Séquençage unicellulaire 10x Genomics

CD Genomics propose désormais une analyse de cellules uniques utilisant diverses solutions du système Chromium de 10X Genomics, permettant le profilage de populations de cellules rares ou hétérogènes.

L'introduction du séquençage 10x

Des approches puissantes sont devenues plus accessibles, permettant le profilage de populations cellulaires rares ou hétérogènes. La moyenne qui se produit dans les méthodes de séquençage conventionnelles « en vrac » ne permet pas l'évaluation directe de l'unité biologique fondamentale—la cellule—ou des noyaux individuels qui emballent le génome. La génomique CD offre un accès à l'analyse génomique et génétique au niveau de la cellule unique en utilisant le système 10x genomics et sa méthode de livraison de réactifs conçue. Les plateformes basées sur des gouttelettes, comme le système Chromium 10x, propulsé par la technologie GemCode, permettent aux chercheurs biomédicaux et aux cliniciens de faire d'importantes nouvelles découvertes en utilisant cette approche puissante, ainsi que les technologies et outils nécessaires pour mener des études sur des cellules uniques. De plus, les plateformes basées sur des gouttelettes, maximisant le débit des cellules tout en réduisant les réactions à des volumes de nanolitres, ont montré qu'elles améliorent la sensibilité de détection et la précision quantitative. Les méthodes basées sur des gouttelettes présentent des avantages, permettant l'analyse directe de types cellulaires rares ou de cellules primaires pour lesquelles il peut y avoir un matériel insuffisant pour les protocoles de séquençage en vrac conventionnels. Elles sont également idéales pour profiler des sous-populations intéressantes de cellules au sein d'une population hétérogène plus large, par exemple, des cellules tumorales malignes au sein d'une masse tumorale, ou des cellules immunitaires hyper-réactives au sein d'un groupe apparemment homogène. Elles peuvent même révéler des types cellulaires entièrement nouveaux. La génomique 10X permet également d'étudier les états cellulaires dans des scénarios tels que le développement embryonnaire, le cancer, la différenciation des myoblastes et de l'épithélium pulmonaire, et la diversification des destins des lymphocytes.

Encapsulez votre échantillon dans des centaines à des dizaines de milliers de partitions adressables de manière unique en quelques minutes, chacune contenant un code-barres identifiant pour l'analyse en aval. Chaque Gel Bead, infusé de millions d'oligonucléotides codés par un code-barres, est mélangé avec un échantillon, qui peut être de l'ADN de haut poids moléculaire (HMW), des cellules individuelles, des noyaux ou des Cell Beads. Les Gel Beads et les échantillons sont ensuite ajoutés à une solution d'huile-surfactant pour créer des Gel Beads en Émulsion (GEMs), qui agissent comme des vésicules de réaction individuelles dans lesquelles les Gel Beads sont dissous et l'échantillon est codé par un code-barres. Les produits codés par un code-barres sont regroupés pour des réactions en aval afin de créer des bibliothèques compatibles avec les séquenceurs à lectures courtes. Après le séquençage, les séquences de lectures courtes codées par un code-barres résultantes sont intégrées dans des pipelines d'analyse clés en main qui utilisent les informations de code-barres pour mapper les lectures à leur ADN HMW d'origine, cellule unique ou noyau unique d'origine.

Figure 1. Aperçu schématique du fragment d'une bibliothèque génomique finale 10x Chromium

Solution d'expression génique à cellule unique Chromium™

Maximiser le débit des cellules est essentiel pour identifier les types cellulaires à partir de tissus complexes. La solution d'expression génique unicellulaire 10X Genomics Chromium peut être utilisée pour effectuer des mesures du transcriptome dans des cellules individuelles, le séquençage d'un grand nombre de cellules uniques pouvant reproduire la complexité du transcriptome en vrac. CD Genomics s'engage à fournir un service de profilage du transcriptome unicellulaire de haute qualité en utilisant la solution d'expression génique unicellulaire 10X Genomics Chromium, ainsi que des outils logiciels clé en main, permettant la création de bibliothèques de haute complexité à partir de cellules uniques pour maximiser les informations provenant de tout type d'échantillon. Les pipelines d'analyse Cell Ranger effectuent l'analyse primaire et la visualisation. Les pipelines d'analyse Cell Ranger effectuent des étapes d'analyse standard telles que le démultiplexage, l'alignement et le comptage des gènes. Cell Ranger exploite les codes-barres 10X pour générer des données d'expression avec une résolution unicellulaire. Ce type de données permet des applications incluant le regroupement de cellules, la classification des types cellulaires et l'expression génique différentielle à une échelle de centaines à des dizaines de milliers de cellules.

