Génotypage SNP TaqMan

CD Genomics propose des assays Taqman sur mesure à réaliser. Génotypage SNP, permettant l'identification et l'amplification des polymorphismes.

L'introduction du génotypage SNP TaqMan

TaqMan est couramment utilisé Génotypage SNP méthode développée par Life Technologies. C'est une technologie avancée, mature, validée et largement utilisée. L'essai de génotypage SNP TaqMan est également appelé "essai de discrimination allélique à 50-nucléases". Chaque essai de génotypage TaqMan contient deux amorces pour amplifier la séquence d'intérêt et deux sondes TaqMan à faible groove (MGB) spécifiques aux allèles et différemment marquées pour la détection des allèles. Chaque sonde MGB spécifique à un allèle est marquée avec un colorant fluorescent (soit un colorant rapporteur FAM, soit un colorant rapporteur VIC) à l'extrémité 5' et est attachée à un quenchers de fluorescence à l'extrémité 3'. Tant que la sonde est intacte, la proximité du colorant quenchers avec le colorant rapporteur supprime la fluorescence du rapporteur. Pendant l'étape d'amplification PCR, si la sonde spécifique à l'allèle est parfaitement complémentaire à l'allèle SNP, elle s'hybride au segment d'ADN cible puis est dégradée par l'activité 5'-nucléase de la polymérase Taq. La dégradation de la sonde entraîne la séparation du fluorophore de la molécule quenchers, générant un signal fluorescent détectable. Si un décalage d'un seul point est présent entre la sonde et le brin d'ADN cible en raison d'un SNP, la liaison de la sonde à l'ADN est déstabilisée pendant le déplacement des brins lors de la PCR, ce qui réduit l'efficacité de la clivage de la sonde et du quenching du colorant rapporteur fluorescent.

L'analyse peut être réalisée à l'aide d'un système de détection de séquence ABI Prism 7900HT à haut débit et à faible coût d'exploitation. Le système ABI Prism 7900HT peut distinguer et quantifier les deux couleurs (FAM ou VIC), et des génotypes peuvent être générés pour de nombreux échantillons en quelques minutes.

Avantages du génotypage SNP TaqMan

• Simple et direct : Le génotypage SNP TaqMan implique un simple mélange d'échantillons et de composants de réaction dans un système fermé, ne nécessitant aucune procédure complexe et étant facile à mettre en œuvre.
• Détection en temps réel : En détectant les changements de fluorescence pendant la réaction PCR, le génotypage SNP TaqMan permet une surveillance en temps réel des génotypes SNP, fournissant des résultats rapides.
• Évitement de la manipulation post-PCR : Sans nécessité de procédures post-PCR, cela élimine les coûts de main-d'œuvre et le risque de contamination croisée associés à la manipulation post-PCR, réduisant ainsi les erreurs expérimentales.
• Exigence de faible échantillon : En raison de la sensibilité des réactions PCR, le génotypage SNP TaqMan nécessite des quantités minimales d'échantillons, ce qui le rend adapté à l'analyse d'échantillons limités.
• Détection d'échantillons à haut débit : Avec l'avancement des instruments de PCR quantitative par fluorescence, de grands lots d'échantillons peuvent être détectés simultanément dans une seule plaque de réaction, améliorant ainsi l'efficacité et le débit de détection.
• Haute sensibilité et spécificité : Le génotypage SNP TaqMan offre une haute sensibilité et spécificité, identifiant avec précision les SNP et évitant les erreurs de jugement et la confusion.
• Exigence d'échantillon faible avec ~10ng/génotype
• Raisonnable pour une grande taille d'échantillon
• Conception de projet personnalisée
• Des scientifiques compétents avec une expérience considérable en PCR.

