projet doit se concentrer sur la découverte de sites, la structure des jonctions, la forme d'insertion, la comparaison de distribution ou la bioinformatique personnalisée.
Modules d'intégration AAV et lentiviraux / rétroviraux
Pour des projets spécifiques aux vecteurs, nous pouvons connecter la solution aux modules d'intégration de base tels que l'analyse d'intégration AAV et l'analyse des sites d'intégration lentiviraux / rétroviraux.
Ces modules peuvent être adaptés en fonction du type d'échantillon, de la séquence du vecteur, du génome hôte et des livrables en aval.
Options de séquençage à long lecteur PacBio et Nanopore
Le séquençage à lecture longue peut être ajouté lorsque la question de recherche nécessite un contexte de jonction plus long ou un examen de la structure d'insertion. Séquençage SMRT PacBio peut être utile lorsque la précision élevée des consensus de longues lectures est importante. Séquençage par nanopore peut être utile lorsque le profilage de structures longues et flexibles est nécessaire.
La meilleure plateforme dépend de la qualité de l'ADN, de la conception de l'enrichissement ciblé, des besoins en longueur de lecture, du profil d'erreur, de la complexité de la séquence hôte/vecteur et des objectifs d'analyse en aval.
Analyse de données longue lecture et bioinformatique consciente de l'intégration
Les données de séquençage longue lecture ne deviennent utiles que lorsqu'elles sont interprétées correctement. CD Genomics fournit Service d'analyse des données de séquençage à lecture longue, Analyse des données génomiques, et Bioinformatique prise en charge de la cartographie hôte/vecteur, appel de jonction, révision des preuves de lecture, annotation et visualisation prête pour le rapport.
L'objectif est d'aider votre équipe à comprendre ce que les preuves d'intégration montrent, et non simplement à recevoir des données brutes.
Stratégie technologique : lecture courte, ciblée, longue ou hybride ?
La méthode appropriée dépend de la question. Certains projets nécessitent une grande profondeur de découverte du site. D'autres ont besoin d'une structure de jonction ou d'une architecture d'insertion. Certains nécessitent les deux.
| Stratégie | Question de meilleur ajustement | Forces | Limitations | Valeur de la structure de jonction | Les besoins en bioinformatique | Livrables typiques |
|---|---|---|---|---|---|---|
| Analyse d'intégration des lectures courtes | Découverte de sites, distribution, proximité des gènes, comparaison d'échantillons | Détection de site à haute profondeur et évolutive, utile pour une analyse de distribution large. | Contexte d'insertion à longue portée limité | Modéré ; dépend de la conception de lecture et du support de jonction. | Coordonner les appels, l'annotation, la révision du support de lecture. | Table du site d'intégration, annotation des gènes/proximité, comptes de lecture |
| LAM-PCR / méthodes basées sur la PCR ciblée | Découverte de jonctions connues ou enrichies | Enrichissement ciblé, utilisation établie dans la cartographie d'intégration | Un biais d'amplification et un contexte limité peuvent se produire. | Limité aux régions de jonction capturées | Interprétation consciente du primer/enrichissement | Sites candidats, lectures de jonction, annotation |
| Séquençage par enrichissement ciblé | Découverte associée aux vecteurs ou axée sur les jonctions | Améliore la concentration sur les régions pertinentes | La performance dépend de la conception de la capture et de la qualité de l'échantillon. | Plus puissant lorsqu'il est associé à de longues lectures. | Contrôle qualité de l'enrichissement, cartographie hôte/vecteur, appel de jonction | Résumé de lecture enrichi, sites candidats, preuves de jonction |
| Séquençage à lecture longue PacBio | Séquence de jonction, contexte d'insertion, preuve de lecture longue à fort consensus | Preuves approfondies avec un fort potentiel de consensus | Nécessite un ADN approprié et un design de projet. | Élevé lorsque les lectures traversent des jonctions ou des structures d'insertion. | Traitement des longues lectures, révision des lectures fractionnées, classification de la structure | Résumé de la séquence de jonction, support de lecture, structure d'insertion |