Le système Chromium™ permet le profilage transcriptionnel de cellules uniques allant jusqu'à des dizaines de milliers de cellules (typiquement 1000-6000), en partitionnant les cellules dans des GEMs à l'échelle des nanolitres, où tout le cDNA généré partage un code-barres 10x commun utilisé pour associer les lectures individuelles aux partitions individuelles. L'incubation des GEMs produit un cDNA barcodé et de pleine longueur à partir de l'ARNm poly-adenylé. La bibliothèque Single Cell 3' comprend des constructions standard Illumina à paires d'extrémités qui commencent et se terminent par P5 et P7. Un code-barres 10x de 16 pb et des codes-barres moléculaires de 12 pb sont encodés dans la Lecture 1, en tant que premiers paires de bases de l'insertion de la bibliothèque. Les séquences d'index d'échantillon sont incorporées en tant que lecture d'index i7.

Figure 2. Le flux de travail de partitionnement des cellules Chromium™ pour le séquençage scRNA

Les protocoles de cellule unique 10x Genomics nécessitent une suspension de cellules uniques viables ou de noyaux uniques comme entrée. Les chercheurs doivent soumettre une suspension dissociée de cellules vivantes. Pour obtenir des données de haute qualité, il est crucial de maximiser la viabilité et de minimiser la présence d'agrégats nucléaires, de cellules mortes, de débris cellulaires, d'acides nucléiques cytoplasmiques et de potentiels inhibiteurs de la transcription inverse. Un comptage précis des cellules est essentiel au succès de l'application. La suspension de cellules uniques entre 700 et 1200 cellules/µl est recommandée pour une récupération optimale des cellules cibles. Il est recommandé que la suspension de cellules soit comptée 3 à 4 fois et que l'écart type entre tous les comptages soit < 25 %.

• Codage des caractéristiques : codage de surface cellulaire

La technologie de barcoding des caractéristiques permet le multiplexage et la détection de doublons et/ou l'identification des isoformes de protéines de surface cellulaire, la détection de protéines pour des transcrits à faible abondance, et augmente encore la spécificité phénotypique.

• Codage des caractéristiques : dépistage CRISPR

Mise en œuvre du criblage CRISPR pour réaliser des criblages génétiques fonctionnels à haut débit et évolutifs dans des centaines à des dizaines de milliers de cellules uniques simultanément.

Solution de profilage immunitaire à cellule unique Chromium™

La solution de profilage immunitaire à cellule unique Chromium est une approche complète pour comprendre le système immunitaire adaptatif de centaines à des dizaines de milliers de cellules T et B chez l'homme ou la souris avec une résolution à cellule unique. CD Genomics propose des flux de travail simplifiés qui vous permettent de passer de la suspension cellulaire à la préparation de bibliothèques, au séquençage immunitaire et à l'analyse logicielle, permettant l'assemblage et l'annotation de segments V(D)J complets et l'évaluation simultanée de l'expression des TCR, des Ig et des gènes 5' dans la même cellule.

Les suspensions de cellules uniques chargées dans le système sont partitionnées en GEMs, où les transcrits sont étiquetés avec des codes-barres spécifiques aux cellules. Le cDNA étiqueté est ensuite regroupé pour un traitement en aval et une préparation de bibliothèque. Pour le profilage du répertoire immunitaire, le cDNA subit un enrichissement ciblé pour les transcrits des récepteurs T ou B avant la préparation de la bibliothèque. Le protocole produit des bibliothèques Chromium Single Cell V(D)J prêtes pour le séquençage Illumina.

