Séquençage de cellules uniques

La technologie GenSeqTM propriétaire de CD Genomics offre des services complets de séquençage à cellule unique. Ces modèles d'expression génique globaux dans les cellules uniques ont déjà considérablement avancé la biologie cellulaire.

Qu'est-ce que le séquençage à cellule unique ?

Le séquençage unicellulaire représente une avancée significative dans notre compréhension de l'hétérogénéité cellulaire et des processus biologiques. Cette technologie sophistiquée facilite l'examen des génomes, des transcriptomes, des épigénomes et des protéomes à la résolution unicellulaire, offrant ainsi des aperçus sans précédent sur les fonctions et les interactions cellulaires. Contrairement au séquençage en vrac conventionnel, qui produit des données moyennes à partir d'un mélange de cellules, le séquençage unicellulaire révèle les signatures moléculaires distinctes des cellules individuelles, dévoilant ainsi la complexité et la diversité intriquées présentes au sein des tissus et des organismes.

Pourquoi réaliser un séquençage à cellule unique

Prenant le transcriptome comme exemple, la méthode traditionnelle en vrac Séquençage de l'ARN La (séquençage d'ARN en vrac) implique l'extraction et le séquençage de l'ARN mélangé provenant de tissus, d'organes ou de groupes de cellules, produisant des données transcriptomiques moyennes pour ces populations cellulaires. Par exemple, en utilisant le séquençage d'ARN en vrac, on peut identifier l'expression génique différentielle entre les tissus tumoraux et les tissus non tumoraux adjacents, en notant les variations dans les oncogènes et les gènes suppresseurs de tumeurs. Cependant, au sein d'une tumeur, il existe des variations génétiques et transcriptomiques parmi les cellules situées au centre de la tumeur, à la périphérie, dans les métastases lymphatiques et dans les métastases distantes. Ces différences peuvent jouer des rôles critiques dans l'invasion des cellules cancéreuses, la métastase et l'évolution de la résistance aux médicaments, influençant par la suite l'efficacité des interventions thérapeutiques.

Inversement, le séquençage d'ARN à cellule unique (scRNA-seq) permet d'examiner l'hétérogénéité tumorale au niveau de chaque cellule individuelle. Cette technique facilite l'étude de l'évolution clonale et du développement des cellules cancéreuses, de l'invasion précoce du cancer, des taux et types de mutations dans les cellules cancéreuses, du suivi des métastases et de la dissémination, de la caractérisation du microenvironnement tumoral et de la compréhension de l'évolution de la résistance aux médicaments durant le traitement du cancer.

Méthodologies pour le séquençage à cellule unique

Les premières approches de séquençage à cellule unique consistaient à isoler des cellules individuelles, suivies d'une préparation de bibliothèque à faible entrée et du séquençage. Les méthodes d'isolement des cellules uniques comprenaient des techniques telles que la dilution limitante, la cytométrie en flux, la microdissection par capture laser et la micromanipulation. Bien que ces méthodes soient capables d'isoler des cellules uniques, elles sont souvent complexes, chronophages, coûteuses et à faible débit, ce qui entrave leur application généralisée à grande échelle.

Comment atteindre une capture de cellules uniques à haut débit

Les stratégies contemporaines utilisent principalement le séquençage par code-barres ADN pour faciliter l'identification des cellules individuelles. Chaque cellule est marquée avec une séquence de code-barres unique, permettant la construction d'une bibliothèque en vrac et la différenciation subséquente des acides nucléiques provenant de cellules distinctes en fonction de leur code-barres. Cette approche permet l'analyse simultanée de centaines à des milliers de cellules uniques à l'aide d'une seule préparation de bibliothèque et d'une seule course de séquençage.

