Génotypage SNP TaqMan

CD Genomics propose des assays Taqman sur mesure à réaliser. Génotypage SNP, permettant l'identification et l'amplification des polymorphismes.

L'introduction du génotypage SNP TaqMan

TaqMan est couramment utilisé Génotypage SNP méthode développée par Life Technologies. C'est une technologie avancée, mature, validée et largement utilisée. L'essai de génotypage SNP TaqMan est également appelé "essai de discrimination allélique à 50-nucléases". Chaque essai de génotypage TaqMan contient deux amorces pour amplifier la séquence d'intérêt et deux sondes TaqMan spécifiques à l'allèle et étiquetées différemment pour la détection des allèles. Chaque sonde MGB spécifique à l'allèle est étiquetée avec un colorant fluorescent (soit une molécule de rapporteur FAM soit VIC) à l'extrémité 5' et est attachée à un quenchers de fluorescence à l'extrémité 3'. Tant que la sonde est intacte, la proximité du colorant quenchers avec le colorant rapporteur supprime la fluorescence du rapporteur. Pendant l'étape d'amplification PCR, si la sonde spécifique à l'allèle est parfaitement complémentaire à l'allèle SNP, elle s'hybridera au segment d'ADN cible et sera ensuite dégradée par l'activité 5'-nucléase de la polymérase Taq. La dégradation de la sonde entraîne la séparation du fluorophore de la molécule quenchers, générant un signal fluorescent détectable. Si un seul décalage de point est présent entre la sonde et le brin d'ADN cible en raison d'un SNP, la liaison de la sonde à l'ADN est déstabilisée pendant le déplacement de brin en PCR, ce qui réduira l'efficacité de la coupure de la sonde et du quenching du colorant rapporteur fluorescent.

L'essai peut être réalisé à l'aide d'un système de détection de séquence ABI Prism 7900HT à haut débit et à faible coût d'exploitation. Le système ABI Prism 7900HT peut distinguer et quantifier les deux couleurs (FAM ou VIC), et des génotypes peuvent être générés pour de nombreux échantillons en quelques minutes.

Avantages du génotypage SNP TaqMan

• Simple et direct : Le génotypage SNP TaqMan implique un simple mélange d'échantillons et de composants de réaction dans un système fermé, ne nécessitant aucune procédure complexe et étant facile à mettre en œuvre.
• Détection en temps réel : En détectant les changements de fluorescence pendant la réaction PCR, le génotypage SNP TaqMan permet une surveillance en temps réel des génotypes SNP, fournissant des résultats rapides.
• Évitement de la manipulation post-PCR : Sans besoin de procédures post-PCR, cela élimine les coûts de main-d'œuvre et le risque de contamination croisée associés à la manipulation post-PCR, réduisant ainsi les erreurs expérimentales.
• Exigence de faible échantillon : En raison de la sensibilité des réactions PCR, le génotypage SNP TaqMan nécessite des quantités d'échantillons minimales, ce qui le rend adapté à l'analyse d'échantillons limités.
• Détection d'échantillons à haut débit : Avec l'avancement des instruments de PCR quantitative par fluorescence, de grandes quantités d'échantillons peuvent être détectées simultanément dans une seule plaque de réaction, améliorant ainsi l'efficacité et le débit de détection.
• Haute sensibilité et spécificité : le génotypage SNP TaqMan offre une haute sensibilité et spécificité, identifiant avec précision les SNP et évitant les erreurs de jugement et la confusion.
• Exigence d'échantillon faible avec ~10ng/génotype
• Raisonnable pour une grande taille d'échantillon
• Conception de projet sur mesure
• Des scientifiques compétents avec une expérience considérable en PCR.

Application de la génotypage SNP TaqMan

• Particulièrement avantageux pour les scénarios d'analyse SNP avec un nombre relativement modeste de loci, mais avec des tailles d'échantillon dépassant 1500 cas, car des tailles d'échantillon plus importantes entraînent des coûts moindres.
• Recherche Génétique : Le génotypage SNP TaqMan est applicable dans divers domaines des études génétiques impliquant l'analyse des SNP, englobant des domaines tels que la génétique humaine et l'élevage génétique de la flore et de la faune.
• Études d'association SNP à l'échelle du génome : Particulièrement adaptées pour valider les loci positifs initiaux obtenus à partir d'études d'association SNP à l'échelle du génome complètes. Cette approche aide à identifier les SNP associés à des traits ou des maladies spécifiques, facilitant ainsi une compréhension globale de leurs bases génétiques.
• Validation des sites de mutation préliminaires de séquençage du génome entierDans le cadre des études de séquençage de génomes entiers, un nombre substantiel de sites de mutation préliminaires est généralement identifié. Le génotypage SNP TaqMan constitue un outil précieux pour la validation ultérieure de ces sites avec de grandes tailles d'échantillons, éclaircissant leurs fréquences au sein de populations ou d'espèces spécifiques et leurs corrélations avec des traits phénotypiques.

