Service de séquençage de la méthylation de l'ARN par nanopore

CD Genomics propose des services de séquençage de méthylation de l'ARN Nanopore à la pointe de la technologie pour révéler les motifs de modification m6A directement à partir des molécules d'ARN. Notre méthode à haut débit permet une analyse à résolution de base unique, offrant des informations détaillées sur l'épigénétique de l'ARN. Ce service soutient les investigations sur la régulation des gènes, le métabolisme de l'ARN et les mécanismes de la maladie.

Qu'est-ce que le séquençage RNA par nanopore ?

La méthylation de l'ADN et la méthylation de l'ARN sont des processus facilités par des méthyltransférases, où un groupe méthyle (CH3) est ajouté à un atome spécifique d'une molécule d'ADN ou d'ARN. Dans l'ARN cellulaire, plus de 100 types de modifications chimiques ont été identifiés. Parmi les diverses modifications de méthylation de l'ARN, on trouve la méthylation de l'ARN m6A, la méthylation de l'ARN m5C, la méthylation de l'ARN m1A, la méthylation de l'ARN m7G, et d'autres. Parmi celles-ci, la plus importante et la plus étudiée est la méthylation de l'ARN m6A, qui se produit au sixième atome d'azote du résidu d'adénine dans les molécules d'ARN (N6-méthyladénosine, m6A). Cette modification représente la modification post-transcriptionnelle la plus courante dans l'ARNm eucaryote, constituant environ 80 % de toutes les modifications de méthylation de l'ARN.

Le séquençage de la méthylation de l'ARN par ONT est réalisé en utilisant la technologie des nanopores. Les nanopores sont de petits pores ayant un diamètre dans la plage des nanomètres. Lorsqu'un brin simple d'ARN passe à travers un nanopore, il génère des variations de courant électrique. Ces fluctuations de courant peuvent être enregistrées avec précision et déchiffrées par des algorithmes spécifiques pour révéler les informations de séquence de l'ARN ainsi que ses modifications de méthylation. L'aspect clé de la technologie ONT réside dans sa capacité à séquencer directement de longues molécules d'ARN et à détecter diverses modifications sur l'ARN, y compris l'adénine N6-méthylée (m6A), la cytosine 5-méthylée (m5C) et d'autres.

Méthodes de détection de la méthylation de l'ARN

MeRip-seq (Immunoprécipitation de l'ARN méthylé):

MeRip-seq est basé sur le principe de la liaison spécifique des anticorps aux bases méthylées. Il utilise des anticorps spécifiques à l'm6A pour l'immunoprécipitation afin d'enrichir les fragments d'ARN qui subissent une méthylation. Le séquençage à haut débit est ensuite utilisé pour détecter les transcrits avec des modifications m6A. Cependant, cette méthode ne peut identifier que les régions à forte méthylation et manque de résolution à une seule base pour reconnaître la méthylation de l'ARN.

Technologie de séquençage par nanopore:

Séquençage par nanopore est un séquençage à lecture longue une technologie basée sur la reconnaissance des signaux électriques des séquences de bases. Différentes modifications des bases d'ARN entraînent des variations de la taille de l'obstruction lorsqu'elles passent à travers un canal nanopore, générant des signaux électriques caractéristiques. La surveillance en temps réel de ces signaux permet de déterminer les types de bases correspondants et si elles portent des modifications de base. En d'autres termes, le séquençage par nanopore peut effectuer directement séquençage du transcriptome complet sur des échantillons d'ARN naturels sans avoir besoin d'une liaison d'anticorps spécifique. Cela permet la détection des modifications de méthylation m6A (N6-méthyladénosine) sur l'ARN avec une résolution à base unique, tout en fournissant simultanément une expression quantitative des gènes/transcrits et une identification de la structure des transcrits.

Principes du séquençage de la méthylation de l'ARN par nanopore

La technologie de séquençage par nanopore exploite la détection des signaux générés lorsqu'une seule molécule passe à travers un nanopore, provoquant une différence de potentiel de part et d'autre du pore. Le diamètre du nanopore permet uniquement le passage de polymères de nucléotides individuels. La nature chargée des différentes bases, y compris celles avec des modifications méthylées, varie, permettant la détection des types de bases correspondants et des informations sur la méthylation par le biais de différences dans les signaux électriques.

Avantages du service de séquençage de méthylation de l'ARN par nanopore

• Résolution à un seul nucléotide à travers tout le transcriptome : Identification des modifications de méthylation m6A à une résolution d'un seul nucléotide dans tout le transcriptome.
• Lecture directe des informations de méthylation m6A : extraction directe des informations de méthylation m6A sans avoir besoin d'expériences d'enrichissement par immunoprécipitation.
• Quantification simultanée de l'expression des gènes/transcrits et de la structure des transcrits : Réalisation à la fois d'une analyse quantitative de l'expression des gènes/transcrits et d'une enquête sur la structure des transcrits de manière conjointe.
• Absence de transcription inverse et biais de PCR : Séquençage d'ARN direct par nanopore élimine le besoin de perturbation, de transcription inverse et d'amplification par PCR, permettant ainsi la détection directe séquençage du transcriptome complet d'échantillons d'ARN naturel.