Pour les bibliothèques enrichies en V(D)J, la lecture 1 encode le code-barres 10x™ de 16 pb, les codes-barres moléculaires de 10 pb et l'oligomère Switch de 13 pb, ainsi que l'extrémité 5' d'un transcrit enrichi. Pour les bibliothèques d'expression génique 5', la lecture 1 encode le code-barres 10x de 16 pb et les codes-barres moléculaires de 10 pb. En raison de la fragmentation enzymatique, pour les deux bibliothèques, la lecture 2 encode un fragment interne aléatoire de l'insertion correspondante. Les séquences d'index d'échantillon sont incorporées en tant que lecture d'index i7. Un schéma des constructions de bibliothèque finales est montré ci-dessous.

Figure 3. Bibliothèque enrichie de cellules uniques V(D)J au chrome

Figure 4. Structure de la bibliothèque d'expression génique 5'

La solution de séquençage à lectures liées Chromium™

La solution de séquençage du génome Chromium permet aux codes-barres moléculaires de marquer les lectures provenant du même long fragment d'ADN, ce qui fournit les informations à longue portée manquantes dans les approches standard. En conséquence, nous sommes en mesure de lier les courtes lectures ensemble en utilisant un code-barres unique pour chaque courte lecture générée à partir d'une molécule individuelle. Les lectures liées peuvent aider à accéder NGS zones mortes, trouver plus de variants structurels, résoudre les haplotypes et facilement de novo assemblages de génomes.

Pour les analyses de génome entier, le processus commence par de l'ADN génomique à haut poids moléculaire (HMW), des bibliothèques prêtes pour le séquençage de copies d'ADN génomique barcodé unique sont créées. Pour les analyses de tout l'exome, en ajoutant le kit de réactifs Agilent SureSelectXT Human All Exon V6, les bibliothèques d'enrichissement ciblé fournissent également des performances optimales pour l'application de l'exome. Des performances optimales ont été caractérisées sur de l'ADN génomique d'entrée avec une longueur moyenne supérieure à 65 kb, et ce protocole décrit l'extraction d'ADN génomique HMW de taille optimale à partir de cellules vivantes.

Le profilage du nombre de copies de cellules uniques Chromium™

La génomique CD a la capacité de séquencer des bibliothèques à partir de l'ADN de cellules uniques et d'analyser les données génomiques, détectant avec précision les événements CNV à l'échelle de la cellule unique.

S'appuyant sur la technologie 10x GEMs, la solution de CNV à cellule unique Chromium est capable de profiler des centaines à des milliers de cellules. L'ADN provenant de cellules uniques est étiqueté par code-barres au sein des partitions de gel de billes cellulaires, et les fragments étiquetés sont ensuite regroupés pour la production de bibliothèques. Les fragments de bibliothèque étiquetés peuvent être facilement retracés jusqu'aux cellules dont ils proviennent à l'aide d'outils bioinformatiques en aval. Cela offre une approche complète et évolutive pour déterminer l'hétérogénéité génomique et cartographier l'évolution clonale en profilant des centaines à des milliers de cellules dans un seul échantillon. Il est plus facile que jamais d'étudier des pathogénies complexes, y compris la progression du cancer et les troubles génétiques, à une échelle et une résolution sans précédent. Les événements CNV à cellule unique seront appelés à une résolution d'environ 2 Mb, mais sur des groupes de cellules, les événements CNV peuvent être détectés jusqu'à une résolution de plusieurs centaines de Kb.

Le séquençage ATAC Chromium™

Le système 10x Chromium™ conçu pour la solution ATAC (Assay for Transposase Accessible Chromatin) à cellule unique aide à comprendre le paysage régulateur du génome. Il permet également de comprendre la variation épigénétique et régulatrice à travers des dizaines de milliers de cellules avec la solution ATAC pour l'analyse à cellule unique Chromium. En commençant avec des centaines à des dizaines de milliers de noyaux, une enzyme transposase est utilisée pour marquer préférentiellement les régions d'ADN accessibles avec des adaptateurs de séquençage. Les fragments d'ADN transposés provenant de noyaux individuels sont distingués par l'un des ~750 000 codes-barres 10x possibles. Il profile de 500 à 10 000 noyaux par canal et interroge les profils de chromatine ouverte des noyaux individuels.