Application de génotypage SNP TaqMan

• Particulièrement avantageux pour les scénarios d'analyse de SNP avec un nombre relativement modeste de loci, mais avec des tailles d'échantillon dépassant 1500 cas, car des tailles d'échantillon plus importantes entraînent des coûts plus bas.
• Recherche génétique : Le génotypage SNP TaqMan est applicable dans divers domaines d'études génétiques impliquant l'analyse des SNP, englobant des domaines tels que la génétique humaine et la sélection génétique des plantes et des animaux.
• Études d'association SNP à l'échelle du génome : Particulièrement adaptées pour valider les loci positifs initiaux obtenus à partir d'études d'association SNP à l'échelle du génome. Cette approche aide à identifier les SNP associés à des traits ou des maladies spécifiques, facilitant ainsi une compréhension approfondie de leurs bases génétiques.
• Validation des sites de mutation préliminaires de séquençage du génome entierDans le cadre des études de séquençage du génome entier, un nombre substantiel de sites de mutation préliminaires est généralement identifié. Le génotypage SNP TaqMan constitue un outil précieux pour la validation supplémentaire de ces sites avec de grands échantillons, éclaircissant leurs fréquences au sein de populations ou d'espèces spécifiques et leurs corrélations avec des traits phénotypiques.

Flux de travail de génotypage SNP TaqMan

Les procédures expérimentales comprennent de nombreuses étapes, y compris l'extraction d'ADN, l'inspection de la qualité des échantillons, la conception et la synthèse des sondes, les expériences préliminaires, la détection réalisée par des instruments de PCR quantitative par fluorescence, et l'analyse des données qui en découle. Au cœur de la réaction PCR se trouve le processus d'identification des génotypes SNP présents dans les échantillons, réalisé par la détection de signaux fluorescents.

Spécifications du service

	Exigences et préparation des échantillons ADN génomique sans dégradation sévère Quantité d'ADN ≥ 1 µg, concentration ≥ 25 ng/µl La pureté devrait avoir un OD260/280 = 1,7~2,0.
	Détection Système de détection de séquence ABI Prism 7900HT Approprié pour des projets avec environ 1 à 10 SNPs et 100 à 1000 échantillons.
	Analyse des données Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Statistiques des données brutes Informations sur le contrôle qualité Informations sur le génotype Fréquence des SNP Analyse d'association … (plus sur demande)

Pipeline d'analyse

Livrables

Conditions expérimentales incluant des informations sur les séquences de primers et de sondes, les noms des réactifs, les modèles d'appareils, les protocoles, les graphiques de regroupement et les tableaux de génotypage de chaque locus SNP dans chaque échantillon individuel.

CD Genomics propose une technologie TaqMan hautement fiable et flexible pour répondre à vos besoins spécifiques. Génotypage SNP besoins.

Référence :

1. Ziller M. J. et al. Séquençage bisulfite ciblé du méthylome dynamique de l'ADN. Épigénétique et chromatine, 2016, 9(1) : 55.

Résultats de la démo

Graphique des résultats de détection de génotypage basé sur des sondes TaqMan

FAQs sur le génotypage SNP TaqMan

1. Quel est le principe de fonctionnement du typage génétique SNP TaqMan ?

Cette technologie fait référence à le génotypage des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) approche, développée avec soin par l'équipe de recherche de l'ABI. Le principe de fonctionnement a été exposé comme suit :

Lors de la réaction PCR, une paire de sondes spécifiques de Minor Groove Binder (MGB), avec des étiquettes fluorescentes uniques à chaque extrémité, est incluse pour discerner différents gènes alléliques (allèle1 et allèle2). L'extrémité 5' porte un moiety fluorescent rapporteur, tandis que l'extrémité 3' est équipée d'un moiety fluorescent de quenching. Tout au long du processus PCR, les deux sondes ont la capacité de s'hybrider et de se lier sélectivement aux séquences complémentaires situées entre les amorces avant et arrière.

