Directives de soumission d'échantillons
Le besoin critique de validation génomique des organoïdes
Les organoïdes dérivés de patients (PDO) ont révolutionné la modélisation des maladies, la médecine personnalisée et l'oncologie de précision en préservant l'architecture tridimensionnelle, les interactions entre cellules et les caractéristiques fonctionnelles des tissus primaires. Contrairement aux lignées cellulaires 2D traditionnelles — qui ont passé des décennies à s'adapter à des surfaces plastiques planes et abritent souvent des génomes entièrement étrangers à ceux du patient d'origine — les PDO sont salués comme de véritables "avatars" de l'état pathologique humain. Cependant, la morphologie visuelle et l'expression de quelques marqueurs de surface ne peuvent à elles seules garantir qu'un organe reste une représentation fidèle de la maladie du patient au niveau moléculaire.
La recherche translationnelle repose fortement sur l'hypothèse qu'un modèle d'organoïde reflète celui du patient. in vivo tumeur. Pourtant, l'établissement des PDO représente un goulot d'étranglement évolutif significatif. Alors que les organoïdes sont établis et passés. in vitro, ils sont continuellement soumis à des pressions de sélection artificielle. Les facteurs de croissance spécifiques dans les milieux (par exemple, EGF, Noggin, R-spondin) peuvent favoriser involontairement la prolifération des cellules épithéliales de type sauvage par rapport aux cellules tumorales, un phénomène connu sous le nom de surcroissance des cellules normales. Alternativement, les conditions de culture pourraient sélectionner un sous-clone spécifique à croissance rapide qui ne représente pas la majorité de la tumeur primaire hétérogène.
Au fil du temps, des sous-clones mineurs peuvent disparaître complètement, une dérive génétique induite par la culture peut se produire, et de manière critique, des mutations conductrices ciblables pourraient être perdues en raison du stress réplicatif et de l'absence d'un système immunitaire intact pour éliminer les cellules aberrantes.
Le séquençage de l'exome complet agit comme le point de contrôle de qualité (QC) ultime pour vos modèles. En profilant l'ensemble de la région codante, qui abrite la grande majorité des mutations connues causant des maladies et ciblables par des médicaments, les chercheurs peuvent répondre de manière concluante :
- Confirmation d'identité: L'organoïde abrite-t-il le spécifique KRAS, TP53, PIK3CA, ou EGFR mutations conductrices identifiées dans le rapport clinique du patient ?
- Hétérogénéité clonaleLes populations subclonales mineures de la tumeur primaire sont-elles préservées dans la culture 3D, ou la culture est-elle devenue monoclonale ?
- Stabilité génomiqueLe profil génomique dérive-t-il de manière significative après 10, 20 ou 30 passages ?
- Absence d'artefactsDes mutations hyper-prolifératives nouvelles sont-elles apparues ? in vitro qui pourrait fausser les résultats ?
Sans validation WES, les chercheurs risquent d'identifier des sensibilités aux médicaments ou des mécanismes de résistance qui sont des artefacts du système de culture plutôt que de véritables reflets de la biologie du cancer du patient. Des millions de dollars en efforts de dépistage peuvent être gaspillés si le modèle sous-jacent ne contient pas la cible d'intérêt.
Conception d'étude par échantillons appariés : La comparaison des triades
Pour identifier de manière fiable les mutations spécifiques aux tumeurs, l'analyse de l'organoïde de manière isolée est totalement insuffisante. Nous concevons séquençage de l'exome entier projets autour des relations comparatives qui soustraient avec précision le bruit de fond hérité.
Lors de l'évaluation d'un organoïde dérivé d'un patient, le design d'étude de référence implique un "Triade" en trois composants :
- Tissu normal apparié (ou sang)Établit les variants germinaux héréditaires de base du patient. Étant donné que les génomes humains contiennent des millions de SNP héréditaires bénins, un échantillon normal apparié du même patient est essentiel.
- Tissu tumoral primaire: Définit le profil de mutation somatique original (la "vérité fondamentale" du cancer) avant toute in vitro manipulation.
- Modèle d'organoïde: Représente l'établi in vitro culture en cours d'évaluation.
