Service de séquençage de méthylation de l'ARN 2'-O

CD Genomics propose des services de séquençage de méthylation 2'-O-RNA à la pointe de la technologie, spécifiquement conçus pour détecter et analyser les motifs de méthylation 2'-O dans les molécules d'ARN. Notre méthodologie offre une grande sensibilité et précision, permettant une identification précise des nucléotides méthylés. Ce service soutient des études approfondies sur la structure de l'ARN, sa stabilité et ses rôles régulateurs dans les processus biologiques.

Qu'est-ce que la méthylation 2'-O de l'ARN ?

La 2'-O-méthylation (Nm) est une modification post-transcriptionnelle de l'ARN, catalysée par des 2'-O-méthyltransférases, qui implique la substitution d'un atome d'hydrogène sur le groupe 2-hydroxyle par un groupe méthyle. Cette modification chimique se produit à la position 2' du ribose dans l'ARN et est médiée par des ARN méthyltransférases ou de la fibrillarine. Notamment, la méthylation de l'ARN 2'-O est une modification que l'on trouve de manière ubiquitaire chez diverses espèces, y compris les mammifères, les levures, les plantes et les virus.

Des études récentes ont démontré que la méthylation 2'-O-RNA est présente sur diverses molécules d'ARN telles que l'ARNm, l'ARNt, l'ARNr et l'ARNmi. Structurellement, cette modification augmente l'hydrophobicité du nucléotide, ce qui accroît sa stabilité. Les implications fonctionnelles de la méthylation 2'-O-RNA ont été élucidées dans plusieurs processus biologiques ; elle affecte les interactions ARN-protéine, régule l'efficacité de la traduction de l'ARNr et participe à la reconnaissance de l'ARNt.

L'ARN de transfert (ARNt) possède une vaste gamme de modifications post-transcriptionnelles cruciales pour exercer ses fonctions biologiques. Parmi celles-ci, la méthylation se distingue comme le type de modification d'ARNt le plus répandu, se produisant soit sur les bases nucléotidiques, soit à la position 2'-O-ribose (méthylation 2'-O). La modification par méthylation 2'-O est répandue chez les archées, les procaryotes et les eucaryotes, identifiée aux positions 4, 6, 18, 32, 34, 39, 44, 54 et 56 au sein de l'ARNt.

Des recherches indiquent que la 2'-O-méthylation joue un rôle régulateur dans le repliement, la maturation, la stabilité des tRNA et la précision de l'appariement entre l'anticodon et le codon de l'ARNm. Elle est étroitement associée à des processus cellulaires tels que la croissance, la réponse au stress et la régulation immunitaire. Les carences en 2'-O-méthylation des tRNA cytoplasmiques sont souvent liées à diverses maladies. Les enzymes impliquées dans la 2'-O-méthylation des tRNA représentent des cibles potentielles pour le développement de médicaments.

L'étude de la 2'-O-méthylation des tRNA et de ses enzymes modifiantes améliorera notre compréhension des fonctions biologiques de cette modification. De plus, cela jette les bases pour explorer les mécanismes pathogéniques des enzymes de 2'-O-méthylation des tRNA dans les maladies humaines.

Figure 1. Détection des ribose 2'-O-méthylations de l'ARN (Yuri Motorin, Virginie Marchand, 2018)

L'introduction du séquençage de la méthylation de l'ARN 2'-O

Pour détecter davantage de modifications de 2'-méthylation et élucider d'autres mécanismes fonctionnels biologiques, de nombreuses techniques expérimentales biologiques ont été proposées. Celles-ci incluent des méthodes basées sur l'ARNase H, des approches basées sur la transcription inverse et des stratégies basées sur la PCR. Cependant, ces méthodes sont souvent chronophages. Avec l'avancement des technologies de séquençage, l'accumulation de séquences nucléotidiques se poursuit. Le cœur du séquençage de la méthylation de l'ARN 2'-O réside dans l'identification des sites de 2'-O-méthylation au sein des molécules d'ARN à l'aide de méthodes chimiques ou enzymatiques, suivie d'une localisation précise et d'une quantification de ces sites par séquençage à haut débit Les techniques. La 2'-O-méthylation modifie les propriétés chimiques des molécules d'ARN, permettant l'identification et la localisation de ces modifications.