Lorsque ces sondes subsistent dans leur état intact, le transfert de résonance d'énergie incite les moieties fluorescentes à émettre une faible fluorescence. Une fois que la sonde spécifique se lie exclusivement à son gène allèlique correspondant, l'ADN polymérase exerce son activité exonucléase de 5' à 3' ; clivant la moiety fluorescente rapporteur et la libérant de l'effet de quenching des moieties fluorescentes de l'extrémité 3' — cela entraîne une émission de fluorescence.

Les deux sondes sont clairement marquées : l'extrémité 5' porte une fluorescence diverse (soit FAM soit VIC), tandis que l'extrémité 3' est attachée à un complexe de quenching MGB. Les variations de fluorescences détectées peuvent ainsi être utilisées pour déduire le génotype allèlique SNP des échantillons respectifs.

2. Quels sont les avantages du génotypage SNP TaqMan ?

Le génotypage SNP TaqMan offre une simplicité, évitant la contamination croisée lors de la manipulation post-PCR ; détection en temps réel des loci SNP, fournissant des résultats rapides ; besoin minimal en échantillons, adapté aux échantillons limités ; analyse simultanée de grandes quantités d'échantillons, améliorant l'efficacité de détection et le débit.

3. Dans quels domaines de recherche le génotypage SNP TaqMan est-il applicable ?

Le génotypage SNP TaqMan est applicable à divers domaines de recherche génétique impliquant Génotypage SNP, y compris la génétique humaine, ainsi que l'élevage d'animaux et de plantes. Il est particulièrement adapté pour des études de validation supplémentaires des loci positifs initiaux obtenus à partir d'études d'association SNP à l'échelle du génome, et un grand nombre de loci de mutations de dépistage préliminaire obtenus à partir de séquençage du génome entier.

4. Quelle contribution le génotypage SNP TaqMan apporte-t-il au diagnostic clinique ?

Les applications pratiques du génotypage SNP TaqMan dans le domaine du diagnostic clinique sont significatives. Grâce à l'utilisation efficace de ce processus, les cliniciens sont en mesure de découvrir des variations génétiques spécifiques à certaines maladies. Par la suite, ces informations sont utilisées pour élaborer des plans de traitement adaptés aux besoins des patients individuels. De plus, le génotypage SNP TaqMan peut potentiellement permettre la création de mesures préventives proactives, ouvrant ainsi la voie à la médecine préventive.

5. Quelles sont les mesures à prendre pour éviter les résultats faussement positifs dans les expériences de génotypage SNP TaqMan ?

La question des occurrences de faux positifs dans les expériences de génotypage SNP TaqMan suscite une attention considérable. Il est crucial de mettre en œuvre diverses mesures de contrôle afin d'augmenter la précision et la fiabilité des résultats obtenus. Des exemples de vérifications et de contrôles applicables incluent l'inclusion d'échantillons de contrôle négatifs et la réalisation de plusieurs expériences reproductibles. De telles stratégies servent à réduire l'incidence des inexactitudes dans les résultats de la recherche.

6. Comment le génotypage TaqMan SNP se compare-t-il à d'autres méthodes de génotypage ?

En comparaison avec l'alternative Génotypage SNP Les techniques de génotypage SNP TaqMan offrent une sensibilité, une spécificité et une rapidité accrues, associées à une facilité de mise en œuvre. Par conséquent, elles ont été largement adoptées dans des applications pratiques.

7. Comment les échecs dans les expériences de génotypage SNP TaqMan doivent-ils être traités ?

Dans les cas d'échec expérimental, une approche systématique est justifiée. Cela inclut un examen minutieux des procédures expérimentales pour garantir l'exactitude des procédures, l'évaluation de la fraîcheur et de la qualité des réactifs, une vérification des contaminations potentielles et des problèmes techniques, ainsi que l'exploration d'ajustements des conditions expérimentales visant à améliorer les résultats.