En séquençant simultanément les trois composants, nos pipelines de bioinformatique avancée peuvent filtrer avec précision les variants germinaux. Cela empêche les appels de mutations somatiques faussement positives. Par exemple, sans un échantillon normal apparié, un SNP hérité rare pourrait être classé à tort comme un nouvel entraîneur spécifique à la tumeur. Nos pipelines utilisent des modèles statistiques complexes (tels que des algorithmes de génotypage somatique bayésien) pour comparer les fréquences alléliques entre les échantillons normaux, tumoraux et organoïdes, garantissant que seules les véritables mutations acquises sont rapportées.
Si des tissus normaux appariés ne sont absolument pas disponibles (ce qui est courant pour les échantillons de biobanques provenant de sources commerciales), nous pouvons utiliser des stratégies d'appel basées uniquement sur les tumeurs. Ces stratégies exploitent d'énormes bases de données de population (par exemple, dbSNP, gnomAD, 1000 Genomes Project) ainsi que des panneaux de normaux (PoN) pour filtrer les variants germinaux communs et rares. Bien que cette approche soit efficace, elle limite intrinsèquement la certitude absolue de la confirmation des variants somatiques par rapport à la conception Triad.
Applications clés dans la recherche translationnelle
Nos services WES d'organoïdes soutiennent un large éventail d'applications de recherche translationnelle et préclinique avancées :
- Validation et Certification de Biobanques OrganoïdesAvant de distribuer des PDO pour des études à grande échelle ou une commercialisation, les biobanques doivent caractériser rigoureusement leurs modèles. Le WES fournit la certification génomique standard selon laquelle un modèle reflète fidèlement le tissu du donneur.
- Corrélations entre la pharmacogénomique et le dépistage des médicamentsWES permet aux chercheurs de corréler des altérations génomiques spécifiques (par exemple, des mutations de Déficit en Recombinaison Homologue [HRD] comme BRCA1/2) avec la réponse de l'organoïde aux thérapies ciblées (par exemple, les inhibiteurs de PARP), en veillant à ce que le mécanisme d'action du médicament corresponde au génotype du modèle.
- Modélisation de la résistance thérapeutique acquiseEn séquençant longitudinalement des organoïdes avant le traitement, pendant le traitement et après l'émergence de la résistance. in vitroles chercheurs peuvent identifier de nouvelles mutations exoniques acquises qui confèrent une résistance aux médicaments, imitant une rechute clinique.
- Études sur l'évolution des tumeurs et l'hétérogénéité spatialeLes chercheurs peuvent effectuer un échantillonnage multi-régional d'une tumeur primaire et établir des lignées d'organoïdes distinctes à partir de ces régions spécifiques. Le séquençage de l'exome entier (WES) de ces lignées aide à modéliser l'hétérogénéité spatiale et l'évolution clonale. in vitro.
- Modèles précliniques "Avatar" pour les essais co-cliniquesDans les configurations d'essais cliniques co-cliniques, les avatars de patients (PDO) sont traités avec des médicaments en parallèle avec le patient. Le séquençage de l'exome entier (WES) confirme que l'avatar conserve les mutations spécifiques ciblables à l'origine de la réponse clinique du patient.
Flux de travail WES de bout en bout pour les organoïdes
La manipulation de cultures d'organoïdes 3D nécessite une expertise spécialisée pour surmonter des défis uniques tels que la contamination par la matrice extracellulaire (MEC), les noyaux nécrotiques et les faibles rendements cellulaires. Notre flux de travail en laboratoire est fortement optimisé pour maximiser la qualité des données à partir d'entrées limitées et complexes.
Notre flux de travail WES complet comprend des points de contrôle QC critiques pour garantir un appel de variantes somatiques de haute qualité à partir de modèles d'organoïdes.
Réception d'échantillons et extraction d'ADN sans matrice:
- Accepte des organoïdes vivants, des pellets congelés ou de l'ADN génomique pré-extrait.
- L'élimination complète de Matrigel, BME ou des hydrogels synthétiques est absolument essentielle. Les protéines matricielles résiduelles inhibent les réactions enzymatiques.
- Point de contrôle QCConcentration d'ADN (Qubit), pureté (NanoDrop) et intégrité (DIN > 7 via TapeStation).
