Directives de Soumission d'Échantillons
Construire un package de preuves de contrôle qualité ADN/ARN pour les projets ABE et CBE.
Les éditeurs de bases sont des outils puissants pour créer des changements nucléotidiques précis sans introduire de cassures double brin. Mais un projet ABE ou CBE ne devrait pas être évalué uniquement en se demandant si la base ciblée a été modifiée au site cible. Votre équipe doit également comprendre la fenêtre d'édition, les modifications accessoires, les sites hors cible candidats dans l'ADN, les signaux d'édition au niveau de l'ARN, et comment ces résultats diffèrent selon les éditeurs, les sgRNAs, les doses, les points temporels ou les groupes d'échantillons.
Notre solution d'évaluation de la sécurité de l'édition de base vous aide à organiser ces questions en un package de preuves de contrôle qualité soutenu par le séquençage. Nous utilisons "évaluation de la sécurité" dans un sens de service de recherche : l'objectif est de générer et d'organiser des données pour la révision du projet, et non de tirer des conclusions cliniques ou réglementaires sur un éditeur.
Quelle question cette solution vous aide-t-elle à répondre ?
- La conversion prévue de A en G ou de C en T a-t-elle eu lieu au site cible ?
- Y a-t-il des modifications de spectateurs dans ou près de la fenêtre d'édition ?
- Les sites hors cible de l'ADN des candidats sont-ils modifiés ?
- Un examen au niveau de l'ARN est-il nécessaire pour cet éditeur, ce type d'échantillon ou ce stade d'étude ?
- Faut-il utiliser le séquençage génomique complet (WGS), le séquençage d'ARN (RNA-seq), le séquençage ciblé ou une stratégie hybride ?
- Peut-on comparer plusieurs éditeurs, sgRNAs, groupes de traitement ou points temporels ?
- Quelles tables, figures et notes de contrôle qualité sont nécessaires pour la révision interne du projet ?
L'objectif est d'aider votre équipe à passer des résultats de séquençage bruts à un profil d'édition clair qui peut être examiné par les équipes de biologie moléculaire, de bioinformatique et de programme.
Pourquoi l'édition de base nécessite plus qu'une validation du site cible.
La validation du site cible est le point de départ. Elle vous indique si la conversion de base attendue a eu lieu et si des modifications accessoires sont présentes dans la région cible. Cependant, les éditeurs de bases peuvent également soulever des questions au niveau de l'ADN et de l'ARN qui ne sont pas entièrement résolues par un seul test de site cible.
Par exemple, un projet peut nécessiter une validation ciblée des candidats pour les off-targets ADN dépendants de sgRNA. Un autre projet peut nécessiter une révision soutenue par RNA-seq lorsque l'édition au niveau du transcriptome est une préoccupation. Une étude de comparaison d'éditeurs de haute valeur peut nécessiter WGS, RNA-seq, séquençage ciblé et bioinformatique personnalisée dans un seul package.
Nous vous aidons à choisir la profondeur de QC qui correspond à votre objectif de recherche, tout en gardant l'interprétation liée aux preuves de séquençage et au contexte du projet.
Nos capacités de service pour l'évaluation de l'édition de base.
Nous soutenons l'évaluation de l'édition de base en tant que flux de travail intégré de séquençage et de bioinformatique. En fonction de l'étape de votre projet, notre équipe peut aider à planifier la validation sur cible, le profilage des modifications accessoires, l'évaluation des cibles hors cible de l'ADN, la révision au niveau de l'ARN et les résultats bioinformatiques prêts à être rapportés.
Validation sur cible et profilage des modifications de tiers
Pour les projets ABE et CBE, la validation sur cible commence généralement par la conversion de base attendue. Les projets ABE se concentrent souvent sur la conversion A-en-G, tandis que les projets CBE se concentrent souvent sur la conversion C-en-T. Cependant, la fenêtre cible peut contenir plusieurs bases éditables, donc le résultat devrait inclure plus qu'une simple réponse oui/non.