Actuellement, plusieurs méthodologies sont principalement utilisées pour le séquençage de la méthylation de l'ARN 2'-O :

• Ribose-seqCette technique se concentre sur l'ARN ribosomal (ARNr). Elle implique la clivage enzymatique ciblé des chaînes d'ARN pour libérer du ribose 2'-O-méthylé, qui est ensuite soumis à séquençage à haut débit.
• Nm-seqCette méthode utilise des modifications chimiques spécifiques pour marquer les sites de 2'-O-méthylation. Ces modifications permettent la reconnaissance des sites de méthylation par des réactions de transcription inverse suivies d'un séquençage à haut débit.
• Pseudouridine-seq (Ψ-seq)Bien que principalement conçu pour identifier les modifications de pseudouridine (Ψ), cette méthode peut être intégrée à d'autres techniques de détection pour faciliter l'étude de la 2'-O-méthylation.

CD Genomics propose un service complet de détection de la méthylation de l'ARN 2'-O, conçu pour identifier la présence de modifications de méthylation 2'-O sur les molécules d'ARN et déterminer les sites spécifiques de méthylation 2'-O. Au-delà du service proposé, CD Genomics a innové une gamme de produits conçus pour l'évaluation des niveaux de méthylation de l'ARN 2'-O dans diverses molécules d'ARN, englobant l'ARNm, l'ARNlnc, le pri-miARN, l'ARNt et l'ARNr.

Approches basées sur le séquençage profond pour la détection de la 2'-O-méthylation

Figure 2. Approches basées sur le séquençage profond pour la détection des résidus 2'-O-méthylés dans l'ARN (Yuri Motorin, Virginie Marchand, 2018)

Avantages de notre service de séquençage de méthylation de l'ARN 2'-O

• Précision des Nucleotides IndividuelsNotre service excelle dans la localisation des modifications de méthylation 2'-O-RNA avec une précision au niveau du nucléotide. Cette approche sophistiquée garantit un examen minutieux des emplacements de modification au sein des molécules d'ARN.
• Détection à haut débit efficaceEn utilisant des techniques avancées à haut débit, nous garantissons l'identification parallèle et efficace des sites de modification de l'ARN 2'-O dans l'ensemble du transcriptome. Cette stratégie permet l'évaluation simultanée de plusieurs molécules d'ARN, fournissant un aperçu complet des motifs de méthylation de l'ARN 2'-O.
• Couverture complète des espèces d'ARNNotre service couvre une large gamme de types d'ARN, englobant l'ARNm, l'ARN long non codant (LncRNA), le pri-miARN, l'ARNt et l'ARNr. Cette analyse approfondie garantit l'identification des sites de méthylation de l'ARN 2'-O sur divers molécules d'ARN, contribuant à une compréhension nuancée du paysage des modifications.
• Interprétation bioinformatique spécialiséeSoutenus par une équipe de bioinformatique compétente, nous proposons des services d'analyse de données spécialisés adaptés aux diverses exigences des clients. Notre équipe est experte dans la réalisation d'analyses de données approfondies, offrant des interprétations éclairantes des résultats issus des expériences de détection de méthylation de l'ARN 2'-O.

Applications du séquençage de la méthylation de l'ARN 2'-O

Le séquençage de la méthylation de l'ARN 2'-O a des applications importantes dans divers domaines de recherche, notamment :

• Recherche en biologie de l'ARNÉtudier les rôles de la 2'-O-méthylation dans la fonction de l'ARN, sa stabilité et la régulation de la traduction.
• Recherche sur les maladiesLa 2'-O-méthylation est associée à diverses maladies (par exemple, le cancer, les maladies neurodégénératives). La technologie de séquençage peut révéler les mécanismes de ces modifications dans les maladies.
• Développement de médicamentsL'identification des cibles liées à la 2'-O-méthylation constitue une base pour le développement de nouveaux médicaments.

Flux de travail de séquençage de la méthylation de l'ARN 2'-O

CD Genomics utilise des plateformes de séquençage avancées et des années d'expérience pour offrir des services complets de détection de la méthylation de l'ARN 2'-O. Ces services incluent principalement le traitement des échantillons, le séquençage et l'analyse bioinformatique subséquente.