Applications du séquençage de méthylation de l'ARN par nanopore

• Étudier le rôle fonctionnel des participants moléculaires impliqués dans les processus de méthylation de l'ARN lors de maladies ou de processus vitaux spécifiques.
• Déchiffrer les modifications de méthylation de l'ARN pendant les maladies ou des processus de vie particuliers, éclaircissant ainsi les motifs de méthylation de l'ARN m6A spécifiques aux maladies.
• Explorer la relation entre des modifications spécifiques de méthylation de l'ARN et les maladies au cours de maladies ou de processus de vie spécifiques.
• Identifier de nouvelles molécules impliquées dans les modifications de méthylation de l'ARN ou établir de nouvelles méthodologies pour l'étude des modifications de méthylation de l'ARN.

Flux de travail de séquençage de la méthylation de l'ARN par nanopore

Fig 1. Étapes de préparation de la bibliothèque utilisant les technologies Oxford Nanopore. (Nicky Jonkhout et al., 2017)

Spécifications de service

	Exigences d'échantillon Espèces : Humain, souris et rat uniquement, d'autres espèces à évaluer. ARN total ≥ 15 μg Cellule ≥ 1 x107 Les échantillons d'ARN doivent avoir un RIN ≥ 8. Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégie de séquençage Séquençage par nanopores La longueur moyenne de lecture peut atteindre des dizaines à des centaines de ko, les longueurs de lecture les plus longues dépassant 2 Mo.
	Analyse bioinformatique Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Détection de la méthylation de l'ARN m6A Analyse comparative des niveaux de méthylation m6A à travers différents motifs. Analyse comparative des niveaux de méthylation m6A entre différents échantillons. Enquête fonctionnelle des niveaux de méthylation m6A. Quantification de l'expression des gènes/transcrits et identification des variations structurelles des transcrits: Quantification précise de l'expression des gènes/transcrits au niveau des transcrits pour identifier les transcrits différemment exprimés. Identification des gènes fonctionnels. Détection précise du splicing variable, de la polyadénylation alternative (APA), des gènes de fusion, etc. Analyse de corrélation: Analyse de corrélation entre la méthylation de l'ARN m6A et l'expression des gènes/transcrits. Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont uniquement à titre de référence. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage de la méthylation de l'ARN Nanopore pour votre rédaction (personnalisation)

Explorez la méthylation de l'ARN avec le séquençage de la méthylation de l'ARN Nanopore de CD Genomics. Nous proposons un séquençage direct de l'ARN et une analyse bioinformatique complète pour découvrir des motifs épigénétiques. Contactez-nous pour faire progresser vos connaissances en recherche.

Référence

1. Jonkhout N, Tran J, Smith MA, et al. Le paysage des modifications de l'ARN dans les maladies humaines. ARN2017, 23(12) : 1754-69.

Les résultats partiels sont affichés ci-dessous :

1. Quelles molécules sont impliquées dans les processus de modification de l'ARN ?

Dans le processus de modification de l'ARN, plusieurs molécules clés sont impliquées. Les "writers", tels que METL3 et METTL14, catalysent la méthylation de l'ARN, avec WTAP jouant un rôle crucial dans ce complexe méthyltransférase. Ces enzymes facilitent la méthylation m6A de l'ARNm (et d'autres ARN nucléaires) à la fois in vitro et in vivo. D'autre part, les "erasers" comme FTO et ALKBH5 sont responsables de l'élimination des signaux de méthylation m6A de l'ARN, médiant ainsi le processus de déméthylation. Les "readers", quant à eux, sont des protéines qui interprètent l'information modifiée dans l'ARN et participent à des processus en aval tels que la traduction et l'épissage. Les protéines avec des domaines YTHDF, par exemple, peuvent reconnaître et se lier à m6A dans l'ARNm, entraînant une diminution de la stabilité de l'ARNm et favorisant sa dégradation.

2. Quels types de méthylation de l'ARN peuvent être détectés avec le séquençage de méthylation de l'ARN Nanopore ?

Cette méthode peut détecter diverses modifications de méthylation de l'ARN, y compris l'N6-méthyladénosine (m6A), la 5-méthylcytosine (m5C) et d'autres.

3. Quelles applications de recherche peuvent bénéficier du séquençage de la méthylation de l'ARN par Nanopore ?

Cette technologie est précieuse pour étudier la régulation épigénétique de l'expression génique, le traitement de l'ARN et divers processus biologiques influencés par les modifications de l'ARN. Elle permet aux chercheurs d'explorer les changements dynamiques dans les motifs de méthylation de l'ARN dans différentes conditions.

4. Comment le séquençage de la méthylation de l'ARN par Nanopore se compare-t-il à d'autres méthodes comme le MeRIP-seq ou le CM-seq ?

