Séquençage de l'ARN exosomal

CD Genomics offre aux chercheurs sur les exosomes un service complet pour étudier les informations sur l'ARN associé aux exosomes.

L'introduction du séquençage de l'ARN exosomal

Les exosomes sont des vésicules dérivées des cellules qui sont présentes dans de nombreux fluides eucaryotes, et peut-être dans tous, y compris le sang, l'urine et le milieu de culture des cultures cellulaires. Une fois libérés, les exosomes circulent dans tout le corps, fusionnent avec d'autres cellules et transfèrent leur contenu à la cellule réceptrice. Des recherches récentes ont révélé des preuves que les exosomes jouent un rôle important dans la communication intercellulaire et la transmission des maladies.

Figure 1. Biogenèse et identification des exosomes. (Kalluri et al., 2020)

CD Genomics offre à ses clients un service complet de séquençage de l'ARN exosomal. Les exosomes contiennent des sous-ensembles distincts de microARN, d'ARNm, d'ARNlnc et d'autres ARN non codants. Les preuves s'accumulent que la livraison de miARN par transmission exosomale peut aboutir à un ARN long pleinement fonctionnel ou traduisible au sein d'une cellule réceptrice. Les miARN exosomaux peuvent jouer des rôles importants dans la communication intercellulaire et présentent un potentiel en tant que biomarqueurs pour détecter et surveiller les maladies. Le profilage de l'ARN exosomal fournit des informations sur la fonction de l'ARN associé aux exosomes et permet les applications comme indiqué ci-dessous.

• L'identification des changements dans les miARN exosomaux en état de maladie est considérée comme une méthode fiable pour découvrir des signatures de séquence pour le diagnostic et le pronostic des maladies.
• L'identité et le niveau d'expression de l'ARNm exosomal ont été considérés comme une approche précieuse pour découvrir des biomarqueurs à partir d'échantillons de biofluides sanguins, de salive et d'urine.
• Les ARN non codants longs (lncRNA) sont également présents dans les exosomes et peuvent montrer des profils d'expression qui sont distincts de ceux au niveau cellulaire.

Avantages du séquençage de l'ARN exosomal

• Échantillonnage non invasifLes échantillons d'ARN sont obtenus à partir de vésicules extracellulaires dans des fluides corporels tels que le sang, l'urine et la salive, éliminant ainsi le besoin de procédures invasives. Cette approche réduit l'inconfort du patient, minimise les risques et améliore l'adhésion des patients.
• Stabilité robusteL'ARN enfermé dans des vésicules extracellulaires est protégé par les membranes des vésicules, ce qui le rend plus stable par rapport à l'ARN libre, et donc moins susceptible à la dégradation par les enzymes de l'ARN. Cette stabilité accrue facilite la manipulation et le stockage des échantillons, renforçant finalement la fiabilité des données.
• Diversité et RichesseL'ARN exosomal englobe divers types de molécules d'ARN, y compris l'ARNm, les miARN et les lncARN, fournissant une richesse de données d'expression génétique qui reflète les états physiologiques cellulaires authentiques et les changements pathologiques.
• Réflexion cellulaire en temps réelProvenant de cellules vivantes, les vésicules extracellulaires offrent des aperçus en temps réel des conditions physiologiques et pathologiques cellulaires. Par conséquent, le séquençage de l'ARN exosomal peut être utilisé pour surveiller le début de la maladie, sa progression et les résultats des traitements.
• Haute Sensibilité et SpécificitéLes techniques de séquençage de l'ARN exosomal se distinguent par une sensibilité remarquable, capable de détecter des molécules d'ARN à faible abondance. De plus, la spécificité des vésicules, provenant de diverses origines cellulaires, permet un diagnostic précoce des maladies et un sous-typage précis grâce au séquençage de l'ARN.
• Applications variéesLe séquençage de l'ARN exosomal présente un potentiel immense dans diverses études sur les maladies, englobant le cancer, les troubles neurodégénératifs, les maladies cardiovasculaires, et au-delà. Son utilité s'étend au diagnostic précoce des maladies, à l'évaluation du pronostic, à la surveillance des traitements et à la découverte de nouveaux biomarqueurs.
• Faciliter des soins de santé personnalisésGrâce au séquençage de l'ARN exosomal, des profils d'expression génique personnalisés peuvent être obtenus. Lorsqu'ils sont intégrés à d'autres informations moléculaires, cela peut ouvrir la voie à l'élaboration de stratégies de traitement individualisées, améliorant l'efficacité thérapeutique et minimisant les réactions indésirables.