Avantages du séquençage de cellules uniques 10x

• Débit cellulaire élevéLe système microfluidique "double-croix" présente une configuration à 8 canaux, permettant de capturer jusqu'à 10 000 cellules par canal. Cela permet d'analyser entre 50 000 et 80 000 cellules d'échantillon en une seule course sur l'ensemble des huit canaux.
• Élevé Couverture de séquençage à cellule uniqueLa profondeur de séquençage atteint en moyenne 50 000 lectures par cellule.
• Haute efficacité de capture cellulaireAvec une efficacité de capture de cellules uniques allant jusqu'à 65 %, le système peut identifier avec précision des types de cellules rares, facilitant ainsi la recherche sur des échantillons rares ou ceux contenant un petit nombre de cellules.
• Séquençage unicellulaire véritableLa probabilité qu'un seul GEM (perle de gel en émulsion) capture plusieurs cellules est extrêmement faible (moins de 0,09 % pour 1 000 cellules).
• Adaptabilité des cellules largesLe système n'impose aucune restriction sur la taille des cellules (les cellules ayant un diamètre supérieur à 40 μm nécessitent la préparation des noyaux cellulaires) ou sur le type de cellules, accueillant des cellules tissulaires, des cellules immunitaires, des cellules sanguines, des cellules de tissu cancéreux, des cellules neuronales, et plus encore.

Applications du séquençage unicellulaire 10x

Études immunologiques

• Identification des sous-types de cellules immunitaires : Utiliser la technologie des cellules uniques pour identifier et étiqueter différents sous-types de cellules immunitaires.
• Analyse de la diversité génétique : Analyser la diversité génétique des cellules immunitaires et la forte hétérogénéité causée par les pathogènes.
• Découverte de nouveaux gènes marqueurs : Identifier des types de cellules immunitaires rares, découvrir de nouveaux gènes marqueurs et étudier les mécanismes moléculaires des réponses immunitaires.

Recherche sur les tumeurs

• Identification des sous-types de cellules tumorales : Reconnaître différents sous-types de cellules au sein des tumeurs, en fournissant des données génétiques et transcriptomiques précises.
• Recherche sur l'hétérogénéité des tumeurs : Étudier l'hétérogénéité des cellules tumorales, le regroupement et la découverte de nouveaux types cellulaires, en recherchant de nouvelles voies et mécanismes pathogènes.

Recherche sur le développement neural

• Analyse de l'hétérogénéité des neurones : Étudier l'hétérogénéité et le regroupement des différentes cellules neuronales.
• Analyse des mécanismes de régulation moléculaire : Analyser les mécanismes de régulation et de différenciation des cellules neuronales, contribuant à comprendre les mécanismes des maladies neurologiques.

Recherche sur le développement cérébral

• Atlas d'expression génique du cerveau humain : Obtenez un atlas d'expression génique des cellules cérébrales humaines, analysez l'hétérogénéité cellulaire et les groupes cellulaires complexes.
• Comprendre la fonction et les mécanismes : Comprendre la fonction normale et les mécanismes anormaux du cerveau humain.

Typage des maladies

• Découverte de types cellulaires anormaux : Trouver des types cellulaires proliférant de manière anormale pour aider à la typologie des maladies.

Différenciation des cellules souches

• Analyse de l'hétérogénéité cellulaire : Analyser l'hétérogénéité des cellules souches et identifier les cellules de différents phénotypes.
• Découverte de marqueurs spécifiques : Trouver des marqueurs spécifiques de différents types de cellules souches et analyser les mécanismes moléculaires du développement et de la différenciation des cellules souches.

Recherche sur le développement des cellules embryonnaires

• Construction des lignées cellulaires : Étudier la construction des lignées cellulaires en fonction des caractéristiques des différents sous-types cellulaires pour aider à la typologie des maladies.

Construction de l'Atlas Cellulaire

• Reconnaissance de nouveaux types de cellules : Identifier avec précision divers types de cellules grâce à l'analyse du transcriptome unicellulaire et découvrir de nouveaux types de cellules et gènes marqueurs.