- Amplification ciblée du site ou séquençage ciblé
- Résumé de l'efficacité de l'édition
- Fréquence de conversion prévue
- Modifier le profil de l'observateur
- Modèle d'édition au niveau des allèles ou des lectures
- Comparaison d'échantillons ou de groupes
- Visualisation de la fenêtre d'édition
Découverte et validation de candidats hors cible de l'ADN
La révision des cibles hors cible de l'ADN peut être abordée de différentes manières en fonction du projet. Certains projets commencent par des sites candidats prédits ou identifiés expérimentalement. D'autres peuvent nécessiter une révision plus large soutenue par le séquençage génomique complet (WGS) ou des approches de découverte spécifiques à l'édition de bases lorsque cela est disponible et approprié.
- Revue de la liste des sites candidats
- Validation hors cible ciblée
- Séquençage d'amplicon ou séquençage ciblé
- Contexte des variantes soutenues par WGS
- Table de fréquence de modification des candidats
- Annotation génomique et notes sur la proximité des gènes
- Comparaison d'échantillons contrôlés et modifiés
Revue au niveau de l'ARN et évaluation soutenue par le transcriptome
L'évaluation au niveau de l'ARN n'est pas nécessaire pour chaque projet d'édition de bases, mais elle peut être utile lorsque le type d'éditeur, le stade du projet ou la question de recherche rendent l'examen au niveau du transcriptome important. L'analyse soutenue par RNA-seq peut aider à examiner les candidats à l'édition au niveau de l'ARN et à comparer les échantillons édités avec les témoins.
- Revue de la qualité des échantillons d'ARN
- Évaluation du transcriptome soutenue par RNA-seq
- Résumé des événements d'édition de l'ARN candidats
- Annotation de transcription
- Résumé de la fréquence ou du support de lecture
- Comparaison d'échantillons contrôlés et modifiés
- Filtrage des notes et des chiffres prêts pour le rapport
Rapport de bioinformatique pour l'édition du spectre et les preuves de contrôle qualité
La principale valeur de cette solution ne réside pas seulement dans le séquençage. C'est l'interprétation. Nous aidons à organiser les modifications ciblées, les modifications non ciblées, les candidats hors cible de l'ADN, les résultats au niveau de l'ARN, l'annotation des variants, la comparaison des échantillons et les notes de contrôle qualité dans des tableaux et des figures que votre équipe peut examiner.
Pour les services de génomique CD associés, consultez notre Séquençage de validation des effets hors cible de CRISPR, Analyse de l'édition CRISPR avec NGSet Séquençage de l'ARN pages.
Choisissez la bonne stratégie d'évaluation pour l'ABE, le CBE et la phase de projet.
Il n'existe pas de méthode unique qui réponde à chaque question de contrôle qualité sur l'édition de bases. La bonne stratégie dépend du type d'éditeur, de la conversion de base attendue, du type d'échantillon, de la conception du contrôle, du stade du projet et de savoir si votre équipe a besoin de preuves au niveau de l'ADN, de l'ARN ou de preuves en couches.
