Séquençage de l'ARN total

Les analyses de RNA-Seq total offrent une vue d'ensemble complète du transcriptome. Une gamme de solutions adaptées à votre objectif d'étude est disponible chez CD Genomics. Nous sommes en mesure de fournir un service rapide, fiable et rentable.

L'introduction du séquençage de l'ARN total

Alors que l'ARN non codant (ncRNA) continue d'être reconnu comme ayant une importance biologique, le séquençage total de l'ARN (total RNA-Seq) analyse à la fois l'ARN codant et plusieurs formes d'ARN non codant pour une vue d'ensemble complète du transcriptome. L'analyse globale de l'expression de l'ARN peut améliorer notre compréhension de toute l'activité transcriptionnelle. Le séquençage total de l'ARN permet l'analyse de l'ARN codant et non codant avec la découverte de caractéristiques à haute confiance telles que les transcrits alternatifs, les fusions géniques, l'expression spécifique des allèles et la détection de nouveaux transcrits dans les espèces d'ARN codant et non codant.

La génomique CD combine des chimies de préparation de bibliothèques de réduction ribosomique éprouvées et Illumina. NGS la technologie en un protocole unique et rationalisé. La chimie de réduction de l'ARN ribosomal Ribo-Zero minimise la contamination ribosomique et maximise le pourcentage de lectures mappées de manière unique. Avec des performances robustes et constantes, le séquençage de l'ARN total couvre à la fois ARNm et une large gamme d'espèces de ncRNA d'intérêt, y compris ARN long non codant (lncARN), ARN nucléaires petits (snRNA), ARN nucléolaires petits (snoRNA) et d'autres espèces d'ARN.

Avantages du séquençage de l'ARN total

• Mesure précise de l'orientation des brins et couverture uniforme.
• Compatible avec plusieurs types d'échantillons, y compris ceux de faible qualité, fixés au formol et inclus dans de la paraffine (FFPE)
• Délai d'exécution rapide et qualité des données optimale
• Coût réduit et grande disponibilité.
• Analyse transcriptomique efficace
• La recherche sur le séquençage du transcriptome, englobant les fusions de gènes, les Indels, les SNP, entre autres, offre des taux de détection plus élevés et une fiabilité améliorée.
• Découverte de nouveaux transcrits et variantes d'épissage.
• Analyse de l'expression génique spécifique à l'allèle.

Flux de travail de séquençage de l'ARN total

Nos services complets de RNA-Seq offrent un flux de travail de séquençage de l'ARN, de la préparation des échantillons à l'analyse des données, permettant un profilage rapide et une compréhension approfondie de l'ARN.

Spécifications de service

	Exigences d'échantillon ARN total ≥ 2 μg, Quantité minimale : 500 ng, Concentration ≥ 50 ng/µL Cellules ≥ 2×106 Tissu ≥ 500 mg, Quantité minimum : 100 mg La valeur A260:A280 doit être comprise entre 1,8 et 2,0. OD A260/A280 ratio ≥ 1,8, A260/230 ratio ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Tous les échantillons d'ARN total doivent être exempts d'ADN. L'ARN doit être conservé dans de l'eau sans nucléase ou dans RNA Stable. Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégie de séquençage bibliothèque cDNA avec des insertions de 250 à 300 pb Illumina HiSeq 150 pb en paire Taille des données de séquençage : 10 Go >40 millions de lectures
	Analyse bioinformatique Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Prétraitement des données Carte vers le génome de référence Identification des petits ARN/circulaires Analyse de séquence Analyse de l'expression différentielle analyse des gènes cibles des miARN Analyse d'enrichissement GO Analyse d'enrichissement KEGG …et plus encore Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage de l'ARN total pour votre rédaction (personnalisation)

Soutenu par notre équipe de scientifiques expérimentés et des technologies avancées, CD Genomics propose des services de séquençage de l'ARN total. Nous appliquons des mesures de contrôle qualité rigoureuses et des analyses bioinformatiques avancées pour garantir des résultats précis et complets. Si vous avez des exigences spécifiques ou des questions, n'hésitez pas à nous contacter pour obtenir une assistance supplémentaire.