Spécifications du service

	Exigences d'échantillon Types d'échantillons : Nous acceptons différents types d'échantillons, y compris des cellules, des tissus et de l'ARN. ARN : 100 μg - 300 μg Tissus : 500 mg - 5 g Cellule ≥ 1 x108 OD A260/A280 ratio ≥ 1,8, A260/230 ratio ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Tous les échantillons d'ARN total doivent être exempts d'ADN. L'ARN doit être conservé dans de l'eau sans nucléase ou dans RNA Stable. Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégie de séquençage Préparation de bibliothèque spécifique Illumina HiSeq PE 50/75/100/150
	Analyse bioinformatique Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Statistiques de la distribution du signal 2'-O-RNA Analyse de la carte du transcriptome méthylé en 2'-O-ARN Appel de méthylation de l'ARN 2'-O Analyse conservatrice évolutive Recherche de motifs Dépistage génétique différentiel des sites d'enrichissement Analyse d'enrichissement des voies KEGG Analyse d'enrichissement GO Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage de la méthylation de l'ARN 2'-O pour votre rédaction (personnalisation)

Explorez les modifications de l'ARN avec les services de séquençage de méthylation 2'-O-ARN de CD Genomics. Nous proposons un traitement avancé des échantillons, un séquençage précis et une analyse bioinformatique complète pour identifier et quantifier les sites de méthylation 2'-O. Contactez-nous pour améliorer votre recherche avec des informations détaillées sur la méthylation de l'ARN.

Référence

1. Motorin Y, Marchand V. Détection et analyse des 2'-O-méthylations de l'ARN ribose : défis et solutions. Gènes, 2018, 9(12) : 642.

Les résultats partiels sont présentés ci-dessous :

Référence

1. Dai Q, Moshitch-Moshkovitz S, Han D, et al. La séquence Nm cartographie les sites de 2'-O-méthylation dans l'ARNm humain avec une précision de base. Méthodes de la nature, 2017, 14(7) : 695-698.

1. Pourquoi l'ARNr est-il méthylé sur des 2' OH sélectionnés ?

L'ARNr (ARN ribosomique) subit une méthylation sur certains groupes 2'-OH pour plusieurs raisons critiques :

Stabilité structurelleLa 2'-O-méthylation contribue de manière significative à l'intégrité structurelle de l'ARNr. Cette modification joue un rôle clé dans la préservation de la conformation tridimensionnelle correcte de l'ARNr, qui est fondamentale pour le bon assemblage et la fonctionnalité du ribosome.

Résistance à la dégradationLa méthylation au niveau de la position 2'-OH renforce la résistance de l'ARNr aux ribonucléases, des enzymes responsables de la dégradation de l'ARN. Cette résistance accrue est essentielle pour maintenir la longévité et la fonction de l'ARNr au sein du ribosome.

Précision de la traductionLa 2'-O-méthylation est cruciale pour la fidélité de la synthèse des protéines. Les nucléotides modifiés aident à positionner avec précision les ARNt et l'ARNm pendant la traduction, minimisant ainsi les erreurs dans la synthèse des protéines.

Interaction avec les protéines ribosomiquesL'ARNr méthylé présente des interactions renforcées avec les protéines ribosomiques et d'autres facteurs liés à la traduction. Ces interactions sont essentielles pour l'assemblage et la stabilité du complexe ribosomique.

Sites fonctionnelsLa méthylation se produit à des sites spécifiques qui sont cruciaux pour l'activité ribosomique. Ces modifications peuvent affecter les fonctions catalytiques du ribosome et ses interactions avec d'autres molécules, garantissant ainsi une synthèse protéique efficace et efficiente.

2. Quels types d'ARN peuvent être analysés pour la 2'-O-méthylation ?

Cette méthode de séquençage peut être appliquée à divers types d'ARN, y compris :

• ARN messager (ARNm)
• ARN ribosomique (rARN)
• ARN de transfert (ARNt)
• ARN nucléaire small (snARN)
• ARN long non-codant (lncARN)

3. Pourquoi la méthylation de l'ARN 2'-O est-elle importante ?

La méthylation de l'ARN 2'-O revêt une importance significative pour divers processus cellulaires, englobant :