Ici, nous discutons de deux techniques majeures utilisant ce principe pour le séquençage à cellule unique :

Séquençage de cellules uniques basé sur microplaques :

La méthode sous-jacente consiste à contrôler la concentration de la suspension cellulaire pour répartir les cellules dissociées dans des puits individuels d'une microplaque. Une fois que les cellules se déposent au fond, des billes magnétiques sont ajoutées à chaque puits. Ces billes sont pré-chargées avec des séquences Read1, des codes-barres, des codes-barres moléculaires et des séquences de capture. Dans chaque puits, des cellules uniques subissent une lyse, libérant leurs acides nucléiques, qui sont ensuite capturés par les billes magnétiques. Les billes sont ensuite regroupées pour la construction de bibliothèques et le séquençage. Des méthodes notables utilisant cette technique incluent BD Rhapsody et Singleron.

2. Séquençage de cellules uniques basé sur des microgouttelettes :

Cette technique commence par la dissociation des tissus pour générer une suspension de cellules uniques. En utilisant des puces microfluidiques, les cellules et les billes de capture sont encapsulées dans des gouttelettes en tirant parti de l'immiscibilité des phases huile et eau. Les billes de capture à l'intérieur de ces gouttelettes sont équipées de séquences Read1, de codes-barres, de codes-barres moléculaires et de séquences de capture. À l'intérieur de chaque gouttelette, les cellules individuelles sont lysées, leurs acides nucléiques libérés et capturés par les billes. Ces billes sont ensuite regroupées pour la préparation de la bibliothèque et le séquençage ultérieur. Les méthodes actuelles utilisant cette stratégie incluent Drop-seq, inDrop et 10× Genomics.

3. Solutions unicellulaires 10× Genomics :

10× Genomics domine le marché des cellules uniques, offrant une variété de produits qui facilitent la transcriptomique unicellulaire (scRNA-seq), le profilage immunitaire unicellulaire (siRNA-seq), l'accessibilité de la chromatine unicellulaire (snATAC-seq), les multi-omics (snRNA+ATAC) et le profilage des protéines de surface (scCITE-seq) à la résolution unicellulaire.

Nos services de séquençage unicellulaire

Nous utilisons des technologies de séquençage à cellule unique avancées, telles que 10x Genomics Chromium, pour fournir des solutions complètes pour le profilage des cellules individuelles, l'analyse de l'hétérogénéité tumorale et l'étude des processus de développement. Notre équipe d'experts garantit des résultats précis et fiables grâce à un contrôle qualité minutieux.

• Séquençage d'ARN à cellule unique

  • Le séquençage scRNA capture l'expression génique au niveau des cellules individuelles, offrant une image claire de la manière dont chaque cellule contribue à la fonction d'un tissu. Il est particulièrement précieux pour identifier des types cellulaires rares et comprendre les nuances du comportement cellulaire au sein de systèmes biologiques complexes.

• Séquençage de l'ADN à cellule unique

  • Cette méthode explore la composition génétique des cellules uniques, révélant des variations et des mutations spécifiques avec une grande précision. Elle fournit des informations cruciales sur la diversité génétique des tumeurs et aide à identifier les anomalies génétiques associées à diverses maladies.

• Séquençage de la méthylation de l'ADN à cellule unique

  • En analysant les motifs de méthylation de l'ADN au niveau des cellules individuelles, cette approche révèle comment les modifications épigénétiques influencent l'expression des gènes et maintiennent l'identité cellulaire. Elle est essentielle pour étudier le rôle de l'épigénétique dans le développement et la maladie.

• Séquençage unicellulaire 10x Genomics

  • En utilisant une technologie microfluidique de pointe et le marquage par codes-barres, 10x Genomics fournit des données complètes sur les cellules uniques. Cette plateforme excelle à offrir des aperçus détaillés des paysages transcriptomiques, génomiques et épigénomiques, améliorant notre compréhension de la diversité cellulaire et des interactions biologiques complexes.