Flux de travail de séquençage de l'ARN exosomal

CD Genomics fournit l'ARN exosomal de bout en bout. NGS service incluant l'isolement des exosomes à partir de sérum, de plasma, d'urine, de milieux de culture tissulaire ou d'autres échantillons et l'extraction de leur ARN associé à l'aide de kits commerciaux. Le service de NGS exosomal de CD Genomics combine des bibliothèques barcodées NGS Illumina et séquençage de nouvelle génération plateformes, offrant des données de séquençage profond de la plus haute qualité pour accélérer votre recherche sur l'ARN exosomal.

Spécification de service

	Exigences d'échantillon ARN total ≥ 100 ng, Concentration ≥ 20 ng/µL Supernatants cellulaires ≥ 15 mL Sérum, plasma ≥ 1 mL OD A260/A280 ratio ≥ 1,8, A260/230 ratio ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Tous les échantillons d'ARN total doivent être exempts d'ADN. L'ARN doit être conservé dans de l'eau sans nucléase ou dans RNA Stable. Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégies de séquençage Les options de service flexibles incluent HiSeq 4000, HiSeq X ten et NextSeq 500, MGI DNBSEQ-T7/DNBSEQ-G400. Volume de données de séquençage : 10 Go
	Analyse de données Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Contrôle qualité des données brutes Alignement et quantification basée sur TPM/RPKM/FPKM Analyse d'expression Statistiques des SNPs/Indels Analyse du splicing alternatif Annotation GO et KEGG Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage de l'ARN exosomal pour votre rédaction (personnalisation)

La conférence sur le séquençage de l'ARN exosomal de CD Genomics se concentre sur les liens entre la variation cellulaire dans les tissus et la fonction des organes, et éclaire davantage les origines des maladies. Si vous avez des exigences supplémentaires ou des questions, n'hésitez pas à contactez-nous.

Référence :

1. Kalluri R, LeBleu V S. La biologie, la fonction et les applications biomédicales des exosomes. Science, 2020, 367(6478) : eaau6977.

Les résultats partiels sont présentés ci-dessous :

Distribution de la qualité de séquençage

Distribution A/T/G/C

Interface du navigateur IGV

Analyse de corrélation entre les échantillons

Graphique des scores PCA

Diagramme de Venn

Diagramme de volcan

Résultats statistiques de l'annotation GO

Classification KEGG

1. Quelle est la fonction de l'exosome dans l'ARN ?

L'exosome fonctionne comme un acteur clé dans le métabolisme de l'ARN, impliqué de manière complexe dans les mécanismes de dégradation et de traitement de l'ARN. Opérant en tant que complexe exoribonucléase de l'ARN au sein des cellules eucaryotes, l'exosome est dédié à la surveillance et à la décomposition d'un éventail de types d'ARN. Ce rôle central est primordial pour maintenir l'équilibre de l'ARN cellulaire, orchestrer les schémas d'expression génique et coordonner les réponses aux stress cellulaires. De plus, les exosomes participent aux voies de surveillance de l'ARN, supervisant méticuleusement l'assurance qualité des transcrits d'ARN avant la traduction.

2. Quelles espèces d'ARN se trouvent dans les exosomes ?

En ce qui concerne les espèces d'ARN encapsulées dans les exosomes, elles comprennent un riche assortiment, englobant l'ARN messager (ARNm), l'ARN micro (miARN), l'ARN non codant long (lncARN), l'ARN de transfert (ARNt) et divers ARN non codants mineurs. Protégées par la membrane bilipidique des vésicules, ces molécules d'ARN résident dans les exosomes à l'abri d'une dégradation rapide. La présence de certaines espèces d'ARN dans les exosomes dépend de variables telles que le type cellulaire, le milieu physiologique et les états pathologiques. De manière significative, ces ARN exosomaux ont la capacité d'être transférés aux cellules récipiendaires, où ils influencent les motifs d'expression génique et les fonctions cellulaires tant dans des contextes normaux que pathologiques.