• Amélioration de la stabilité de l'ARN et de la résistance à la dégradation : Cette modification confère une stabilité accrue aux molécules d'ARN, les protégeant contre la dégradation par les ribonucléases et d'autres activités enzymatiques qui pourraient autrement compromettre l'intégrité de l'ARN.
• Maintenance des structures secondaires et tertiaires appropriées de l'ARN : En influençant le repliement et les conformations structurelles de l'ARN, la 2'-O-méthylation garantit que les molécules d'ARN adoptent des configurations essentielles à leurs fonctions biologiques.
• Régulation des interactions ARN-protéines : Cette méthylation facilite des interactions spécifiques et de haute affinité entre les molécules d'ARN et les protéines liant l'ARN, qui sont essentielles pour divers mécanismes régulateurs médiés par l'ARN.
• Précision et efficacité dans la traduction et l'épissage : la 2'-O-méthylation aide à l'exécution précise et efficace des processus de traduction et d'épissage, minimisant les erreurs et améliorant la fidélité et l'efficacité globales de la synthèse des protéines et du traitement de l'ARN.

4. Comment préparer mes échantillons pour le séquençage de la méthylation de l'ARN 2'-O ?

Pour préparer des échantillons :

• Utilisez des tissus ou des cellules frais ou correctement conservés.
• Suivez les protocoles d'extraction d'ARN recommandés pour obtenir de l'ARN de haute qualité.
• Évitez la contamination par les RNases pour prévenir la dégradation de l'ARN.

5. Combien de temps dure le processus de séquençage de la méthylation de l'ARN 2'-O ?

Le délai de traitement dépend de divers facteurs, y compris le nombre d'échantillons, la complexité de l'analyse et le prestataire de services. En général, le processus peut prendre plusieurs semaines, de la soumission des échantillons à la livraison des données.

Étude de cas 1:

La séquençage Nm (Nm-seq) cartographie les sites de 2'-O-méthylation dans l'ARNm humain avec une précision au niveau des bases.

Journal : Nature Methods

Facteur d'impact : 26,9

Publié : 28 février 2018

Contexte

Les modifications de l'ARNm, faisant partie de l'épitrancriptome, régulent l'expression des gènes et incluent la 2'-O-méthylation (Nm). Nm est abondante dans l'ARNr, l'ARNt, l'ARNsn et les microARN, essentiels à leur fonction et stabilité. Les méthodes de cartographie traditionnelles, telles que 2OMe-seq et RiboMeth-seq, identifient les sites Nm en détectant des pauses dans la transcription inverse ou une résistance à l'hydrolyse. Les méthodes existantes ont des difficultés avec les ARN rares ou les sites Nm à faible stoechiométrie. La nouvelle méthode Nm-seq utilise une clivage oxydatif pour cartographier les sites Nm avec une haute sensibilité et une précision à un nucléotide.

Matériaux et Méthodes

Résultats

Cet article présente, pour la première fois, l'identification de milliers de sites de méthylation sur l'ARNm humain des cellules HeLa et 293T et décrit la distribution de ces sites de méthylation. Parmi eux, la majorité des sites de méthylation (95,7 %) se situe au sein de 2398 gènes annotés par RefSeq, avec 95,9 % se produisant dans des gènes codant pour des protéines, et une petite fraction dans des gènes non codants (4,1 %). Au sein des transcrits codant pour des protéines, les données révèlent que la majorité des sites se trouvent dans la région de la séquence codante (CDS) (70,3 %). L'analyse des motifs indique que la séquence signature pour la 2'-O-méthylation est AGAU, suivie d'une forte distribution de bases A ou G. De plus, les sites de 2'-O-méthylation sont enrichis dans les codons codant pour trois acides aminés.

Figure 1 : Caractéristiques des sites de méthylation 2'-O-RNA sur les molécules d'ARNm des cellules humaines.

Conclusion

En résumé, cette étude révèle, pour la première fois, les caractéristiques de distribution de la 2'-O-méthylation dans les cellules humaines.

Étude de cas 2 : Implication de la méthyltransférase 2'-O-RNA FTSJ3 dans la régulation immunitaire innée du VIH

Récemment, le groupe de recherche dirigé par le professeur Yamina Bennasser à l'Université de Montpellier en France a découvert, pour la première fois, la présence de sites de 2'-O-méthylation sur le virus VIH. Ces sites montrent une activité dans l'infection des cellules hôtes et sont régulés par la méthyltransférase FTSJ3.