Flux de travail de génotypage SNP TaqMan

Les procédures expérimentales englobent de nombreuses étapes, y compris l'extraction d'ADN, l'inspection de la qualité des échantillons, la conception et la synthèse des sondes, les expériences préliminaires, la détection réalisée par des instruments de PCR quantitative par fluorescence, et l'analyse des données qui s'ensuit. Au cœur de la réaction PCR se trouve le processus d'identification des génotypes SNP présents dans les échantillons, réalisé par la détection de signaux fluorescents.

Spécifications du service

	Exigences et préparation des échantillons ADN génomique sans dégradation sévère Quantité d'ADN ≥ 1 µg, concentration ≥ 25 ng/µl La pureté devrait avoir un OD260/280 = 1,7~2,0.
	Détection Système de détection de séquence ABI Prism 7900HT Approprié pour des projets avec environ 1 à 10 SNPs et 100 à 1000 échantillons.
	Analyse de données Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Statistiques des données brutes Informations sur le contrôle de la qualité Informations sur le génotype Fréquence SNP Analyse d'association … (plus sur demande)

Pipeline d'analyse

Livrables

Conditions expérimentales incluant des informations sur les séquences de primers et de sondes, les noms des réactifs, les modèles d'appareils, les protocoles, les graphiques de clustering et les tableaux de génotypage de chaque locus SNP dans chaque échantillon individuel.

CD Genomics propose une technologie TaqMan hautement fiable et flexible pour répondre à vos besoins spécifiques. Génotypage SNP besoins.

Référence :

1. Ziller M. J. et al. Séquençage bisulfite ciblé du méthylome dynamique de l'ADN. Épigénétique et chromatine, 2016, 9(1) : 55.

Graphique des résultats de détection de génotypage basé sur des sondes TaqMan

1. Quel est le principe de fonctionnement du typage génique SNP TaqMan ?

Cette technologie fait référence à le génotypage des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) approche, méticuleusement développée par l'équipe de recherche de l'ABI. Le principe de fonctionnement a été exposé comme suit :

Lors de la réaction PCR, une paire de sondes spécifiques de Minor Groove Binder (MGB), avec des étiquettes fluorescentes uniques à chaque extrémité, est incluse pour discerner différents gènes alléliques (allèle1 et allèle2). L'extrémité 5' porte un moiety fluorescent rapporteur, tandis que l'extrémité 3' est équipée d'un moiety fluorescent de quenching. Tout au long du processus PCR, les deux sondes ont la capacité de s'hybrider et de se lier sélectivement aux séquences complémentaires situées entre les amorces avant et arrière.

Lorsque ces sondes subsistent dans leur état intact, le transfert de résonance d'énergie incite les moitiés fluorescentes à émettre une faible fluorescence. Une fois que la sonde spécifique se lie exclusivement à son gène allèlique correspondant, l'ADN polymérase exerce son activité exonucléase de 5' à 3', clivant la moité fluorescente du rapporteur et la libérant de l'effet de quenching des moitiés fluorescentes à l'extrémité 3'—ce qui entraîne une émission de fluorescence.

Les deux sondes sont clairement marquées : l'extrémité 5' porte une fluorescence diverse (soit FAM soit VIC), tandis que l'extrémité 3' est attachée à un complexe de quenching MGB. Les variations de fluorescences détectées peuvent ainsi être utilisées pour déduire le génotype allélique SNP des échantillons respectifs.

2. Quels sont les avantages du génotypage SNP TaqMan ?

Le génotypage SNP TaqMan offre une simplicité, évitant la contamination croisée lors de la manipulation post-PCR ; détection en temps réel des loci SNP, fournissant des résultats rapides ; exigence minimale en échantillons, adaptée aux échantillons limités ; analyse simultanée de grandes quantités d'échantillons, améliorant l'efficacité de détection et le débit.

3. Dans quels domaines de recherche le génotypage SNP TaqMan est-il applicable ?

Le génotypage SNP TaqMan est applicable à divers domaines de recherche génétique impliquant Génotypage SNP, y compris la génétique humaine, ainsi que l'élevage animal et végétal. Il est particulièrement adapté pour des études de validation supplémentaires des loci positifs initiaux obtenus à partir d'études d'association SNP à l'échelle du génome, et un grand nombre de loci de mutations de dépistage préliminaire obtenus à partir de séquençage du génome entier.

4. Quelle contribution le génotypage SNP TaqMan apporte-t-il au diagnostic clinique ?

Les applications pratiques du génotypage SNP TaqMan dans le domaine du diagnostic clinique sont significatives. Grâce à l'utilisation efficace de ce processus, les cliniciens sont en mesure de découvrir des variations génétiques spécifiques à certaines maladies. Par la suite, ces informations sont utilisées pour concevoir de manière réfléchie des plans de traitement personnalisés en fonction des besoins des patients individuels. De plus, le génotypage SNP TaqMan peut potentiellement permettre la création de mesures préventives proactives, ouvrant ainsi la voie à la médecine préventive.