Flux de travail de séquençage de cellules uniques 10x

Le flux de travail complet pour la préparation de bibliothèques à cellule unique utilisant 10x Genomics comprend trois étapes majeures : la préparation d'une suspension de cellules uniques, la construction de GEMs (Gel Bead in Emulsion) et la construction de la bibliothèque. Cela est suivi de la lyse cellulaire et de la transcription inverse, du séquençage et de l'analyse des données. CD Genomics garantit que le processus de séquençage à cellule unique 10x Genomics est exécuté avec une intégrité, une précision et une efficacité totales.

Spécifications de service

	Exigences d'échantillon Quantité et qualité recommandées des cellules : 1-103Les cellules uniques sont stockées dans un tampon 1xPBS (sans Ca).2+, Mg2+), le volume est dans une plage de 2 μL Concentration cellulaire : 700-1200 cellules/μL Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégie de séquençage 10x Genomics 50000 lectures/ cellules Le taux de capture atteint 65 %.
	Analyse bioinformatique Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Contrôle de la qualité des données Alignement de génomes Comptage de cellules Analyse de l'expression génique Analyse différentielle des gènes marqueurs Analyse des types cellulaires Analyse de pseudotemps Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage unicellulaire 10x pour votre rédaction (personnalisation)

Si vous avez des exigences supplémentaires ou des questions, n'hésitez pas à nous contacter.

Les résultats partiels sont montrés ci-dessous :

1. Pourquoi mener des recherches sur le séquençage de cellules uniques ?

L'hétérogénéité existe même entre des cellules adjacentes au sein d'un même tissu, comme les tissus cérébraux ou cardiaques. Cela est particulièrement prononcé dans les tumeurs, qui sont des amalgames de diverses cellules mutées. Le séquençage en phase de masse conventionnel, qui analyse le matériel génétique d'un mélange de cellules au sein d'un tissu et de son microenvironnement, peut obscurcir des informations critiques en raison de l'hétérogénéité cellulaire. En revanche, le séquençage à cellule unique résout ce problème en améliorant considérablement la résolution de l'analyse de séquençage au niveau de la cellule unique. Cette précision permet une compréhension plus précise des informations génétiques et fournit des aperçus puissants sur le développement individuel et la recherche sur les maladies.

De 2013 à 2020, la technologie de séquençage à cellule unique a été constamment mise en avant comme une technologie révolutionnaire annuelle par des revues prestigieuses telles que Science et Nature. Cette technique est à l'origine d'une nouvelle vague de révolution dans le domaine de la recherche biomédicale.

2. Quels produits à cellule unique 10x Genomics propose-t-il actuellement ?

10x Genomics propose une suite de solutions unicellulaires basées sur leur système Chromium, qui utilise la technologie avancée 10x Next GEM. Ces solutions incluent :

• Transcriptomique unicellulaire: Pour l'analyse de l'expression génique au niveau de l'ARN.
• Séquençage CNV à cellule unique: Pour examiner les variations du nombre de copies (CNC) au niveau de l'ADN.
• Détection de protéines par code-barres: Pour le profilage des protéines de surface en utilisant le codage par caractéristiques.
• Profilage immunitaire à cellule unique (V(D)J-Seq)Pour une analyse immunologique complète, y compris le profilage des répertoires de récepteurs d'antigènes des cellules immunitaires.
• ATAC-Seq à cellule unique: Pour évaluer l'accessibilité de la chromatine et fournir des informations sur le paysage épigénétique.

3. La séquençage à cellule unique est-il actuellement réalisable pour les plantes ?

Contrairement au séquençage unicellulaire chez les animaux, la recherche unicellulaire chez les plantes en est encore à ses débuts. Un défi majeur provient de la présence de la paroi cellulaire des plantes, qui nécessite la préparation de protoplastes avant de créer des suspensions unicellulaires. Ce processus est souvent compliqué par des problèmes liés aux temps de digestion enzymatique et à l'osmolarité des tampons. De plus, l'hétérogénéité cellulaire plus faible au sein des tissus végétaux complique les efforts de regroupement cellulaire. En outre, la taille de certaines cellules végétales peut être trop grande pour être compatible avec la plateforme 10x Genomics, rendant le séquençage unicellulaire plus difficile.