FTSJ3 en tant que 2'-O-Méthyltransférase:

Grâce à des expériences de spectrométrie de masse et de Western blot, il a été observé que la protéine lectrice de méthylation TRBP interagit avec la méthyltransférase FTSJ3, formant le complexe TRBP-FTSJ3.

Figure 2 : Formation de deux complexes distincts par TRBP.

Modification de 2'-O-méthylation dans les particules virales d'ARN du VIH-1:

Les chercheurs ont utilisé le séquençage de 2'-O-méthylation pour examiner l'état de méthylation de l'ARN du VIH-1. Ils ont identifié 17 sites de 2'-O-méthylation, dont 15 étaient situés sur l'adénine. Un séquençage de méthylation ultérieur de VIH-1 conditionné dans des cellules knockout FTSJ3 a révélé une réduction des niveaux de méthylation à plusieurs sites. Cela indique l'influence de la méthyltransférase FTSJ3 sur le schéma de 2'-O-méthylation.

Figure 3 : Profil de méthylation de l'ARN du VIH-1 et impact de la déplétion de FTSJ3.

Impliqué de FTSJ3 dans le mécanisme de régulation immunitaire du VIH-1:

Effet sur l'expression d'IFN-α/IFN-β : Tout d'abord, est-ce que le FTSJ3 intracellulaire influence l'infection des cellules hôtes par le virus ? Les chercheurs ont utilisé des cellules monocytes U937 exprimant l'ARN du VIH, avec soit un type sauvage (WT), soit un knockdown de FTSJ3-siRNA. Les résultats ont révélé une augmentation significative de l'expression d'IFN-α/IFN-β dans le groupe expérimental par rapport au groupe WT.

Figure 4 : Implication de FTSJ3 dans le processus de régulation immunitaire du VIH-1.

Régulation de MDA5 de la méthyltransférase dans la modulation immunitaire du VIH-1:

MDA5, agissant comme un capteur d'ARN cytoplasmique, joue un rôle crucial dans la réponse immunitaire. Après la réduction de l'expression de FTSJ3, il y a eu une diminution de l'expression de l'IFN. Par la suite, après la réduction de l'expression de MDA5, l'expression de l'IFN a augmenté. Ce résultat confirme que la méthyltransférase contribue à l'évasion de la méthylation 2'-O de l'ARN du VIH de la détection par MDA5, complétant ainsi l'évasion immunitaire.

Figure 5 : FTSJ3 module la sensibilité de la voie MDA5-IFN.

L'épuisement de FTSJ3 supprime la réplication du VIH.:

Pour évaluer l'impact de FTSJ3 sur la stimulation immunitaire cellulaire par le virus, les auteurs ont utilisé un knockout de FTSJ3 dans les MDDCs lors de l'infection virale. Clairement, les cellules knockout de FTSJ3 ont induit l'expression de la réponse antivirale de type I aux particules virales du VIH, tout en inhibant l'efficacité de l'expression du VIH-1. Ainsi, l'ARN non méthylé siFTSJ3-VIH induit une immunité innée contre l'ARN viral, supprimant la réplication du VIH.

Figure 6 : La déplétion de FTSJ3 supprime la réplication du VIH.

En résumé, cette étude révèle, pour la première fois, l'activité de 2'O-méthylation de l'ARN de FTSJ3 et confirme que le virus VIH peut recruter le système FTSJ3-TRBP après l'infection pour réaliser des modifications de 2'O-méthylation sur l'ARN viral. Par conséquent, cette modification réduit la sensibilité de la voie MDA5-IFN, diminuant ainsi la reconnaissance par le système immunitaire. Ce nouveau mécanisme d'évasion immunitaire du VIH-1 représente une promesse en tant que nouvelle cible thérapeutique pour le traitement du sida.

Références

1. Dai Q, Moshitch-Moshkovitz S, Han D, et al. La séquence Nm cartographie les sites de 2'-O-méthylation dans l'ARNm humain avec une précision au niveau des bases. Méthodes de la nature, 2017, 14(7) : 695-698.
2. Ringeard, M., Marchand, V., Decroly, E. et al. FTSJ3 est une 2'-O-méthyltransférase d'ARN recrutée par le VIH pour éviter la détection par le système immunitaire inné. Nature, 2019, 565, 500–504.