5. Quelles sont les mesures à prendre pour éviter les faux positifs dans les expériences de génotypage SNP TaqMan ?

La question des occurrences de faux positifs dans les expériences de génotypage SNP TaqMan suscite une attention considérable. Il est crucial de mettre en œuvre diverses mesures de contrôle afin d'augmenter la précision et la fiabilité des résultats obtenus. Des exemples de vérifications et de contrôles applicables incluent l'inclusion d'échantillons de contrôle négatifs et la réalisation de plusieurs expériences reproductibles. De telles stratégies servent à réduire l'incidence des inexactitudes dans les résultats de la recherche.

6. Comment le génotypage SNP TaqMan se compare-t-il à d'autres méthodes de génotypage ?

En comparaison avec l'alternative Génotypage SNP Les techniques de génotypage SNP TaqMan offrent une sensibilité, une spécificité et une rapidité accrues, associées à une facilité de mise en œuvre. Par conséquent, elles ont été largement adoptées dans des applications pratiques.

7. Comment les échecs dans les expériences de génotypage SNP TaqMan devraient-ils être abordés ?

Dans les cas d'échec expérimental, une approche systématique est justifiée. Cela inclut un examen minutieux des procédures expérimentales pour garantir l'exactitude des procédures, une évaluation de la fraîcheur et de la qualité des réactifs, une vérification des contaminations potentielles et des problèmes techniques, ainsi qu'une exploration des ajustements des conditions expérimentales visant à améliorer les résultats.

Génotypage SNP utilisant la technologie TaqMan® : le CYP2D6*17 énigme d'analyse

Journal : Rapports scientifiques

Facteur d'impact : 4,746

Publié : 19 mars 2015

Contexte

CYP2D6 est une enzyme critique dans le métabolisme des médicaments, impliquée dans le métabolisme d'une part significative des médicaments utilisés cliniquement. Son activité varie considérablement entre les populations, influençant l'efficacité des médicaments et les événements indésirables. Plus de 100 variants alléliques ont été identifiés, impactant les phénotypes du métabolisme des médicaments. Les tests TaqMan sont couramment utilisés pour CYP2D6 génotypage, mais des défis persistent en raison de la complexité génétique. Des résultats inattendus dans les essais TaqMan ont suscité une enquête plus approfondie sur l'exactitude des appels de génotypes, soulignant la nécessité d'une validation rigoureuse des essais et de la compréhension des corrélations génotype-phénotype pour la médecine personnalisée.

Méthodes

Résultats

Des essais TaqMan ont été utilisés pour génotyper les cas pour CYP2D6 des variantes, révélant des incohérences dans les appels pour le SNP 1023C>T. La contamination et les problèmes de qualité de l'ADN ont été écartés. Une enquête plus approfondie a regroupé les sujets en fonction de ceux portant CYP2D6*17 et 4 allèles. Les cas ont présenté des appels homozygotes pour 1023C>T, identifiés par la suite comme portant un sous-variant CYP2D64 avec un trio de SNP spécifique. D'autres ont montré des appels cohérents ou des duplications de gènes. Ces résultats soulignent la complexité de CYP2D6 génotypage et la nécessité de méthodes d'analyse précises.

Figure 1. Sous-variants CYP2D6*4.

CYP2D6 Le génotypage effectué dans trois institutions a identifié 16 sujets d'ascendance africaine présentant des SNP clés hétérozygotes mais homozygotes pour 1023T/T. On a suggéré qu'ils avaient une nouveauté. CYP2D6*4 sous-variante portant le SNP 1023C>T. Cependant, l'analyse RFLP a contredit les résultats TaqMan, indiquant une hétérozygotie pour 1023C>T. Le resequencement du gène a confirmé les résultats RFLP, révélant des SNP communs sur CYP2D6*4 variantes. Cela met en évidence la complexité de CYP2D6 génotypage et la nécessité de méthodes d'analyse complètes.

Figure 2. CYP2D6*17 Résultats de génotypage de l'essai TaqMan (1023C>T).

La collaboration avec Thermo Fisher a conduit à tester une alternative. CYP2D6*17 conception de l'essai. Ce nouveau design a corrigé les erreurs de génotypage observées dans les essais précédents, identifiant l'hétérozygotie pour CYP2D6*17 SNP dans des échantillons précédemment homozygotes. Échantillons avec CYP2D6*4Le génotype /4 a été correctement identifié. L'analyse de la structure secondaire du produit PCR de l'essai a suggéré des différences entre CYP2D6*17 et *4 variantes, pouvant influencer la performance du test.

Figure 3. Comparaison de séquences de CYP2D6 variantes, CYP2D7 et CYP2D8

Figure 4. Amplification en temps réel pour l'original et l'alternatif CYP2D6*17 Tests TaqMan.

Conclusion

Le mécanisme derrière la perte d'allèles reste énigmatique, impliquant peut-être les propriétés de la polymérase Taq ou des structures secondaires. Ce phénomène inattendu souligne la nécessité d'une validation approfondie des tests et d'une vigilance dans l'interprétation des résultats, en particulier dans des gènes hautement polymorphes comme CYP2D6.

Référence :

1. Gaedigk A, Freeman N, Hartshorne T, et al. Génotypage SNP utilisant la technologie TaqMan® : le CYP2D6* 17 énigme d'analyse. Rapports scientifiques, 2015, 5(1) : 9257.