| Séquençage à long brin par nanopore | Profilage flexible des jonctions et structures à longues lectures | Les longues lectures peuvent capturer un contexte d'insertion plus large. | Le profil d'erreur et la couverture doivent être examinés attentivement. | Élevé lorsque les lectures prennent en charge la structure hôte-vecteur. | Traitement conscient de l'ONT, révision des jonctions, visualisation | Diagrammes de jonction, graphiques de structure, tableaux d'intégration |
| Stratégie hybride de lectures courtes et longues | Profondeur de découverte du site plus contexte de structure | Combine des couches de preuves complémentaires. | Nécessite une intégration des données soigneuse. | Élevé lorsque les deux types de données prennent en charge le même événement. | QC multiplateforme, annotation intégrée, conception de rapports | Table de site intégrée, preuves de jonction, résumé de la structure |
| Suivi unicellulaire / spatial | Suivi par type cellulaire ou contexte tissulaire après analyse d'intégration | Ajoute une expression ou un contexte spatial lorsque cela est justifié. | Pas une méthode de découverte d'intégration primaire. | Indirect ; dépend du design de l'étude | Interprétation multi-omique et contrôle rigoureux de la portée | Résumé des états cellulaires ou des contextes tissulaires lorsqu'ils sont inclus. |
Une stratégie équilibrée peut utiliser des méthodes de séquençage à court terme ou ciblées pour la profondeur de découverte et le séquençage à long terme pour le contexte structurel. Nous vous aidons à décider quelle couche de preuves convient à votre projet.
Flux de travail de l'examen d'échantillon à l'interprétation de la jonction
De la révision des vecteurs et des échantillons à l'appel de jonction, à l'analyse des structures d'insertion, à l'annotation et au rapport final.
Un flux de travail d'analyse d'intégration utile devrait relier les informations sur les échantillons, la séquence du vecteur, le contexte de référence de l'hôte, la conception du séquençage, l'appel des jonctions, l'annotation et le rapport final.
Nous commençons par examiner le type de vecteur, la séquence de vecteur, l'espèce hôte, le génome de référence de l'hôte, le type d'échantillon, le regroupement des échantillons et l'objectif de recherche. Cela aide à définir si le projet est axé sur l'intégration d'AAV, l'intégration lentivirale/rétrovirale, les échantillons de recherche CAR-T in vivo, les jonctions de knock-in CRISPR, l'insertion de transposons ou un autre contexte d'ingénierie génomique.
Nous examinons ensuite la qualité de l'ADN, la complexité de l'échantillon, les intrants disponibles, les préoccupations concernant l'abondance des cibles et si un enrichissement peut être nécessaire. Les événements à faible fréquence ou hétérogènes peuvent nécessiter une stratégie plus ciblée.
Les lectures sont traitées en tenant compte des références hôte et vecteur. Les lectures séparées hôte-vecteur, les lectures associées au vecteur, les points de rupture candidats et les motifs de cartographie sont examinés avant le rapport en aval.
Les sites d'intégration des candidats sont examinés avec des coordonnées génomiques, une séquence de jonction, des informations sur les points de rupture du vecteur, un soutien au niveau des lectures et une annotation. Lorsque les données le permettent, l'examen de la structure d'insertion peut inclure une insertion partielle du vecteur, une séquence de vecteur réarrangée, une insertion de type concatémère ou des motifs de jonction complexes.
Les livrables finaux peuvent inclure des tableaux de site d'intégration, des résumés de séquences de jonction, des fichiers d'annotation, des pistes de navigateur génomique, des diagrammes, des tableaux de soutien de lecture et un rapport de projet.
Exigences d'échantillonnage et informations sur l'intégration du projet
L'analyse du site d'intégration dépend à la fois de l'échantillon biologique et du contexte du projet. La séquence du vecteur, les informations sur le génome de l'hôte, le type d'échantillon et le design de comparaison peuvent fortement influencer le flux de travail.