| Stratégie | Question principale | Projet Optimal | Entrée | Sortie | Limitation |
|---|---|---|---|---|---|
| Séquençage d'amplicons ciblés | La conversion de base prévue a-t-elle été réalisée ? | Validation précoce, dépistage de clones, dépistage d'échantillons | ADNg ou amplicon purifié | Fréquence de modification, conversion prévue, profil des témoins | Concentré sur la région cible sélectionnée |
| Validation ciblée des effets hors cible | Les sites hors cible de l'ADN des candidats sont-ils modifiés ? | Confirmation du site du candidat | liste des sites candidats et ADN génomique | Table de fréquence d'édition des candidats et annotation | Nécessite une sélection de candidats |
| examen soutenu par WGS | Des signaux de variantes génomiques plus larges sont-ils présents ? | Revue de contrôle qualité au niveau de l'ADN de valeur supérieure | ADNg de haute qualité | Contexte des variants à l'échelle du génome, revue des CNV/SNV/SV le cas échéant. | Peut ne pas capturer tous les événements d'édition à basse fréquence. |
| Revue soutenue par RNA-seq | Des signaux d'édition au niveau de l'ARN sont-ils présents ? | Évaluation au niveau de l'ARN et revue du transcriptome | ARN total de haute qualité | Résumé au niveau du transcript et événements d'édition d'ARN candidats | Nécessite un filtrage, des contrôles et une qualité d'ARN soigneux. |
| Approche de découverte spécifique à l'édition de base | Les événements induits par l'éditeur sont-ils découvrables au-delà de la prédiction ? | Projets de découverte avancée | Entrées ADN/ARN spécifiques au projet | Sortie de découverte de candidats | La disponibilité et l'adéquation de la méthode doivent être confirmées. |
| Stratégie hybride | Avons-nous besoin de preuves en couches ? | Études de comparaison de plateformes, précliniques ou d'éditeurs | ADN, ARN, contrôles, informations sur l'éditeur/sgARN | Package de preuves de CQ intégré | Conception de projet plus complexe |
Pour un examen plus large au niveau de l'ADN, notre Séquençage du génome entier un service peut être envisagé. Pour une analyse ciblée des cibles ou des sites candidats, Séquençage de région ciblée peut soutenir la validation. Pour une analyse et une visualisation personnalisées, notre Bioinformatique l'équipe peut soutenir des rapports spécifiques au projet.
Commencez par le type d'éditeur : ABE ou CBE. Ensuite, définissez la conversion de base attendue, la fenêtre d'édition, la séquence cible, le sgRNA, le type d'échantillon et la conception du contrôle. Si le premier objectif est la confirmation du site cible, un séquençage d'amplicon ou ciblé peut suffire. Si le projet nécessite un contexte au niveau de l'ADN, un séquençage du génome entier (WGS) ou une validation ciblée des effets hors cible peut être ajoutée. Si l'édition au niveau de l'ARN fait partie des préoccupations, un examen soutenu par RNA-seq peut être inclus.
Une stratégie hybride est souvent utile lorsque les équipes doivent comparer plusieurs éditeurs, sgRNAs, conditions de livraison ou groupes d'échantillons. Dans ces cas, le projet doit être conçu avec des contrôles clairs et des rapports de résultats dès le début.
Flux de travail de l'échantillon au rapport avec des points de contrôle de QC ADN/ARN
Notre flux de travail relie l'essai technique au processus de service. De la réception du projet à la livraison du rapport, chaque étape est conçue pour maintenir l'alignement entre la question de modification de base, le type d'échantillon, la méthode de séquençage et le résultat de l'analyse.
Étape 1 : Réception du projet et examen des informations de l'éditeur
Nous commençons par examiner le type d'éditeur, la séquence sgRNA, la séquence cible, le PAM, la fenêtre d'édition attendue, la conversion de base attendue, le type d'échantillon, les groupes de traitement, la conception de l'échantillon témoin, les objectifs de contrôle qualité au niveau de l'ADN et de l'ARN, ainsi que les tableaux, figures et format de rapport souhaités.
Cette étape nous aide à déterminer si le projet doit se concentrer sur la validation du site cible, l'examen des off-targets de l'ADN candidat, l'évaluation au niveau de l'ARN, l'examen soutenu par le séquençage du génome entier (WGS) ou un package combiné.
Étape 2 : Échantillonnage de reçu et contrôle de qualité de l'ADN/ARN
Après réception de l'échantillon, nous vérifions l'identité de l'échantillon, l'étiquetage, le format du conteneur et les données de contrôle qualité disponibles. Pour les analyses basées sur l'ADN, nous examinons la quantité d'ADN génomique, la concentration, la pureté et l'état de dégradation.
Pour l'évaluation au niveau de l'ARN, nous examinons l'intégrité de l'ARN, sa pureté, son statut sans ADN et si la qualité de l'échantillon convient à une analyse soutenue par l'ARN-seq.