Préparation de bibliothèque avancée et capture d'exome:
- L'ADN de haute qualité est fragmenté en 150-250 pb à l'aide de cisaillement acoustique (Covaris) ou d'enzymes.
- Les adaptateurs avec des indices doubles uniques (UDI) sont ligaturés pour minimiser le saut d'index.
- Hybridation avec des sondes de capture d'exome de pointe (Agilent SureSelect XT HS2 ou Twist Bioscience) ciblant les régions codantes, les UTR et les séquences introniques flanquantes.
Stratégie de séquençage ultra-profond:
- Séquencé sur des plateformes Illumina de pointe (NovaSeq X Plus, PE150).
- 100X de profondeur pour les échantillons normaux, ≥200X à 500X de profondeur pour les tumeurs primaires et les organoïdes.
- Le séquençage profond garantit une détection robuste et statistiquement significative des sous-clones rares (VAF < 10 %).
Analyse bioinformatique avancée des triades:
- Filtrage de qualité et alignement sur le génome de référence humain (hg38) à l'aide de BWA-MEM.
- Appel de variantes en ensemble utilisant des algorithmes de pointe (GATK Mutect2, Strelka2, VarScan2) pour un appel précis.
- Annotation fonctionnelle complète des SNV et InDels.
Si vous débutez votre projet, notre services de développement de modèles organoïdes peut aider à coordonner la collecte et le stockage des tissus normaux et tumoraux appariés avec vos organoïdes.
Analyse bioinformatique spécialisée pour les PDOs
Nous ne fournissons pas simplement une liste brute de mutations ; nous proposons un cadre analytique comparatif qui répond directement à la question de savoir si votre modèle est adapté à votre objectif de recherche spécifique. Nos livrables en bioinformatique sont conçus pour être prêts à être publiés.
Fonctionnalités standard du pipeline
- Annotation de variante: Utiliser ClinVar, COSMIC, dbNSFP et SIFT/PolyPhen pour prédire les impacts fonctionnels.
- Analyse de concordance génomiqueCalculs de l'indice de similarité de Jaccard et diagrammes de Venn pour quantifier le chevauchement somatique exact entre la tumeur primaire et l'organoïde.
- Évaluation de la corrélation VAF: Graphiques de dispersion comparant les fréquences alléliques des variants pour révéler si certains sous-clones ont été enrichis ou appauvris pendant la culture.
Modules avancés optionnels
- Analyse des signatures mutationnellesExtraction des signatures COSMIC pour déterminer si les processus mutationnels fondamentaux sont maintenus. in vitro.
- Inférence de CNV basée sur l'exome: Utiliser des outils comme CNVkit ou EXCAVATOR2 pour inférer des variations du nombre de copies ciblées (par exemple, HER2/ERBB2 amplifications ou PTEN suppressions) directement à partir de la couverture WES.
- Scoring TMB et MSIEstimation précise de la charge mutationnelle tumorale et du statut d'instabilité des microsatellites directement à partir des données d'exome.
- Soustraction de lecture de souris (Contrôle de xénogreffe): Utilisation in silico des outils comme Xenome pour cartographier les lectures sur les génomes de référence humain et murin, en soustrayant proprement la contamination par l'ADN murin des modèles dérivés de PDX.
Pour l'intégration phénotypique, envisagez de coupler cela avec notre services de caractérisation d'organoïdes.
Exigences et directives de préparation des échantillons
Une préparation d'échantillon appropriée détermine le succès ultime de la capture et du séquençage de la bibliothèque. Les organoïdes intégrés dans des extraits de membrane basale nécessitent une manipulation soigneuse pour éviter des échecs analytiques en aval. De plus, les grands organoïdes développent souvent des noyaux nécrotiques qui peuvent libérer de l'ADN dégradé, affectant négativement la complexité de la bibliothèque.