Avantages du séquençage à cellule unique

• Flux de travail completUn processus complet, de bout en bout, conçu pour l'analyse du transcriptome entier des cellules individuelles.
• Débit maximalFacilite le traitement parallèle de jusqu'à 96 cellules uniques par course, une échelle sans précédent.
• Convivial : Nécessite moins de trois heures de temps pratique. Le traitement direct à partir de cellules uniques est possible, sans besoin d'étapes de fragmentation et de purification de l'ARN.
• Rentable: Offre une réduction de coût significative, étant un huitième du prix des autres systèmes de préparation de bibliothèques actuellement disponibles sur le marché.
• Technologie de pointeNous utilisons les dernières plateformes de séquençage à cellule unique, y compris 10x Genomics, garantissant des résultats précis et fiables.
• Soutien en bioinformatique expertNotre équipe de bioinformatique fournit une analyse de données robuste, offrant des perspectives sur l'hétérogénéité cellulaire, le traçage des lignées et la dynamique de l'expression génique.
• Solutions personnalisablesNous proposons des solutions sur mesure pour répondre aux exigences spécifiques de votre recherche, de la conception expérimentale à l'interprétation des données.

Applications du séquençage à cellule unique

• Profilage d'échantillons cliniques rares
• Mesurer l'hétérogénéité intra-tumorale et guider la chimiothérapie
• Analyse de l'évolution des cellules cancéreuses pendant la progression tumorale
• Diagnostic génétique préimplantatoire (DPI)
• Enquête sur la diversité des cellules immunitaires
• Déchiffrer la biologie du développement
• Étudier les troubles neurologiques
• Exploration des écosystèmes microbiens

Flux de travail de séquençage à cellule unique

L'avènement de la cytométrie en flux et de la microdissection par capture laser a rendu possible la capture de cellules uniques, et l'ADN ou l'ARN de ces cellules uniques a été amplifié pour le séquençage à cellule unique. Le flux de travail général pour le séquençage à cellule unique est décrit ci-dessous.

Exigences d'échantillon

Ci-dessous se trouvent les exigences d'échantillonnage pour certains de nos services de séquençage unicellulaire. Pour des informations plus détaillées, veuillez vous référer aux pages de services spécifiques ou aux Directives de Soumission d'Échantillons. De plus, si vous êtes intéressé par nos services, veuillez nous contacter pour confirmer les exigences d'échantillons de séquençage.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage à cellule unique pour votre rédaction (personnalisation)

La conférence de séquençage unicellulaire de CD Genomics explore les liens entre la diversité cellulaire au sein des tissus et la fonctionnalité des organes, mettant en lumière les causes sous-jacentes de diverses maladies. Pour toute demande ou question supplémentaire, n'hésitez pas à nous contacter.

Les résultats partiels sont affichés ci-dessous :

1. Le principe, les avantages et les inconvénients de l'amplification du génome à partir d'une seule cellule.

i. MDA (Amplification par Déplacement Multiple)

Inventé par Laskin et al. en 2001. Réagi en utilisant des amorces polymères aléatoires de six et la polymérase ADN φ29, qui avait de fortes propriétés de remplacement de chaîne et pouvait amplifier le fragment d'ADN de 50 à 100 kb dans des conditions isothermiques. En même temps, en raison de son activité exonucléase 3'-5' et de son activité de correction d'erreurs, la polymérase ADN φ29 présente une grande fidélité. La méthode MDA a une couverture génomique plus élevée.

ii. MALBAC (Cycles d'amplification basés sur le recuit multiple et la boucle)

Le processus d'amplification quasi-linéaire réduit la préférence de séquence de l'amplification exponentielle. Les amorces amplifiées à 5' contenant la séquence commune de 27 bp et 3' étant une séquence aléatoire de 8 bp, peuvent se combiner avec le modèle à basse température entre 15 et 20 °C, puis amplifier ces amplicons en forme d'anneau après l'amplification quasi-linéaire de 8 à 12 cycles.

L'avantage de la méthode MALBAC est que la préférence de séquence est répétable entre différentes cellules. En raison de son homogénéité d'amplification supérieure, ses données sont plus adaptées à l'analyse des CNV. La faiblesse de MALBAC est que la fidélité de la polymérase utilisée n'est pas aussi bonne que celle de la polymérase ADN φ29, donc MALBAC aura plus de faux positifs lors de la détection des SNV ; de plus, en raison de sa préférence de séquence répétable, la région d'amplification faible dans le génome est parfois perdue lors du processus d'amplification.