Étape 3 : Stratégie de séquençage ciblé, hors cible pour l'ADN et au niveau de l'ARN
La stratégie de séquençage est choisie en fonction de la question du projet. La validation sur cible peut utiliser le séquençage d'amplicons ou le séquençage ciblé. L'examen des candidats ADN hors cible peut utiliser des panneaux de validation ciblés ou des méthodes ADN à un niveau plus large. L'évaluation au niveau de l'ARN peut utiliser une révision du transcriptome soutenue par RNA-seq.
L'objectif est de générer des données qui peuvent soutenir la production prévue : fréquence de modification, profil de modification des témoins, tableau des cibles hors cible, annotation au niveau de l'ADN/ARN ou comparaison multi-échantillons.
Étape 4 : Appel de variants, analyse du spectre d'édition et filtrage
Les données de séquençage sont traitées et filtrées selon la méthode sélectionnée. L'analyse peut inclure le contrôle de qualité des lectures, l'alignement, la révision de la fenêtre cible, le calcul de la fréquence d'édition, le profilage des modifications accessoires, la révision des candidats hors cible, l'annotation des variants, le filtrage au niveau de l'ARN et la comparaison avec des témoins.
À ce stade, nous nous concentrons sur la rendre le résultat interprétable, et pas seulement sur la production de listes de variantes.
Étape 5 : Rapports en bioinformatique et livrables prêts pour révision
Le livrable final peut inclure des données brutes, des données nettoyées le cas échéant, des résumés de contrôle qualité, des graphiques de spectre d'édition, des tableaux d'édition de tiers, des tableaux de candidats hors cible ADN, des résumés d'événements au niveau de l'ARN, des figures de comparaison d'échantillons et des notes de rapport.
Votre équipe peut utiliser ces résultats pour soutenir la révision de la recherche interne, la comparaison des méthodes et la planification des prochaines étapes du projet.
Exigences d'échantillon pour les projets d'évaluation de la sécurité de l'édition de base
Les exigences d'échantillon dépendent de la présence ou non d'une validation sur cible, d'une évaluation des off-targets ADN, d'une révision soutenue par le séquençage du génome entier (WGS), d'une évaluation au niveau de l'ARN, ou d'un package combiné. Le tableau ci-dessous utilise les directives de soumission d'échantillons de CD Genomics comme référence pour les soumissions d'acides nucléiques et de cellules. Les exigences exactes doivent être confirmées lors de la révision du projet.
| Type d'entrée | Matériel recommandé | Contrôle de qualité | Conteneur ou Format | Expédition ou Soumission | Notes |
|---|---|---|---|---|---|
| Cellules éditées / pellets cellulaires | Pour la soumission générale de cellules, 1×106 des cellules sont recommandées | Échantillon d'identité, type de cellule, groupe de traitement, rendement en ADN/ARN après extraction | Cryovial ou tube à cellules congelées approuvé | Glace carbonique | Utile lorsque l'extraction d'ADN/ARN est incluse. |
| ADNg extrait pour validation ciblée | Spécifique à l'essai ; les entrées de type WES/WGS en lectures courtes commencent généralement à partir de ≥500 ng d'ADNg. | OD260/280 proche de 1,8-2,0 ; traité avec de la RNase ; pas de dégradation ou de contamination évidente. | Tube sans DNase ; eau sans DNase, tampon d'élution ou Tris 10 mM pH 8,0 | Sacs de glace | Utilisé pour la validation ciblée, les témoins ou la validation hors cible ciblée. |
| ADNg extrait pour révision soutenue par le WGS | WGS : recommandé ≥500 ng, minimum 200 ng, minimum 10 ng/µL ; WGS sans PCR : recommandé ≥1 µg, minimum 500 ng, minimum 20 ng/µL | Concentration par fluorométrie lorsque c'est possible ; si un Nanodrop est utilisé, un apport plus élevé peut être nécessaire. | Tube sans DNase | Sacs de glace | Utilisé pour un contexte plus large au niveau de l'ADN. |