| Type d'échantillon | Entrée minimale | Préparation et expédition | Considération clé |
|---|---|---|---|
| ADN génomique | ≥ 500 ng | Expédier sur de la glace carbonique. Tampon sans EDTA (par exemple, 10 mM Tris). | L'ADNg doit montrer aucune dégradation significative (DIN > 7). Évitez les cycles de congélation-dégel multiples. |
| Pellet d'organoïdes | 1×10^6 cellules | Lavez soigneusement avec du PBS froid ou une solution de récupération cellulaire. Congeler rapidement, expédier sur de la glace sèche. | L'élimination d'une matrice incomplète inhibe considérablement la lyse cellulaire et l'extraction. Pour les grands organoïdes, une dissociation douce est recommandée pour éliminer les débris du noyau nécrotique. |
| Tumeur primaire | > 10 mg de tissu | Congélation instantanée immédiatement après la résection ou la biopsie. Expédier sur de la glace sèche. | La cellularité tumorale doit être évaluée histologiquement ; un contenu nécrotique ou stromal élevé réduit la sensibilité de détection des variants. |
| Normal apparié | > 10 mg de tissu ou 2 mL de sang | Congeler rapidement le tissu adjacent normal, ou expédier le sang dans des tubes EDTA. | Essentiel pour un appel de variantes somatiques précis. Le tissu adjacent doit être histologiquement confirmé comme étant exempt d'infiltration tumorale. Le sang est préféré. |
Sélection de la stratégie : WES vs. WGS vs. RNA-Seq vs. Panneaux ciblés
Choisir la bonne modalité de séquençage garantit que vous répondez à votre question biologique sans dépasser votre subvention ou votre budget.
- Séquençage de l'exome entier (WES): Meilleur pour découverte et validation des mutations somatiques dans les régions codantes (SNVs et InDels), confirmation des mutations conductrices, identification de nouvelles mutations codantes et suivi de l'évolution clonale à haute profondeur. Très rentable pour les grandes biobanques. Pas pour identification de grandes variations structurelles dans les régions non codantes.
- Séquençage du génome entier (SGE): Meilleur pour cartographie complète de l'ensemble du génome, y compris les introns profonds et les éléments régulateurs. Pas pour validation à haut débit de routine avec un budget limité, en raison du coût élevé d'une couverture de 200X à 500X sur l'ensemble du génome.
- Panneaux géniques ciblés Meilleur pour séquençage ultra-profond (1000X+) d'un petit ensemble prédéfini de gènes cancéreux connus pour suivre des facteurs de conduite spécifiques connus. Pas pour découvrir de nouvelles mutations en dehors du panel ou évaluer de manière exhaustive la dérive génomique globale.
- Séquençage du transcriptome (RNA-Seq): Meilleur pour mesurer l'expression génique active et identifier les fusions via notre solutions de recherche sur les organoïdes. Pas pour appelant avec précision les mutations au niveau de l'ADN dues à l'édition de l'ARN, à la dégradation médiée par les codons sans sens et à un biais d'expression massif.
Références :
- Luo Z, Wang B, Luo F, et al. Établissement d'une biobanque d'organoïdes de polypes adénomateux colorectaux à haut risque dérivés de patients à grande échelle pour le dépistage de médicaments à haut débit et à haute teneur. BMC Médecine2023;21:336. Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder à des liens externes ou à des contenus spécifiques sur Internet. Cependant, je peux vous aider à traduire un texte que vous fournissez. Veuillez copier et coller le texte que vous souhaitez traduire ici.
- Ahn S-J, Lee S, Kwon D, et al. Directives essentielles pour la fabrication et l'application des organoïdes. Journal International des Cellules Souches2024 ; 17(2) : 102-112. Désolé, je ne peux pas accéder à des liens ou du contenu externe. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir et je serai heureux de vous aider.
À utiliser uniquement pour la recherche. Ne pas utiliser dans les procédures de diagnostic, la prise de décisions cliniques, la stratification des patients, la sélection thérapeutique ou les essais cliniques.
Formats de résultats illustratifs
Les visuels prévus suivants expliquent les structures de livrables courantes fournies dans nos rapports de fidélité génomique des organoïdes. Ce sont des exemples illustratifs démontrant des formats de données, et non des données réelles de patients.
Analyse de la superposition des mutations somatiques
Une exigence fondamentale pour la validation des organoïdes est de démontrer exactement combien de mutations somatiques sont partagées. Un diagramme de Venn à trois voies illustre clairement l'intersection des variants identifiés dans la tumeur primaire, le modèle d'organoïde et le normal apparié. Un modèle de haute fidélité montre un chevauchement substantiel des mutations somatiques spécifiques à la tumeur, avec très peu de variants "uniques aux organoïdes" (indiquant un dérive induite par la culture minimale).