Les résultats partiels sont affichés ci-dessous :

Distribution de la qualité de séquençage

Distribution A/T/G/C

Interface du navigateur IGV

Analyse de corrélation entre les échantillons

Graphique des scores PCA

Diagramme de Venn

Diagramme de volcan

Résultats statistiques de l'annotation GO

Classification KEGG

1. Quel choix faire : séquençage de l'ARN total ou séquençage de l'ARNm ?

Lorsqu'il s'agit de choisir entre le séquençage total d'ARN ou mRNA-seq pour Séquençage de l'ARNLe choix dépend principalement des objectifs expérimentaux, car il existe plusieurs distinctions cruciales entre les deux approches. Le séquençage de l'ARN total, également connu sous le nom de séquençage de l'ensemble du transcriptome, est la méthode la plus complète qui implique généralement le séquençage de tous les types de molécules d'ARN, à la fois codantes et non codantes. L'élimination de l'ARNr lors du séquençage de l'ARN total permet de générer des données de séquençage de haute qualité et facilite la caractérisation et l'identification de diverses espèces non-ARNr.

Si l'objectif de la recherche porte sur les eucaryotes et concerne principalement les régions codantes, alors le mRNA-seq est le choix privilégié. La méthodologie mRNA-seq utilise des techniques de sélection pour enrichir l'ARN poly(A). Étant donné que l'ARNm ne représente qu'une petite fraction des molécules d'ARN total, si le séquençage de l'ARNm seul suffit aux objectifs expérimentaux, alors le mRNA-seq se distingue comme l'approche la plus efficace et la plus rentable.

2. Quel type de séquençage est le séquençage de l'ensemble du transcriptome ?

Le séquençage de l'ensemble du transcriptome utilise principalement des plateformes de séquençage à lecture courte de deuxième génération telles que l'Illumina HiSeq X et l'Illumina NovaSeq 6000. Alors que la troisième génération séquençage à lecture longue des méthodes ont été rapportées, le choix prédominant pour RNA-Seq expériences restantes technologies de deuxième génération.

3. Quelle est la caractéristique clé du séquençage de l'ensemble du transcriptome qui le distingue des autres approches de séquençage ?

La caractéristique clé du séquençage de l'ensemble du transcriptome réside dans son utilisation de techniques de préparation de bibliothèque spécifiques à la brin, en particulier la préparation de bibliothèque d'ARN spécifique à la brin. Cette méthodologie garantit que les bibliothèques de cDNA résultantes préservent l'information directionnelle des brins d'ARN originaux. Cette caractéristique est essentielle pour déterminer avec précision la directionnalité transcriptionnelle, facilitant ainsi la quantification précise de l'expression génique, l'annotation robuste des gènes, la découverte de nouveaux gènes et l'identification fiable des transcrits antisens et des événements d'épissage alternatif.

4. Comment le séquençage de l'ensemble du transcriptome contribue-t-il à la compréhension de la régulation des gènes et de la génomique fonctionnelle ?

Le séquençage de l'ensemble du transcriptome révolutionne notre compréhension de la régulation des gènes et de la génomique fonctionnelle en offrant une perspective holistique du transcriptome. Cette technologie de pointe explore les dynamiques complexes de l'expression génique, s'immergeant dans les subtilités du splicing alternatif tout en révélant la diversité des signatures d'ARN non codants inhérentes à divers contextes biologiques. L'intégration des données de RNA-Seq spécifiques à la brin avec les paysages génomiques et épigénomiques fournit aux chercheurs les outils nécessaires pour démêler les complexités des réseaux régulateurs, dévoilant des acteurs moléculaires critiques dans les processus cellulaires, la pathogénie des maladies et les cascades de développement. En favorisant une compréhension approfondie des systèmes biologiques, cette approche propulse des percées à la pointe de la recherche biomédicale, stimulant l'innovation et des découvertes impactantes.

Le séquençage de l'ensemble du transcriptome révèle le paysage transcriptionnel des neutrophiles associé à la tuberculose active.

Journal : Frontières en Immunologie
Facteur d'impact : 8,786
Publié : 18 août 2022

Résumé

Les neutrophiles jouent un double rôle dans la tuberculose : ils contribuent à l'immunité innée contre M. tuberculosis mais peuvent également aggraver l'inflammation et la pathogénie. Séquençage du transcriptome l'étude des neutrophiles révèle des informations sur leurs réponses complexes, aidant à comprendre la pathogénie de la tuberculose et à identifier des biomarqueurs potentiels pour le diagnostic.

Matériaux et Méthodes

Résultats

Dans cette étude, l'ACP a révélé des profils d'expression génique distincts entre les groupes de tuberculose active (TA), d'infection tuberculeuse latente (ITL) et de témoins sains (TS). L'analyse de l'expression génique différentielle a identifié des différences significatives, avec 183 gènes exprimés différemment (GED) dans TA vs. TS et 271 GED dans TA vs. ITL. Des motifs d'expression spécifiques au sexe ont été observés pour les gènes régulés à la baisse dans TA à travers les groupes.