| Amplicon purifié pour validation ciblée | Séquençage d'amplicons : recommandé ≥1 µg, minimum 500 ng, minimum 20 ng/µL | Produit unique attendu si applicable ; vérification de la concentration et de la pureté. | Tube à faible liaison ou tube sans DNase | Packs de glace | Utile pour la validation du site cible ou du site candidat |
| ARN total extraité pour examen au niveau de l'ARN | Séquençage d'ARNm : recommandé ≥500 ng, minimum 200 ng, minimum 20 ng/µL ; séquençage de l'ensemble du transcriptome : recommandé ≥3 µg, minimum 1 µg, minimum 20 ng/µL. | ARN total sans ADN ; A260/A280 ≥1,8 ; A260/230 ≥1,8 ; RIN ≥6 | Tube sans RNase ; eau sans RNase, réactif de stabilisation de l'ARN ou Tris 10 mM pH 8,0 | Glace carbonique | Utilisé pour la révision du transcriptome soutenue par RNA-seq. |
| Informations sur l'éditeur et la cible | Type d'éditeur, ABE/CBE, sgRNA, séquence cible, PAM, modification attendue, conception de contrôle | Précision de la séquence et cohérence du groupe | FASTA, GenBank, feuille de calcul ou feuille de projet | Soumission électronique | Requis avant l'examen de la méthode |
CD Genomics demande à ses clients de soumettre un formulaire de soumission d'échantillon complété, de s'assurer que les noms des échantillons correspondent aux étiquettes sur les tubes, et de fournir des données de contrôle qualité électroniques lorsque cela est possible. Les échantillons d'ADN dissous dans de l'H2O ou un tampon TE doivent être transportés avec des packs de glace, tandis que les échantillons d'ARN, de cellules, de bactéries et de tissus congelés doivent être rapidement congelés et transportés avec de la glace carbonique. La base de soumission générale pour les cellules est de 1×10.6 les cellules et les tissus frais congelés guident une expédition avec de la glace carbonique de 10 mg. Ces valeurs proviennent des instructions de soumission d'échantillons de CD Genomics.
Analyse bioinformatique et livrables
La bioinformatique est au cœur de cette solution. L'évaluation de l'édition de base ne devient utile que lorsque les données de séquençage sont converties en spectre d'édition, résumés de fréquence, tableaux de candidats hors cible, annotations au niveau de l'ADN/ARN et notes de contrôle qualité prêtes à être rapportées.
Livrables minimums
- Résumé du projet et des informations sur l'échantillon
- Résumé de la QC de séquençage
- Fréquence d'édition ciblée
- Profil de conversion prévu
- Résumé de l'édition par un tiers
- Table des cibles hors cible de l'ADN du candidat où inclus
- Annotation des variantes et contexte génomique inclus.
- Résumé de l'édition au niveau de l'ARN où le séquençage d'ARN est inclus.
- Tableaux de comparaison d'exemples
- Notes de rapport et fichiers de visualisation
Options supplémentaires
- Analyse de la fenêtre d'édition spécifique ABE/CBE
- annotation de site candidat dépendante de l'sgRNA
- Révision des variants génomiques à l'échelle du génome soutenue par WGS
- Revue de l'édition au niveau du transcriptome soutenue par RNA-seq
- Validation approfondie du site candidat
- Comparaison d'échantillons contrôlés et modifiés
- Comparaison multi-éditeur ou multi-sgRNA
- Visualisation prête pour figure personnalisée
- Enregistrement des paramètres de pipeline
Un rapport utile devrait aider votre équipe à comparer des échantillons, et pas seulement à archiver des fichiers de séquençage. Les résultats peuvent inclure des graphiques de conversion de bases, des tableaux d'éditions de témoins, des résumés de candidats hors cible ADN, des résumés d'événements au niveau de l'ARN, des fichiers d'annotation et des notes de rapport final.
Cela aide les équipes de biologie moléculaire, de bioinformatique et de programmation à discuter du même ensemble de preuves.
Scénarios d'application pour le contrôle qualité de l'édition de base
Ces scénarios d'application montrent comment le contrôle qualité de l'édition de base soutenu par le séquençage peut aider les équipes à comparer les candidats éditeurs, organiser les preuves ADN/ARN et planifier les recherches à venir.