Les exigences finales dépendent du type de vecteur, de la qualité de l'échantillon, de la disponibilité de la référence hôte, de l'abondance cible, de la stratégie d'enrichissement et des objectifs d'analyse.
| Type d'échantillon ou d'entrée | Ce que nous examinons | Concentration sur la qualité | Informations requises sur le projet | Points de contrôle QC typiques | Remarques |
|---|---|---|---|---|---|
| ADN génomique hôte provenant d'échantillons de recherche traités avec un vecteur | Qualité de l'ADN, espèce hôte, type de vecteur, contexte d'intégration attendu | Adéquation pour l'enrichissement, le séquençage à long terme et l'analyse des jonctions | Référence de l'hôte, séquence vectorielle, regroupement d'échantillons, objectif de recherche. | QC de l'ADN, QC de la bibliothèque, longueur de lecture, cartographie hôte/vecteur, support de jonction | Les exigences finales dépendent du type de vecteur, de la complexité de l'échantillon et de la sélection de la méthode. |
| Échantillons de recherche liés aux AAV | Séquence vectorielle, référence hôte, contexte AAV attendu, regroupement d'échantillons | Revue de capture de jonction et de rupture de vecteur | Séquence du vecteur AAV, génome hôte, étiquettes d'échantillons, conception de l'étude | Revue de l'enrichissement, cartographie hôte/vecteur, revue des jonctions candidates | Utile lorsque le projet nécessite une analyse du site d'intégration AAV ou des jonctions hôte-vecteur. |
| Échantillons de recherche lentiviraux / rétroviraux ou CAR-T | Contexte de la population cellulaire, système vectoriel, type d'échantillon, ADN disponible, conception de comparaison | Hétérogénéité et risque d'événements à basse fréquence | Séquence vectorielle, référence hôte, étiquettes d'échantillons, contexte de recherche in vivo / ex vivo | Contrôle de qualité de l'ADN, performance d'enrichissement, révision du soutien de lecture, résumé au niveau de l'échantillon. | Conservez l'interprétation axée sur les questions de recherche et le design de l'étude. |
| Échantillons de knock-in CRISPR ou d'ingénierie génomique | Locus modifié, donneur ou modèle de vecteur, jonctions attendues, préoccupations concernant les cibles hors cible. | Revue de la spécificité de jonction et de la structure d'insertion | Locus cible, séquence du donneur/vector, référence hôte, conception de l'édition | Lecture de support, cartographie des jonctions, examen des insertions inattendues | Utile lorsque le projet nécessite une jonction knock-in ou l'interprétation des résultats d'édition. |
| Données de séquençage existantes | Fichiers FASTQ/BAM, plateforme, références, analyses antérieures, étiquettes d'échantillons | Compatibilité avec la réanalyse et la bioinformatique consciente de l'intégration | Référence d'hôte, séquence vectorielle, fichiers bruts, notes de workflow antérieures | Vérification de fichier, lecture QC, révision de mappage, révision de jonction candidate | Peut soutenir la réanalyse lorsque la qualité des données et les références sont appropriées. |
Bioinformatique consciente de l'intégration et livrables
L'analyse du site d'intégration devient utile lorsque les lectures sont converties en preuves interprétables. Nous nous concentrons sur les livrables qui aident votre équipe à examiner les coordonnées, les jonctions, le soutien des lectures, la structure d'insertion et le contexte génomique.
Coordonnées du site d'intégration et annotation
La sortie principale est un tableau de sites d'intégration avec des coordonnées génomiques. Lorsqu'il est soutenu par des informations de référence disponibles, le tableau peut inclure le chromosome, la position, le brin, le gène voisin, le contexte intronique/exonique/intergénique, la proximité des gènes et les étiquettes d'échantillon.
Séquence de jonction hôte-vecteur et support au niveau de la lecture
Les livrables au niveau des jonctions peuvent inclure la séquence du côté hôte, la séquence du côté vecteur, la position de rupture du vecteur, les comptes de soutien de lecture et les preuves de lecture représentatives. Cela aide votre équipe à évaluer si un événement dispose de suffisamment de soutien pour l'analyse prévue.