Le séquençage d'ARN à cellule unique résout les relations moléculaires entre les cellules végétales individuelles.

Journal : Physiologie des plantes

Facteur d'impact : 7,479

Publié : 04 février 2019

Contexte

Différents types de cellules chez les organismes résultent de l'expression génique variée, essentielle pour les fonctions multicellulaires. Le séquençage d'ARN à cellule unique (scRNA-seq) a révolutionné notre compréhension de l'expression génique au sein des cellules, en particulier chez les animaux, révélant des motifs divers et des types rares. Son application chez les plantes fait face à des défis tels que l'isolement des cellules à l'intérieur de la paroi cellulaire, mais des études récentes sur les racines d'Arabidopsis utilisant le scRNA-seq fournissent des informations sur l'expression génique et le développement, montrant un potentiel prometteur pour la biologie végétale.

Matériaux et Méthodes

Résultats

Cette étude a utilisé la plateforme 10X Genomics Chromium pour analyser 7522 transcriptomes unicellulaires provenant des pointes racinaires d'Arabidopsis, révélant une grande reproductibilité et identifiant neuf grands clusters cellulaires. L'analyse de l'expression génique différentielle et l'analyse GO ont mis en évidence des fonctions spécifiques aux tissus, telles que les gènes liés aux poils racinaires et au stèle. L'analyse des gènes marqueurs a permis une attribution précise des clusters à des tissus racinaires distincts. L'analyse des sous-clusters au sein de la stèle a identifié des types cellulaires spécifiques comme le xylème et le phloème, montrant la capacité du jeu de données à découvrir des sous-types cellulaires rares. Les gradients d'expression génique à travers les clusters ont indiqué des dynamiques de développement, illustrant un schéma de différenciation spatiale allant des cellules méristématiques aux cellules matures.

Figure 1. Isolement et analyse de clusters des transcriptomes unicellulaires des racines d'Arabidopsis sauvage.

Figure 2. L'expression des gènes marqueurs de la stèle sur les graphiques de projection tSNE définit des clusters de types de tissus et de cellules distincts dans la stèle.

Figure 3. Variation de développement intraclustérienne dans l'expression génique.

Dans cette étude, le séquençage d'ARN à cellule unique (scRNA-seq) a été utilisé pour analyser l'épiderme racinaire des mutants rhd6 et gl2 à haute résolution. L'analyse a révélé des phénotypes moléculaires distincts : les mutants rhd6 manquaient de cellules de poils radiculaires, certaines cellules adoptant des caractéristiques non capillaires, tandis que les mutants gl2 manquaient de cellules non capillaires, certaines cellules exprimant des marqueurs précoces de non-capillaires. Ces résultats soulignent l'efficacité du scRNA-seq dans l'identification des changements d'expression génique spécifiques aux types cellulaires et la caractérisation des phénotypes mutants au niveau de la cellule unique.

Figure 4. Analyse comparative du transcriptome unicellulaire des racines de type sauvage et des racines de mutants de l'épiderme racinaire.

Conclusion

Le séquençage d'ARN à cellule unique (scRNA-seq) a été moins exploré chez les plantes par rapport aux animaux. Les auteurs ont utilisé une plateforme de microfluidique basée sur des gouttelettes pour effectuer un scRNA-seq à haut débit sur plus de 10 000 cellules racinaires d'Arabidopsis, révélant une diversité de types de tissus et de stades de développement. Ils ont identifié des types cellulaires rares comme les cellules du centre quiescent et ont retracé des trajectoires de développement dans les cellules épidermiques racinaires, y compris des mutants, mettant en avant le potentiel du scRNA-seq pour une analyse détaillée de l'expression génique chez les plantes.

Référence

1. Ryu KH, Huang L, Kang HM, et al. Le séquençage d'ARN à cellule unique résout les relations moléculaires entre les cellules végétales individuelles. Physiologie végétale2019, 179(4):1444-56.