Comparaison des candidats ABE
Les projets ABE peuvent nécessiter une comparaison de l'efficacité d'édition, des modifications par des tiers, des cibles hors cible de l'ADN candidat et des signaux au niveau de l'ARN à travers les versions d'éditeurs, les sgRNAs ou les conditions de livraison. Un package QC structuré aide votre équipe à comparer les candidats en utilisant des résultats cohérents.
Comparaison des candidats CBE
Les projets CBE peuvent nécessiter un examen attentif des modèles d'édition C-à-T, du comportement de la fenêtre cible, des modifications de tiers et des profils au niveau de l'ADN/ARN. Le contrôle qualité soutenu par le séquençage aide à organiser ces résultats en tableaux et figures interprétables.
Programmes de recherche en thérapie cellulaire et génique
Les équipes de recherche en thérapie cellulaire et génique peuvent avoir besoin de preuves stratifiées avant de choisir un candidat éditeur de base pour des études supplémentaires. Une stratégie combinée peut inclure la validation du site cible, l'examen des effets hors cible de l'ADN, l'évaluation au niveau de l'ARN, la comparaison d'échantillons et le reporting en bioinformatique.
Études de base sur l'éditeur de gènes précliniques et translationnels
Pour la recherche préclinique ou translationnelle, un ensemble de preuves plus complet peut être utile. Cela peut inclure une révision au niveau de l'ADN soutenue par le séquençage du génome entier (WGS), une révision du transcriptome soutenue par le séquençage de l'ARN (RNA-seq), la validation de candidats et des figures prêtes à être rapportées. Les résultats soutiennent la révision de la recherche et la planification des étapes suivantes ; ils ne représentent pas une conclusion de sécurité clinique ou réglementaire.
Résultats de la démo : ce qu'un package de contrôle qualité pour l'édition de base peut inclure.
Les résultats de la démonstration aident votre équipe à comprendre comment les données de modification de base peuvent être organisées. Les exemples ci-dessous montrent des formats de résultats courants qui peuvent être inclus lorsqu'ils correspondent à la conception de l'étude.
Démonstration 1 : Spectre d'édition ciblée et profil d'édition accessoire
Un spectre d'édition sur site cible peut montrer la conversion de base prévue, la fréquence d'édition, la position de base, le soutien de lecture et les modifications accessoires dans la fenêtre d'édition. Cela aide votre équipe à voir si le modèle d'édition observé correspond à l'objectif de conception.
Une visualisation typique peut inclure un graphique de position de base, un tableau des allèles ou des lectures, et un graphique de comparaison des échantillons.
Démonstration 2 : tableau des candidats hors cible de l'ADN et annotation
Un tableau des candidats hors cible de l'ADN peut montrer la séquence du site candidat, les coordonnées génomiques, la fréquence d'édition, le gène voisin, la caractéristique génomique et la comparaison des groupes d'échantillons. Ce format aide votre équipe à examiner les sites candidats dans un contexte biologique plutôt que de lire une liste brute de variants.
Là où cela est approprié, les sites candidats peuvent être priorisés pour une validation plus approfondie ou une analyse de suivi.
Démonstration 3 : résumé de l'édition au niveau de l'ARN et revue du transcriptome
Lorsque l'évaluation au niveau de l'ARN est incluse, le rapport peut montrer des événements candidats d'édition de l'ARN, l'annotation des transcrits, le soutien des lectures, des notes de filtrage et une comparaison entre l'échantillon témoin et l'échantillon édité.
Une sortie typique peut inclure un tableau au niveau de la transcription, une carte thermique ou un graphique récapitulatif montrant les candidats d'édition au niveau de l'ARN à travers les échantillons.
FAQ : planification d'un projet d'évaluation de la sécurité de l'édition de base
1. L'évaluation ABE est-elle différente de l'évaluation CBE ?
Oui. Les projets ABE et CBE impliquent différentes conversions de base attendues, fenêtres d'édition et profils d'édition possibles. La stratégie d'évaluation devrait commencer par le type d'éditeur, la séquence cible, l'édition attendue et l'objectif du projet.