Corrélation de la fréquence des allèles variants
Maintenir la proportion de cellules portant une mutation est crucial pour préserver l'hétérogénéité tumorale. Un diagramme de dispersion VAF cartographie la fréquence de chaque mutation dans la tumeur primaire par rapport à sa fréquence dans l'organoïde. Les mutations se situant le long de la diagonale indiquent une préservation clonale parfaite. Les variants s'écartant fortement vers l'axe des Y représentent des sous-clones mineurs qui se sont rapidement développés pendant in vitro culture.
Profilage des signatures mutationnelles
Les génomes du cancer sont façonnés par des processus mutationnels sous-jacents. En analysant la fréquence de 96 changements possibles de contexte trinucleotidique, nous extrayons les signatures mutationnelles COSMIC établies à partir des données d'exome. La comparaison du profil de signature de la tumeur avec celui de l'organoïde confirme si les moteurs biologiques fondamentaux de l'instabilité génomique (par exemple, HRD, défauts de réparation des mésappariements) restent actifs dans le modèle 3D.
FAQ sur les WES d'organoïdes
1. Pourquoi les tissus normaux appariés sont-ils si critiques ? Ne pouvez-vous pas simplement utiliser dbSNP ?
Bien que des bases de données de population comme dbSNP, gnomAD et le Projet des 1000 Génomes contiennent des millions de variantes humaines communes, elles ne contiennent pas toutes les mutations héréditaires privées, rares ou spécifiques à une famille. Sans un échantillon normal apparié (comme du sang ou un tissu adjacent sain) du patient spécifique, il est presque impossible de prouver de manière définitive qu'une nouvelle variante trouvée dans l'organoïde est une véritable mutation somatique acquise d'une tumeur plutôt qu'un trait germinal héréditaire rare.
2. Quelle profondeur devrais-je séquencer mes organoïdes ?
Pour une analyse standard de la lignée germinale, une profondeur de 100X est généralement suffisante. Cependant, les tumeurs et leurs organoïdes dérivés sont hautement hétérogènes. Une mutation critique ou un sous-clone résistant aux médicaments rare pourrait n'être présent que dans 5 % des cellules. Pour détecter de manière fiable ces variants subclonaux à faible fréquence (VAF < 10 %) avec une confiance statistique, nous recommandons fortement de séquencer les échantillons de tumeur et d'organoïdes à une profondeur de 200X à 500X.
3. Est-ce que le Matrigel interfère avec le WES ?
Oui. Le Matrigel et d'autres extraits de membrane basale sont des matrices extracellulaires riches en protéines qui peuvent piéger des cellules, bloquer les tampons de lyse et inhiber les enzymes utilisées lors de l'extraction d'ADN et de la préparation de bibliothèques. Les organoïdes doivent être soigneusement récupérés de la matrice à l'aide de lavages à froid avec du PBS ou de solutions spécialisées de récupération cellulaire (comme la solution de récupération cellulaire Corning) avant d'être pelletés et congelés pour garantir un rendement et une qualité d'ADN élevés.
4. WES peut-il détecter les variations du nombre de copies (CNC) et les amplifications géniques ?
WES est principalement conçu pour détecter de petites variantes (SNPs et InDels) dans les régions codantes. Cependant, grâce à des outils bioinformatiques spécialisés (comme CNVkit ou EXCAVATOR), nous pouvons inférer des CNVs ciblés en comparant la couverture de profondeur de lecture à travers les exons ciblés entre l'échantillon tumoral/organoïde et l'échantillon normal. Cela est très efficace pour détecter des amplifications massives (par exemple, HER2 amplification dans les organoïdes mammaires). Notez que le séquençage de l'exome (WES) ne peut pas cartographier de manière fiable les points de rupture des variants structurels ou les réarrangements à grande échelle dans les régions non codantes ; le séquençage du génome entier (WGS) est nécessaire pour ces applications.