Figure 1 Analyse de l'expression différentielle des neutrophiles dans trois groupes d'échantillons.

Les auteurs ont réalisé des analyses d'enrichissement des voies fonctionnelles et des GSEA pour explorer les rôles des gènes exprimés différemment (DEGs). L'analyse d'enrichissement a révélé des voies telles que le signalement des récepteurs de type NOD, le signalement NF-kappa B et le signalement de la réponse immunitaire, significativement enrichies dans le groupe ATB par rapport aux groupes LTBI et HC. Le GSEA a mis en évidence des voies supplémentaires comme la réponse aux lipopolysaccharides et le signalement des chimiokines. L'analyse du réseau d'interaction des protéines a identifié des sous-réseaux centraux impliquant le signalement de la réponse immunitaire et l'épissage de l'ARNm, notablement distincts dans les comparaisons ATB vs LTBI.

Figure 2 Analyse d'enrichissement fonctionnel des gènes exprimés de manière différentielle.

L'analyse KEGG a révélé un enrichissement significatif de la voie de signalisation NF-κB dans le groupe ATB, avec une régulation à la baisse de TNFSF14 et une régulation à la hausse des inhibiteurs de NF-kappa B (IκBs) tels que NFKBIA, NFKBID et NFKBIZ. De plus, TNFAIP3 et NFKB1A ont été régulés à la hausse, inhibant potentiellement l'activation de la voie NF-κB. BCL2A1 et CXCL8, associés à la survie cellulaire, ont également été significativement régulés à la hausse. En revanche, les voies liées à l'épissage de l'ARN étaient régulées à la baisse dans le LTBI par rapport aux HC, comme l'indiquent les analyses d'enrichissement GO, KEGG et Reactome. L'analyse WGCNA a identifié des modules corrélés positivement et négativement avec l'ATB, mettant en évidence des schémas de co-expression génique distincts liés aux statuts d'infection par la tuberculose, en particulier dans les neutrophiles.

Figure 3 L'augmentation des inhibiteurs de NFKB dans l'ATB pourrait conduire à l'inhibition de l'activation de la voie NFKB.

Figure 4 Analyse d'enrichissement des voies GO et Reactome dans LTBI par rapport à HC dans le graphique d'enrichissement GSEA.

Figure 5 (A) La carte thermique de la matrice de corrélation module-caractéristiques de WGCNA.

Neuf gènes cibles ont été validés par qPCR dans 76 échantillons, montrant une expression significativement plus élevée de GBP5, SRSF5, CSRNP1, RBM3 et CCNL1 dans l'ATB. L'analyse ROC de GBP5, SRSF5, CSRNP1 et RBM3 sur 143 échantillons a confirmé leur potentiel diagnostique pour l'ATB, GBP5 présentant la plus forte capacité discriminatoire (AUC>0,9).

Figure 6 Graphiques en bulles de l'analyse d'enrichissement fonctionnel des gènes dans les modules bleus, montrant seulement les 15 voies les plus significativement enrichies.

Conclusion

Cette étude utilise la technologie de séquençage à haut débit couplée à une analyse complète pour élucider le rôle des neutrophiles en tant que l'une des cellules immunitaires innées les plus abondantes dans le processus d'infection tuberculeuse active. En reconnaissant les motifs moléculaires associés aux pathogènes à travers une série de récepteurs de reconnaissance de motifs, les neutrophiles déclenchent des événements cellulaires en aval dans la défense de l'hôte, impliquant particulièrement des voies induites par la réponse immunitaire. Cependant, Mycobacterium tuberculosis peut interférer avec la fonction antibactérienne des neutrophiles en inhibant la voie de signalisation NF-kB, atténuant ainsi l'inflammation et l'apoptose cellulaire tout en favorisant leur survie au sein des neutrophiles. Grâce à l'analyse RT-qPCR, trois nouveaux gènes marqueurs transcriptionnels, RBM 3, CSRNP 1 et SRSF 5, ont été identifiés avec le potentiel de différencier la tuberculose active, l'infection tuberculeuse latente et les témoins sains.

Référence

1. Geng X, Wu X, Yang Q, et al. Le séquençage de l'ensemble du transcriptome révèle le paysage transcriptionnel des neutrophiles associé à la tuberculose active. Frontières en immunologie, 2022, 13 : 954221.