3. Quelle méthode de préparation de bibliothèque devrions-nous choisir : à faible entrée ou standard ?

Lorsque la quantité d'ARN extrait dépasse 100 ng, il est conseillé d'employer la méthode standard de déplétion d'ARNr, en utilisant 100 ng d'ARN pour la préparation de la bibliothèque de transcriptome total. En général, un apport plus important de modèle lors de la préparation de la bibliothèque entraîne une couverture plus élevée des informations génétiques. L'approche de préparation de bibliothèque à faible entrée est utilisée lorsque la quantité d'échantillon est limitée ; cependant, chaque fois que cela est possible, les méthodes de préparation de bibliothèque conventionnelles sont préférées pour les procédures expérimentales.

4. En ce qui concerne les études sur les exosomes, devons-nous utiliser du plasma ou du sérum ?

La recommandation penche en faveur de l'utilisation du plasma en raison de la propension à l'activation des plaquettes lors de la coagulation dans la collecte de sérum, entraînant la génération d'un nombre significatif d'exosomes et d'autres vésicules. Par conséquent, les vésicules obtenues à partir de sérum sont systématiquement plus nombreuses que celles du plasma, avec plus de 50 % des vésicules provenant des plaquettes. Ainsi, le plasma constitue un milieu supérieur pour l'étude des exosomes dans des conditions physiopathologiques. La majorité des échantillons de recherche sur les exosomes circulants utilisent du plasma.

5. Quelles sont les considérations clés pour le séquençage de l'ARN des exosomes ?

Dans le contexte du séquençage de l'ARN des exosomes, plusieurs considérations critiques méritent d'être prises en compte :

Qualité de l'échantillonAssurer la qualité de l'échantillon source et le respect des procédures de collecte standardisées.

Pureté des exosomes: Mise en œuvre de méthodes d'extraction efficaces pour garantir la pureté et l'intégrité des exosomes.

Qualité de l'ARNL'ARN extrait doit présenter une excellente intégrité et pureté pour éviter la dégradation.

Plateforme technologiqueSélection d'une plateforme de séquençage appropriée pour garantir l'exactitude et la fiabilité des données.

Analyse des donnéesEngager une équipe d'analyse bioinformatique compétente pour garantir la rigueur scientifique et la robustesse de l'analyse des données.

6. Quelle est la méthode de construction de bibliothèque ?

CD Genomics prépare généralement des bibliothèques cDNA strandées et dépourvues d'ARNr à partir de l'ARN total sans ADN.

Des nanovésicules d'exosomes dérivées du porc cuit médiatisent des troubles métaboliques - les microARN pourraient être les coupables.

Journal : Journal de Nanobiotechnologie
Facteur d'impact : 11,509
Publié : 09 mars 2023

Résumé

des vésicules extracellulaires (EVs), y compris les exosomes et les ectosomes, qui représentent des structures enveloppées de lipides libérées par tous les types de cellules. Les exosomes, mesurant généralement entre 40 et 160 nm de diamètre, agissent comme des médiateurs cruciaux de la communication intercellulaire et présentent un potentiel en tant que marqueurs diagnostiques pour des maladies telles que le cancer, la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer. Comprenant des lipides, des protéines et des microARN (miARN), les miARN exosomaux dérivés de sources alimentaires peuvent être absorbés et exercer des fonctions biologiques essentielles au sein des organismes. Cette enquête vise à caractériser les exosomes et les profils de miARN extraits de porc cuit en utilisant séquençage à haut débit, élucidant leur impact sur la physiologie murine. Il met en évidence la résilience des exosomes et des miARN dans des conditions thermiques élevées et souligne l'importance diététique du porc en tant que composant nutritionnel principal.

Matériaux et Méthodes

Résultats

L'équipe de recherche a d'abord soumis divers tissus de porc (tissu adipeux, muscle, foie) à une cuisson approfondie dans l'eau, suivie de l'extraction de leurs exosomes par ultracentrifugation différentielle. L'examen de l'extrait au microscope électronique à transmission (MET) et à la microscopie à force atomique (MFA) a révélé des nanovésicules semblables à des exosomes. Une analyse supplémentaire utilisant la diffusion dynamique de la lumière (DDL) a indiqué que 80 % des particules mesuraient entre 20 et 200 nm, avec une taille moyenne de 70,29 nm. La cytométrie en flux subséquente a révélé des taux positifs de 84,5 % pour les marqueurs spécifiques des exosomes CD63 et de 95,9 % pour CD81. Ces résultats de caractérisation confirment l'extraction réussie d'exosomes à partir de tissus de porc cuits.