2. Exigences d'échantillonnage pour le séquençage de cellules uniques.

Amplification MDA : le volume d'échantillon ne doit pas dépasser 2 μL. Le tube PCR fourni par la société contient 2 μL de PBS. Amplification MALBAC : le volume d'échantillon ne doit pas dépasser 1 μL. Assurez-vous que les échantillons sont exempts de Ca2+ et de Mg2+, la société fournit un tube contenant 4 μL de lysat. Les échantillons doivent être séparés de manière indépendante autant que possible, en évitant l'adhésion cellulaire et les fragments cellulaires, ce qui pourrait affecter la qualité de l'amplification.

Analyse unicellulaire de l'hétérogénéité cellulaire et des interactions dans la moelle épinière blessée de la souris

Journal : Journal de Médecine Expérimentale

Facteur d'impact : 12,6

Publié : 16 juin 2021

Contexte

Dans les lésions de la moelle épinière (LME), diverses cellules gliales et vasculaires, ainsi que des leucocytes infiltrants, entraînent le processus complexe de guérison des blessures. Les étapes clés comprennent une réponse immunitaire précoce, un pic de prolifération gliale, puis une fibrose et une gliose. Le séquençage d'ARN à cellule unique (scRNA-seq) offre des aperçus détaillés sur les types de cellules et leurs interactions, améliorant notre compréhension des LME et d'autres blessures du système nerveux central.

Matériaux et Méthodes

Résultats

Les auteurs ont réalisé un séquençage d'ARN à cellule unique sur des échantillons de lésion de la moelle épinière (LME) pour analyser la diversité cellulaire. Cela a permis d'identifier 66 178 cellules et 15 types distincts, y compris des cellules immunitaires, vasculaires et gliales. Des signatures moléculaires uniques et des changements génétiques dépendants de la lésion ont été observés, offrant des perspectives sur les réponses cellulaires spécifiques et les biomarqueurs potentiels.

Fig 1. Identification transcriptomique des principaux types cellulaires qui composent le site de contusion de la moelle épinière thoracique moyenne chez la souris à des points temporels aigus.

L'analyse a révélé 12 sous-types de cellules myéloïdes, y compris quatre types de microglies et deux types de macrophages, avec des changements temporels significatifs après une lésion de la moelle épinière (LME). Les microglies sont passées d'états homéostatiques à des états inflammatoires, tandis que les macrophages ont évolué de sous-types inducteurs de chimiotaxie à des sous-types inflammatoires. Ces résultats ont été confirmés par l'immunohistochimie et la cytométrie en flux.

Fig 2. Identification transcriptomique des principaux sous-types myéloïdes immédiatement après une lésion de la moelle épinière.

L'analyse a révélé neuf clusters macrogliaux avec des changements distincts après la blessure. Les cellules astroependymales ont atteint un pic à 1 jour post-injury (dpi) puis ont diminué, tandis que les cellules de la lignée des oligodendrocytes ont progressé des progéniteurs oligodendrocytaires (OPCs) aux formes matures. Les OPCs et les astrocytes réagissent initialement de manière similaire mais développent des fonctions uniques d'ici 7 dpi, les OPCs jouant également un rôle dans la cicatrice gliale.

Fig 3. Profil moléculaire et temporel de l'hétérogénéité macrogliale immédiatement après une lésion de la moelle épinière (SCI).

Conclusion

Cette étude utilise la transcriptomique unicellulaire pour cartographier les types de cellules et leurs rôles au site de la lésion de la moelle épinière. Elle révèle des phases distinctes du comportement des cellules myéloïdes, y compris l'inflammation et la migration, et identifie les rôles clés des astrocytes et des cellules de pointe dans le remodelage vasculaire. Malgré certaines limitations dans l'exactitude de la récupération cellulaire, les données fournissent de nouvelles perspectives sur les interactions cellulaires et les processus dans la lésion de la moelle épinière.

Référence

1. Milich LM, Choi JS, Ryan C, et al. Analyse unicellulaire de l'hétérogénéité cellulaire et des interactions dans la moelle épinière blessée de la souris. Journal de Médecine Expérimentale. 2021, 218(8):e20210040.