Classification des structures d'insertion
- Junctions hôte-vecteur simples
- Insertion partielle de vecteur
- Insertion de vecteurs réarrangés
- Insertion de type Concatemer
- Schémas d'insertion multi-junction ou complexes
- Résumé des insertions spécifiques à l'échantillon ou au niveau du groupe
Pistes du navigateur génomique, diagrammes et rapports
- Site d'intégration TSV ou CSV
- Table de séquence de jonction
- Lire le tableau de support
- Table d'annotation
- Résumé des breakends vectoriels
- Pistes du navigateur génomique
- Diagrammes de jonction
- Résumé de la structure d'insertion
- rapport de projet au format PDF ou HTML
Choisissez la bonne stratégie pour votre question d'intégration.
Une bonne stratégie commence par la question à laquelle votre équipe doit répondre. Nous vous aidons à décider si votre projet nécessite une profondeur de découverte de site, une structure de jonction, une logique de type vecteur, une comparaison au niveau des échantillons ou une bioinformatique sur mesure.
Choisissez la profondeur de découverte du site lorsque le nombre d'intégrations et la distribution sont centraux.
Si l'objectif principal est d'identifier de nombreux sites candidats et de comparer la large distribution génomique, des méthodes à court lecture ou ciblées peuvent être appropriées.
Ceci est utile lorsque le nombre de sites, la proximité des gènes ou la distribution au niveau des échantillons est plus important que l'architecture complète de l'insertion.
Choisissez des preuves de longue lecture lorsque la structure de jonction est centrale.
Si le projet nécessite une longueur d'insertion, des motifs de recombinaison, un contexte de rupture de vecteur, un examen partiel des insertions ou une analyse des insertions réarrangées, le séquençage à long reads peut apporter des preuves importantes.
Ceci est particulièrement pertinent pour les jonctions complexes et les structures d'insertion qui ne peuvent pas être facilement interprétées à partir de courtes lectures seules.
Ajouter une logique de type vecteur pour les études AAV, lentivirales, rétrovirales ou CAR-T.
Les échantillons de recherche AAV, lentiviraux, rétroviraux et CAR-T in vivo ne doivent pas être considérés comme des types de projets identiques. La séquence du vecteur, la référence hôte, le contexte de l'échantillon, la biologie de l'intégration et les résultats attendus influencent tous le flux de travail.
Nous aidons à faire correspondre la méthode au système vectoriel et à la conception de l'étude.
Ajoutez des bioinformations personnalisées lorsque les lectures brutes ne suffisent pas.
L'analyse des sites d'intégration nécessite souvent un filtrage personnalisé, un examen des lectures divisées hôte-vecteur, une annotation, une visualisation et un reporting. Si votre équipe a besoin de livrables examinables plutôt que de fichiers bruts, la bioinformatique consciente de l'intégration devrait faire partie du plan.
Références
- Comparaison et validation croisée des méthodes de séquençage par enrichissement ciblé à longues et courtes lectures pour évaluer l'intégration des vecteurs AAV dans le génome hôte.
- Comparaison et validation croisée des méthodes de séquençage par enrichissement ciblé à longues et courtes lectures pour évaluer l'intégration des vecteurs AAV dans le génome hôte — article complet
- Cinétique clonale et profilage transcriptionnel unicellulaire des cellules CAR-T chez des patients recevant une immunothérapie CAR-T CD19
- Le séquençage à lecture longue identifie de nouvelles variations structurelles dans les métastases du cancer colorectal.
- Enregistrement complet du texte PMC pour l'étude de séquençage d'enrichissement des cibles AAV 2024
Conformité / Avertissement
CD Genomics fournit ce service uniquement à des fins de recherche (RUO). Ce service n'est pas destiné au diagnostic clinique, à l'interprétation médicale directe, à la surveillance des patients, à l'évaluation de la sécurité clinique, au soutien à la décision thérapeutique, aux tests de libération GMP, aux tests de libération, à la validation réglementaire, aux tests CAR-T de qualité clinique, aux revendications de détection garanties ou aux tests destinés aux consommateurs.
Résultats de la démonstration
Les résultats de la démonstration aident votre équipe à comprendre les types de résultats qui peuvent être inclus dans un projet. Ces exemples montrent des types de résultats, pas des conclusions fixes.
Table du site d'intégration avec annotation
Ce tableau résume les sites d'intégration des candidats avec les coordonnées génomiques, les étiquettes d'échantillon, le soutien de lecture, les informations du côté du vecteur et l'annotation des gènes/proximité.