2. La validation ciblée est-elle suffisante pour un projet de modification de base ?
Parfois, un dépistage précoce peut suffire. Pour des projets de plus grande valeur, votre équipe peut également avoir besoin de profilage d'édition par des tiers, de révision de candidats hors cible de l'ADN, de révision soutenue par le séquençage du génome entier (WGS), d'évaluation au niveau de l'ARN ou d'un package de contrôle qualité hybride.
3. Qu'est-ce que les modifications par des tiers ?
Les modifications de spectateurs sont des changements de base supplémentaires qui se produisent près de la modification prévue, souvent à l'intérieur ou à proximité de la fenêtre d'activité de l'éditeur. Elles peuvent avoir de l'importance si elles affectent la séquence finale, la région de codage des protéines, la région régulatrice ou l'interprétation du projet.
4. Les profils d'ADN hors cible et de niveau d'ARN doivent-ils tous deux être examinés ?
Pas toujours. Le besoin dépend du type d'éditeur, du type d'échantillon, du stade de recherche et des préoccupations du projet. L'examen des cibles hors cible de l'ADN peut se concentrer sur des sites génomiques candidats ou un contexte soutenu par le séquençage du génome entier (WGS). Un examen au niveau de l'ARN peut être ajouté lorsque l'édition au niveau du transcriptome est pertinente.
5. Quand le séquençage du génome entier (WGS) devrait-il être ajouté au contrôle qualité de l'édition de base ?
Le séquençage génomique complet (WGS) peut être utile lorsque un contexte plus large au niveau de l'ADN est nécessaire, comme pour la comparaison de candidats éditeurs, des échantillons de recherche de plus grande valeur ou des projets qui nécessitent une révision des variants à l'échelle du génome. Il devrait être combiné avec une validation ciblée lorsque des preuves d'édition axées sur la fréquence sont nécessaires.
6. Quand le RNA-seq devrait-il être ajouté ?
L'ARN-seq peut être envisagé lorsque les signaux d'édition au niveau de l'ARN font partie de la question de recherche, lorsque le type d'éditeur soulève des préoccupations au niveau du transcriptome, ou lorsque le projet nécessite une comparaison entre le transcriptome contrôlé et le transcriptome édité.
7. Quels types d'échantillons peuvent être utilisés ?
Les projets peuvent utiliser des cellules éditées, des pellets cellulaires, de l'ADNg extrait, de l'ARN extrait, des amplicons purifiés ou des fichiers de projet soumis tels que le type d'éditeur, le sgRNA, la séquence cible, le PAM et l'édition attendue. L'entrée exacte dépend de la stratégie d'analyse choisie.
8. Quelles informations sur l'éditeur et l'ARNg de guidage (sgRNA) devrais-je fournir ?
Les informations utiles incluent le type d'éditeur, la version ABE/CBE si connue, la séquence sgRNA, la séquence cible, le PAM, la conversion de base attendue, la fenêtre d'édition, les groupes d'échantillons, la conception du contrôle et la liste des candidats hors cible si disponible.
9. Pouvez-vous comparer plusieurs éditeurs, sgRNAs ou groupes d'échantillons ?
Oui. Un projet de comparaison peut organiser la fréquence d'édition, le profil des observateurs, les cibles hors cible de l'ADN des candidats, les événements au niveau de l'ARN et les métriques de contrôle qualité entre les groupes. Un design de contrôle clair est important.
10. Quels résultats en bioinformatique peuvent être inclus ?
Les résultats peuvent inclure l'édition de spectres de plots, des tableaux d'édition de tiers, des tableaux d'ADN candidat hors cible, des résumés d'événements au niveau de l'ARN, des résumés de contrôle qualité WGS/RNA-seq, des figures de comparaison d'échantillons, des fichiers d'annotation et des notes de rapport.
Étude de cas : L'édition hors cible au niveau de l'ARN peut être manquée sans examen à l'échelle du transcriptome.