Contrairement aux méthodes basées sur des anticorps (par exemple, MeRIP-seq) ou des approches de modification chimique (par exemple, CM-seq), le séquençage de la méthylation de l'ARN par Nanopore lit directement les séquences d'ARN et les modifications en temps réel, offrant des avantages en termes de couverture complète et de biais réduit.

5. Quels sont quelques résultats typiques du séquençage de la méthylation de l'ARN par Nanopore ?

Les résultats incluent des profils de méthylation détaillés des transcrits d'ARN, la visualisation des motifs de méthylation (par exemple, des graphiques en violon), l'analyse de la méthylation différentielle et les annotations fonctionnelles des sites méthylés à travers le transcriptome.

Médiée par FIONA1 m⁶Une modification régule la transition florale dans Arabidopsis

Journal : Science Avancée

Facteur d'impact : 17,521

Publié : 05 janvier 2022

Contexte

m6A est une modification courante de l'ARNm, essentielle pour la régulation des gènes, affectant le traitement, la stabilité et la traduction de l'ARNm. Des techniques telles que m6A-seq, m6A-CLIP, et séquençage par nanopore permettre un mappage précis des sites m6A à travers le transcriptome. Dans ArabidopsisLa déposition de m6A implique des méthyltransférases complexes ciblant des régions et motifs spécifiques de l'ARNm. FIO1, identifié comme un nouveau méthyltransférase m6A, influence le temps de floraison en régulant les niveaux de m6A dans des gènes clés comme SOC1. Le séquençage par nanopore révèle des informations sur la dynamique de m6A, soulignant le rôle de FIO1 dans le développement des plantes et le contrôle de l'expression génique.

Matériaux et Méthodes

Résultats

Perturber FIO1 dans Arabidopsis réduit légèrement les niveaux globaux de m6A de l'ARNm. FIO1, similaire à METTL16 humain, contient un domaine de méthyltransférase conservé et est largement exprimé dans Arabidopsis tissus. Les mutants (fio1-1 et fio1-2) présentent une floraison précoce, avec fio1-2 montrant une diminution de l'expression de FIO1. L'analyse confirme des diminutions d'environ 14 % et 10 % des niveaux de m6A dans l'ARN total et l'ARNm des mutants fio1-2 par rapport aux plantes de type sauvage, indiquant l'implication de FIO1 dans la méthylation m6A.

Figure 1 FIO1 affecte la floraison et les niveaux d'ARNm m6A dans Arabidopsis.

Le séquençage direct de l'ARN par nanopore des mutants fio1 a identifié 3459 sites hypométhylés en m6A dans les séquences codantes (CDS). Cette approche, utilisant l'analyse xPore, a mis en évidence une préférence pour le motif YHm6AGA et a révélé des réductions des niveaux de m6A principalement avant les codons stop. L'analyse fonctionnelle a lié ces changements à la floraison précoce chez les mutants fio1, confirmant le rôle de FIO1 en tant que méthyltransférase m6A essentielle pour la modification de l'ARNm et la régulation du développement. Arabidopsis.

Figure 2 Distribution des sites hypométhylés dans fio1-2.

La méthylation m6A médiée par FIO1 dans Arabidopsis influence l'abondance des transcrits et la polyadénylation alternative (APA), affectant principalement les gènes enrichis en séquences codantes (CDS). Les sites hypométhylés dans les mutants fio1 corrèlent avec une expression génique régulée à la baisse, y compris le régulateur clé de la floraison SOC1. FIO1 module directement SOC1 et d'autres gènes de l'horloge circadienne, allongeant leur période d'expression et impactant indirectement le temps de floraison. Ces résultats mettent en évidence FIO1 comme une méthyltransférase m6A distincte ciblant des régions spécifiques de l'ARNm pour réguler les processus de développement chez les plantes.

La figure 3 FIO1 régule l'abondance des transcrits et la polyadénylation alternative.

Figure 4 Un modèle proposé décrivant la fonction de FIO1 dans la modification m6A et le contrôle du temps de floraison dans Arabidopsis.

Conclusion

Cette étude révèle que FIO1 est une méthyltransférase m6A unique chez les plantes, modifiant principalement les séquences codantes de certains transcrits codant des protéines. La méthylation m6A médiée par FIO1 influence l'abondance des transcrits et la polyadénylation alternative, tout en montrant un effet minimal sur l'épissage alternatif. Il est important de noter que FIO1 régule SOC1 et ses régulateurs en amont, modulant ainsi le temps de floraison. Ces résultats améliorent notre compréhension de la dynamique m6A chez les plantes et établissent des parallèles avec la modification de l'ARN médiée par METTL16 chez les animaux.

Référence

1. Xu T, Wu X, Wong CE, et al. Médiée par FIONA1 m⁶Une modification régule la transition florale dans Arabidopsis. Science avancée. 2022, 9(6):2103628.