5. Combien de passages est trop ? Quand devrais-je re-séquençer mes organoïdes ?
La stabilité génomique varie énormément en fonction de l'origine tissulaire, des mutations spécifiques présentes (par exemple, les tumeurs déficientes en réparation des mésappariements dérivent beaucoup plus rapidement) et des pressions de sélection des milieux de culture. En général, les organoïdes sont considérés comme étant à "passage précoce" et sont les plus stables entre les passages 1 à 10. Nous recommandons de séquencer les organoïdes à passage précoce pour une validation initiale et de procéder à un re-séquencement périodique (par exemple, tous les 10-15 passages) si le modèle est maintenu en culture continue à long terme afin de surveiller la dérive génétique.
6. Soutenez-vous des organoïdes de souris ou d'autres organoïdes non humains ?
Oui. Bien que les PDO humains soient les plus courants, nos services WES et nos kits de capture d'exome sont entièrement compatibles avec les organoïdes dérivés de souris (modèles murins), les modèles canins et d'autres espèces mammifères largement étudiées. Veuillez consulter notre équipe concernant les génomes de référence spécifiques et les kits de capture disponibles pour votre espèce d'intérêt.
7. Puis-je soumettre des échantillons de tumeur primaire FFPE pour les comparer avec mes organoïdes vivants ?
Oui, nous acceptons les tissus fixés au formol et inclus dans la paraffine (FFPE). Cependant, la fixation au formol entraîne un réticulation de l'ADN, une fragmentation sévère et introduit des artefacts de séquençage (en particulier des transitions C>T causées par la désamination de la cytosine). Nous utilisons des protocoles spécialisés d'extraction d'ADN FFPE et de réparation enzymatique (par exemple, traitement UDG) pour atténuer cela, mais les tissus frais congelés sont toujours fortement préférés lorsqu'ils sont disponibles pour une comparaison de la plus haute qualité.
8. Dans quel format les données sont-elles livrées et combien de temps cela prend-il ?
Le délai de traitement dépend du projet en fonction du volume d'échantillons, des exigences de préparation et de la profondeur de séquençage. Les données sont livrées de manière sécurisée par téléchargement cloud ou sur un disque dur physique. Vous recevrez des fichiers FASTQ bruts, des fichiers BAM alignés, des VCF annotés et un rapport bioinformatique complet au format PDF contenant tous les indicateurs de qualité, tableaux et graphiques visuels.
9. Les données WES peuvent-elles être utilisées pour concevoir des panels ciblés personnalisés pour le dépistage en aval ?
Absolument. De nombreux chercheurs utilisent nos services WES sur la tumeur primaire et l'organoïde de passage précoce pour découvrir les mutations somatiques spécifiques dérivées du patient. Nous pouvons ensuite utiliser ces données pour aider à concevoir un panel Amplicon ou Capture ultra-ciblé et personnalisé (par exemple, 50 mutations spécifiques). Vous pouvez ensuite utiliser ce panel personnalisé, beaucoup moins cher, pour dépister rapidement des centaines de clones d'organoïdes en aval ou suivre les mutations au fil du temps pendant le traitement médicamenteux.
10. Comment gérez-vous la contamination par des cellules de souris si mon organoïde a été dérivé d'un modèle PDX ?
Les organoïdes établis à partir de xénogreffes dérivées de patients (PDX) contiennent souvent des cellules stromales de souris. Si l'ADN de souris est séquencé directement, il se mappe de manière ambiguë au génome humain, entraînant d'énormes appels de variantes faussement positives. Nous utilisons des outils spécialisés in silico des outils (tels que Xenome) pour mapper toutes les lectures de séquençage à la fois sur les génomes de référence humain et murin simultanément. Nous identifions sans ambiguïté et éliminons les lectures murines, garantissant que l'appel de variants est effectué exclusivement sur l'ADN des organoïdes humains.
Études de cas : Validation de la fidélité génomique pour des applications à haut débit
Étude de cas 1 : Validation d'une biobanque d'organoïdes d'adénome colorectal
Contexte
L'établissement de biobanques à grande échelle est essentiel pour les tests pharmacologiques à haut débit. Cependant, avant qu'une biobanque puisse être considérée comme fiable pour le dépistage de médicaments, le in vitro Les modèles doivent être rigoureusement validés pour s'assurer qu'ils reproduisent le paysage génétique des tissus des patients d'origine. Dans une étude complète de 2023, des chercheurs ont cherché à créer une biobanque vivante d'organoïdes d'adénome colorectal à haut risque pour étudier la prédisposition au cancer et la réponse aux médicaments.