Études de cas sur le génotypage SNP TaqMan

Génotypage SNP utilisant la technologie TaqMan® : le CYP2D6*17 énigme d'analyse

Journal : Rapports scientifiques

Facteur d'impact : 4,746

Publié : 19 mars 2015

Contexte

CYP2D6 est une enzyme critique dans le métabolisme des médicaments, impliquée dans le métabolisme d'une part significative des médicaments utilisés cliniquement. Son activité varie considérablement parmi les populations, influençant l'efficacité des médicaments et les événements indésirables. Plus de 100 variantes alléliques ont été identifiées, impactant les phénotypes de métabolisme des médicaments. Les essais TaqMan sont couramment utilisés pour CYP2D6 génotypage, mais des défis persistent en raison de la complexité génétique. Des résultats inattendus dans les essais TaqMan ont suscité une enquête plus approfondie sur l'exactitude des appels de génotypes, soulignant la nécessité d'une validation rigoureuse des essais et de la compréhension des corrélations génotype-phénotype pour la médecine personnalisée.

Méthodes

Résultats

Les essais TaqMan ont été utilisés pour génotyper les cas pour CYP2D6 des variantes, révélant des incohérences dans les appels pour le SNP 1023C>T. La contamination et les problèmes de qualité de l'ADN ont été écartés. Une enquête plus approfondie a regroupé les sujets en fonction de ceux portant CYP2D6*17 et 4 allèles. Les cas ont présenté des appels homozygotes pour 1023C>T, identifiés par la suite comme portant un sous-variant CYP2D64 avec un trio de SNP spécifique. D'autres ont montré des appels cohérents ou des duplications de gènes. Ces résultats soulignent la complexité de CYP2D6 génotypage et la nécessité de méthodes d'analyse précises.

Figure 1. Sous-variants CYP2D6*4.

CYP2D6 Le génotypage réalisé dans trois institutions a identifié 16 sujets d'ascendance africaine présentant des SNP clés hétérozygotes mais homozygotes pour 1023T/T. On a suggéré qu'ils avaient une nouvelle CYP2D6*4 sous-variante portant le SNP 1023C>T. Cependant, l'analyse RFLP a contredit les résultats TaqMan, indiquant une hétérozygotie pour 1023C>T. Le resequencement des gènes a confirmé les résultats RFLP, révélant des SNP communs sur CYP2D6*4 variantes. Cela souligne la complexité de CYP2D6 génotypage et la nécessité de méthodes d'analyse complètes.

Figure 2. CYP2D6*17 Résultats de génotypage de l'essai TaqMan (1023C>T).

La collaboration avec Thermo Fisher a conduit à tester une alternative. CYP2D6*17 conception de l'essai. Ce nouveau design a corrigé les erreurs de génotypage observées dans les essais précédents, identifiant l'hétérozygotie pour CYP2D6*17 SNP dans des échantillons précédemment homozygotes. Échantillons avec CYP2D6*4Le génotype /4 a été correctement identifié. L'analyse de la structure secondaire du produit PCR de l'essai a suggéré des différences entre CYP2D6*17 et *4 variants, pouvant potentiellement influencer la performance de l'essai.

Figure 3. Comparaison de séquences de CYP2D6 variantes, CYP2D7 et CYP2D8

Figure 4. Amplification en temps réel pour l'original et l'alternatif CYP2D6*17 Essais TaqMan.

Conclusion

Le mécanisme derrière la perte d'allèles reste insaisissable, impliquant peut-être les propriétés de la polymérase Taq ou des structures secondaires. Ce phénomène inattendu souligne la nécessité d'une validation approfondie des tests et d'une vigilance dans l'interprétation des résultats, en particulier dans des gènes hautement polymorphes comme CYP2D6.

Référence :

1. Gaedigk A, Freeman N, Hartshorne T, et al. Génotypage SNP utilisant la technologie TaqMan® : le CYP2D6* 17 énigme d'analyse. Rapports scientifiques, 2015, 5(1) : 9257.