Diagramme de preuve de lecture de jonction hôte-vecteur
Cette figure montre les lectures s'étendant ou soutenant la jonction entre la séquence du génome hôte et la séquence du vecteur, y compris les alignements de lectures fractionnées et la position de rupture du vecteur.
Structure d'insertion et vue récapitulative au niveau de l'échantillon
Cette sortie résume les formes d'insertion telles que l'insertion de vecteurs partiels, l'insertion réarrangée, la structure de type concatémère ou les motifs de jonction complexes.
FAQ
1. Qu'est-ce qu'une solution d'analyse de site d'intégration à longues lectures ?
C'est un flux de travail axé sur la recherche qui utilise le séquençage et la bioinformatique consciente des intégrations pour identifier les sites d'intégration, analyser les jonctions hôte-vecteur, examiner les structures d'insertion, annoter le contexte génomique et préparer des résultats prêts à être rapportés.
2. Quand l'analyse des sites d'intégration à lecture courte est-elle suffisante ?
L'analyse des lectures courtes peut être appropriée lorsque l'objectif principal est la découverte de sites d'intégration, le comptage des sites, l'analyse de distribution ou l'annotation génique/proximale. Elle peut être moins adaptée lorsque le projet nécessite une structure d'insertion à longue portée ou une architecture de jonction.
3. Quand devrais-je ajouter le séquençage à long-reads ?
Le séquençage à lecture longue peut être utile lorsque votre projet nécessite le contexte des jonctions hôte-vecteur, la longueur du site d'insertion, l'examen des motifs de recombinaison, l'analyse des insertions partielles du vecteur ou l'interprétation de structures d'insertion complexes.
Qu'est-ce qu'une jonction hôte-vecteur ?
Une jonction hôte-vecteur est la frontière de séquence où l'ADN génomique de l'hôte se connecte à une séquence dérivée du vecteur ou conçue. Elle peut fournir des preuves directes de la manière dont une insertion est reliée au génome de l'hôte.
5. Cette solution peut-elle prendre en charge l'analyse des sites d'intégration AAV ?
Oui. Nous pouvons soutenir l'analyse du site d'intégration AAV et de la jonction vecteur-hôte lorsque la séquence du vecteur, la référence de l'hôte, le type d'échantillon et le design de l'étude soutiennent le flux de travail.
6. Cette solution peut-elle prendre en charge le cartographie des sites d'intégration lentiviraux ou rétroviraux ?
Oui. L'analyse des sites d'intégration lentiviraux et rétroviraux peut inclure des coordonnées génomiques, un soutien de lecture, une annotation des gènes/proximité, des résumés au niveau des échantillons et des sorties prêtes pour la visualisation.
7. Cette solution peut-elle soutenir la détection des sites d'intégration CAR-T in vivo ?
Oui. Pour les échantillons de recherche sur les cellules CAR-T in vivo et d'autres cellules modifiées par des gènes, nous pouvons soutenir la détection des sites d'intégration et l'analyse des jonctions hôte-vecteur lorsque la séquence du vecteur, la référence hôte, le type d'échantillon et le design de l'étude soutiennent le flux de travail.
8. L'analyse peut-elle détecter des insertions de vecteurs partielles ou des structures d'insertion réarrangées ?
Il peut prendre en charge l'insertion de vecteurs partiels, l'insertion réarrangée, l'insertion de type concatémère ou la révision de jonctions complexes lorsque la stratégie de séquençage, la longueur des lectures, le design d'enrichissement et la qualité des données fournissent suffisamment de preuves.
9. Quelles informations sur l'échantillon et le vecteur devrais-je fournir ?
Les informations utiles incluent le type d'échantillon, l'espèce hôte, le génome de référence de l'hôte, la séquence du vecteur, le type de vecteur, le regroupement des échantillons, le contexte d'intégration attendu, les données antérieures et l'objectif de recherche.