Fig 1. Identification des exosomes isolés à partir de viande cuite.

Lors de l'analyse par séquençage à haut débit, il a été observé que les exosomes dérivés de différents tissus présentent des variations dans les types et les quantités de miARN qu'ils contiennent. Dans le contenu exosomal du muscle de porc cuit (PMEx), les miR-1, miR-133a-3p et miR-206 constituent collectivement 80 % du total des miARN. Fait intéressant, dans les exosomes du foie de porc cuit (PLEx), le miR-122 prédomine, représentant 37,8 % du total des miARN, tandis que dans les exosomes du tissu adipeux de porc cuit (PFEx), le miR-125b est particulièrement abondant.

Fig 2. Des souris ont reçu de l'eau potable supplémentée en PME.

Après avoir administré les exosomes extraits à des souris pendant une période, plusieurs observations notables ont été faites : (1) une augmentation significative du poids corporel a été observée ; (2) les niveaux de miR-1, miR-133a-3p, miR-206 et miR-99a dans le sang ont considérablement augmenté, avec une élévation soutenue observée lors de l'expérience d'inversion des villosités intestinales ; (3) la présence de vacuoles et de gouttelettes lipidiques dans les tissus hépatiques ; (4) les niveaux de glucose à jeun ont considérablement augmenté et le taux de consommation a ralenti après une injection de glucose à jeun. Les résultats expérimentaux confirment que les CM-Exo peuvent être absorbés par les intestins des souris, influençant le poids corporel, les niveaux de miARN dans le sang et participant à des processus régulateurs biologiques tels que la tolérance au glucose, la signalisation endocrine du glucose et le métabolisme lipidique hépatique.

Fig 3. Vue d'ensemble des changements transcriptomiques du foie de souris.

L'analyse du transcriptome d'échantillons de foie de souris a identifié 446 gènes exprimés de manière différentielle (DEGs), dont 292 gènes surexprimés et 174 gènes sous-exprimés. Les analyses d'enrichissement GO et KEGG ont indiqué que ces DEGs sont principalement impliqués dans le métabolisme des stéroïdes. Par la suite, un réseau de régulation putatif miRNA-mRNA-métabolisme lipidique a été construit, révélant une interconnexion significative entre le miRNA exosomal et les voies métaboliques lipidiques hépatiques.

Fig 4. Les 100 principaux gènes hubs identifiés à partir du réseau PPI ; réseau régulatoire des voies miARN–ARNm–métabolisme des lipides.

Conclusion

Les vésicules extracellulaires, ou exosomes, ont suscité une attention considérable en biologie cellulaire en raison de leurs applications thérapeutiques et diagnostiques potentielles. Initialement considérés comme de simples déchets cellulaires, nous comprenons maintenant que leurs fonctions vont bien au-delà de l'élimination des déchets. Les exosomes représentent un mode de communication cellulaire novateur, contribuant à une gamme de processus biologiques pertinents pour la santé et la maladie.

En utilisant la centrifugation différentielle ultracentrifuge, l'équipe de recherche a réussi à isoler des exosomes à partir de porc cuit (tissu adipeux, muscle, foie). L'analyse transcriptomique a révélé des différences distinctes dans le contenu en miARN encapsulé au sein des exosomes provenant de différents tissus. L'alimentation des souris avec des exosomes et la réalisation d'expériences de boucle intestinale ont confirmé que les CM-Exo peuvent être absorbés par le tractus intestinal, impactant le poids corporel et les niveaux de miARN dans le sang, entraînant un signalement glucidique endocrinien et des perturbations dans le métabolisme lipidique hépatique. Dans l'ensemble, les microARN au sein des CM-Exo semblent jouer un rôle clé en tant que facteurs régulateurs dans l'induction de perturbations métaboliques chez les souris.

Référence :

1. Shen L, Ma J, Yang Y, et al.Des nanovesicules d'exosomes dérivées du porc cuit médiatisent des troubles métaboliques - les microARN pourraient en être la cause. Journal de Nanobiotechnologie, 2023, 21(1) : 83.