Affaire de littérature publique
Journal : Nature
Publié : 2019
DOI : 10.1038/s41586-019-1161-z
Contexte
Cette étude a abordé une question importante dans la recherche sur l'édition de bases : les éditeurs de bases de l'ADN peuvent-ils également créer des signaux d'édition de l'ARN à l'échelle du transcriptome ? À l'époque, de nombreuses évaluations de l'édition de bases se concentraient principalement sur les sites cibles de l'ADN. L'étude a montré pourquoi un examen au niveau de l'ARN peut être important lorsque l'édition hors cible à l'échelle du transcriptome fait partie des préoccupations du projet.
Ce cas est pertinent pour notre solution d'évaluation de la sécurité de l'édition de base car il soutient la nécessité de preuves de contrôle qualité en couches. La validation du site cible peut confirmer l'édition d'ADN attendue, mais un examen au niveau de l'ARN peut révéler des signaux d'édition supplémentaires nécessitant une analyse distincte.
Méthodes
L'étude a évalué les éditeurs de bases d'ADN guidés par CRISPR en utilisant une analyse soutenue par séquençage. Les auteurs ont utilisé le RNA-seq pour profiler les événements d'édition d'ARN à l'échelle du transcriptome, le WES pour examiner les variants au niveau de l'ADN, et le séquençage d'amplicons ciblés pour valider des sites sélectionnés.
L'étude a comparé des échantillons édités avec des témoins et a examiné les motifs d'édition de l'ARN associés à différentes conditions d'édition de base. Ces méthodes soutiennent la même logique utilisée dans le contrôle qualité de l'édition de base en couches : utiliser la bonne approche de séquençage pour la question de preuve spécifique.
Résultats
L'étude a rapporté un éditing d'ARN hors cible à l'échelle du transcriptome induit par des éditeurs de bases d'ADN. Le séquençage d'ARN a révélé des signaux d'édition d'ARN qui ne seraient pas capturés par une validation des sites cibles uniquement par ADN. L'article fournit également des informations sur la disponibilité des données pour le séquençage d'ARN, le séquençage de l'exome entier (WES) et le séquençage d'amplicons ciblés, soutenant le rôle de plusieurs couches de séquençage dans l'examen des éditeurs de bases.
Figure 1 présente une analyse des SNV d'ARN à l'échelle du transcriptome après l'expression de l'éditeur de bases et montre comment le séquençage d'ARN peut révéler des signaux d'édition au niveau de l'ARN à travers les échantillons.
La figure 1 tirée de la littérature publique montre comment l'analyse transcriptomique à l'échelle de l'ARN peut révéler des signaux d'édition au niveau de l'ARN qui ne sont pas capturés par la validation des sites cibles uniquement à l'ADN.
Conclusion
Ce cas soutient un principe pratique de contrôle qualité : l'évaluation de l'édition de base doit correspondre à la question de preuve. La validation sur cible, le profilage des modifications accessoires, l'examen des cibles hors cible de l'ADN, l'évaluation au niveau de l'ARN, les options de séquençage de génome entier/ARN-seq et les rapports en bioinformatique peuvent être combinés lorsque le projet nécessite des preuves en plusieurs couches.
Référence
Publication client associée
La publication ci-dessous est pertinente pour l'édition de base et l'analyse au niveau de l'ARN. Elle est répertoriée comme une publication client associée, et non comme une étude de cas basée sur des figures.
| Publication | Journal / Année | Étiquette de service associée | Pourquoi c'est pertinent |
|---|---|---|---|
| L'édition de base in vivo sauve la DPCAD dans un modèle murin humanisé. | Nature Communications, 2025 | RNA-seq / Construction de bibliothèques RNA-seq et séquençage | L'étude a impliqué l'édition de base ABE in vivo et une analyse de l'édition de base d'ARN hors cible à l'échelle du transcriptome ; les méthodes indiquent que la construction de la bibliothèque RNA-seq et le séquençage ont été réalisés par CD Genomics. |