10. Quels livrables puis-je attendre ?
Les livrables peuvent inclure des tableaux de site d'intégration, des coordonnées génomiques, des résumés de séquences de jonction, des tableaux de support de lecture, des annotations de gènes/proximité, des résumés de cassures de vecteurs, des pistes de navigateur génomique, des diagrammes de jonction, des résumés de structures d'insertion et des rapports de projet.
11. L'analyse unicellulaire ou spatiale peut-elle être ajoutée ?
L'analyse unicellulaire ou spatiale ne peut être envisagée que lorsque le design de l'étude soutient une question de suivi liée au type cellulaire ou au contexte tissulaire. Ces méthodes ne sont pas des méthodes principales de découverte de sites d'intégration.
12. Ce service est-il destiné à l'évaluation de la sécurité clinique ou aux tests de libération ?
Non. Ce service est conçu pour l'analyse de sites d'intégration axée sur la recherche, l'examen des jonctions hôte-vecteur, l'interprétation des structures d'insertion et les livrables en bioinformatique. Il n'est pas destiné à l'évaluation de la sécurité clinique, aux tests de libération, à la surveillance des patients ou à la validation réglementaire.
Cas de littérature : Le séquençage long-reads TES ajoute un contexte structurel à l'analyse de l'intégration des AAV.
Mise en avant de la recherche publiée
Journal : Méthodes de thérapie moléculaire et développement clinique
Publié : 2024
Contexte
L'analyse de l'intégration des vecteurs AAV nécessite souvent à la fois la découverte de sites et l'interprétation structurelle. Les données de courtes lectures peuvent soutenir la quantification des sites d'intégration et l'analyse de leur distribution, mais des lectures plus longues peuvent fournir un contexte supplémentaire concernant la longueur des sites d'intégration, la recombinaison et le réarrangement du vecteur.
Méthodes
L'étude a comparé le séquençage d'enrichissement ciblé à lectures courtes et à lectures longues en utilisant des échantillons de singes traités par AAV, des échantillons traités par lentivirus in vitro, une lignée cellulaire stable et un contrôle de spike-in conçu.
Les chercheurs ont évalué les sites d'insertion, les extrémités de rupture du vecteur et de l'hôte, la représentation de la séquence du vecteur et les schémas de réarrangement.
Résultats
- Le séquençage d'enrichissement ciblé par lectures courtes a identifié davantage de sites d'intégration grâce à une couverture plus profonde par base.
- Le séquençage d'enrichissement par ciblage à lecture longue a identifié moins de sites mais a permis de mesurer la longueur des sites d'intégration et les schémas de recombinaison.
- Le séquençage d'enrichissement ciblé par lecture longue a révélé un réarrangement des vecteurs dans 4 % à 40 % des sites d'intégration chez les animaux traités par AAV.
- La figure 4 montre le locus de source vectorielle et l'emplacement hôte des sites d'insertion dans les données de lecture longue et courte.
Le séquençage par enrichissement ciblé à lecture longue et à lecture courte peut tous deux soutenir l'analyse des sites d'intégration, tandis que les données à lecture longue ajoutent un contexte structurel pour les jonctions vecteur-hôte et les motifs de recombinaison.
Conclusion
Ce cas soutient une stratégie d'analyse d'intégration équilibrée. Les approches à lecture courte ou ciblée peuvent être utiles lorsque la profondeur de découverte des sites est centrale, tandis que le séquençage à lecture longue devient précieux lorsque la question de recherche nécessite le contexte des jonctions hôte-vecteur, la structure d'insertion, la longueur du site d'intégration ou les motifs de recombinaison.
Publications connexes
Les publications suivantes soutiennent le raisonnement scientifique pour l'analyse des sites d'intégration à longues lectures, l'intégration des vecteurs AAV, la recherche sur le profil d'intégration des CAR-T et l'analyse du contexte structural.
Journal : Méthodes de thérapie moléculaire et développement clinique
Année : 2024
Journal : Méthodes de thérapie moléculaire et développement clinique
Année : 2024
Journal : Nature Communications
Année : 2020
Journal : Biologie du génome
Année : 2021
Enregistrement texte intégral PMC pour l'étude de séquençage d'enrichissement ciblé AAV 2024
Journal : Méthodes de thérapie moléculaire et développement clinique / PMC
Année : 2024