Méthodologie
Pour prouver la fidélité de leurs modèles, les chercheurs ont isolé l'ADN génomique des tissus d'adénome primaire, des organoïdes à passage précoce correspondants et des tissus normaux appariés des patients (pour servir de contrôle germinal). Ils ont réalisé un séquençage de l'exome complet (WES) en utilisant un design Triad apparié. Le séquençage a été effectué à une profondeur élevée pour garantir que même les variantes subclonales rares soient détectées. Le pipeline bioinformatique a utilisé les meilleures pratiques GATK pour le filtrage germinal, suivi de l'appel de variantes somatiques pour identifier des SNPs et des InDels spécifiques.
Résultats
Les données comparatives de WES ont révélé une concordance génomique frappante. Les organoïdes ont fidèlement conservé la grande majorité des mutations somatiques présentes dans les adénomes parentaux. Il est crucial de noter que des mutations pilotes spécifiques prédisposant au cancer dans la voie Wnt/β-caténine (par exemple, APC mutations) et la voie PI3K/AKT étaient parfaitement préservées dans le in vitro cultures. De plus, en calculant la charge mutationnelle et en comparant les Fréquences Alléliques Variant (VAF), l'équipe a démontré que l'architecture clonale des adénomes restait très stable au cours des passages initiaux, sans accumulation significative d'artéfacts induits par la culture.
Conclusion
En ancrant leur validation de modèle avec un WES de haute profondeur, l'équipe de recherche a prouvé de manière définitive que leurs organoïdes d'adénome colorectal étaient des représentations génétiquement précises de la maladie primaire. Cette certification génomique leur a permis de procéder en toute confiance à un dépistage de médicaments à haut débit et à haute teneur, sachant que leurs résultats seraient biologiquement pertinents pour la pathologie des patients.
Recherche indépendante caractérisant des organoïdes d'adénome dérivés de patients. Adapté de Luo Z, et al. (2023), BMC Médecine. Source : Établissement d'une biobanque d'organoïdes dérivés de patients à haut risque de gros adénomes colorectaux à grande échelle... L'étude publiée était indépendante de CD Genomics.
Étude de cas 2 : Suivi de la dynamique clonale dans les organoïdes de l'adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC)
ContexteL'adénocarcinome canalaire pancréatique (PDAC) est réputé pour son stroma dense et son paysage mutationnel complexe. Les chercheurs développant des organoïdes de PDAC ont souvent du mal à confirmer si leurs cultures représentent les véritables cellules épithéliales malignes ou simplement des cellules canalaire normales qui ont surpassé les cellules tumorales. in vitro.
MéthodologieUn groupe de recherche a soumis des échantillons Triad appariés aux patients (sang, tumeur primaire PDAC et organoïdes de passage 5) à CD Genomics pour un séquençage exome à haute profondeur (couverture 300X). L'objectif était de confirmer l'identité maligne et d'évaluer si le KRAS et SMAD4 les mutations identifiées dans la biopsie clinique du patient ont été conservées.
RésultatsLe pipeline WES a réussi à filtrer plus de 40 000 variants germinaux hérités. L'appel de variants somatiques a identifié l'exact KRAS mutation G12D dans le modèle d'organoïde. Fait intéressant, l'analyse de corrélation VAF a révélé qu'un sous-clone mineur portant un SMAD4 la délétion (présente à seulement 8 % VAF dans la tumeur primaire) avait augmenté à 65 % VAF dans la culture d'organoïdes, indiquant une forte in vitro avantage de sélection pour cette sous-population spécifique.
ConclusionWES a non seulement certifié l'identité maligne de l'organoïde PDAC (prouvant qu'il ne s'agissait pas d'une croissance tissulaire normale), mais l'analyse subclonale approfondie a révélé une expansion clonale dynamique. Les chercheurs ont pu ajuster leur interprétation du dépistage médicamenteux, sachant que leur modèle était fortement enrichi pour le SMAD4sous-clone déficient.