Séquençage de la méthylation de l'ADN à cellule unique

CD Genomics propose une analyse de la méthylation de l'ADN à cellule unique pour comprendre l'hétérogénéité des motifs de 5-méthylcytosine (5mC) à l'échelle du génome.

L'introduction du séquençage de la méthylation de l'ADN à cellule unique

La méthylation de l'ADN est reconnue comme un contributeur principal au développement normal et à la régulation de l'expression génique. Elle est essentielle au maintien de l'identité cellulaire et est associée à un certain nombre de processus clés, y compris l'empreinte génomique, l'inactivation du chromosome X, la répression des éléments transposables, le vieillissement et la carcinogenèse. La méthode actuelle pour étudier la méthylation de l'ADN se fait uniquement par approche en vrac, telle que séquençage bisulfite de tout le génome (WGBS), séquençage bisulfite à représentation réduite (RRBS)et Séquençage MeDIPNous combinons la préparation de bibliothèque WGBS à cellule unique hautement innovante et Illumina. séquençage de nouvelle génération technologie pour visualiser les états de méthylation génomique à la résolution de cellule unique. Le séquençage bisulfite de l'ADN entier de cellule unique permet de découvrir l'hétérogénéité cellulaire généralement masquée par le séquençage de méthylation en vrac standard. Nous proposons un flux de travail rationalisé pour réaliser WGBS bibliothèques. L'ADN d'entrée est fragmenté de manière aléatoire lors de l'étape initiale de traitement au bisulfite, suivie de la préparation de la bibliothèque WGBS. La procédure peut accueillir un ADN d'entrée ultra-faible, ce qui la rend idéale pour l'analyse de méthylation d'échantillons précieux, limités et enrichis en cibles.

Quels sont les avantages du séquençage de la méthylation de l'ADN à cellule unique ?

• Profilage de méthylation à haute résolution au niveau des cellules uniques : Cette approche méthodologique permet l'acquisition de paysages de méthylation complexes au niveau des cellules individuelles. Elle agit comme un catalyseur pour explorer l'hétérogénéité cellulaire et les altérations dynamiques, propulsant ainsi notre compréhension de la diversité cellulaire et des transitions d'état.
• Révéler les transitions d'état cellulaire et les trajectoires évolutives : Grâce au suivi minutieux des dynamiques de méthylation dans des cellules individuelles, cette méthodologie dévoile la chorégraphie complexe des transitions d'état cellulaire et des trajectoires de développement. De telles révélations offrent des aperçus inestimables sur les bases moléculaires du développement et de l'évolution cellulaires.
• Mettre au jour les disparités fonctionnelles entre les cellules individuelles : Grâce à une analyse comparative minutieuse des profils de méthylation, cette méthode met en lumière les disparités fonctionnelles entre les cellules individuelles, éclairant ainsi les mécanismes potentiels régissant la fonction cellulaire et la régulation épigénétique.
• Exigence minimale en matière d'ADN : Caractérisée par sa demande minimale en ADN, cette technique facilite l'atteinte de seuils de détection ultra-bas avec seulement un nombre restreint de cellules.
• Examen bioinformatique : Les données recueillies ouvrent la voie à des analyses exhaustives et complexes. analyses bioinformatiques, fournissant un contenu d'information riche pour un examen minutieux.
• Évaluation de la qualité des données : des paramètres tels que le ratio de cartographie et la redondance reflètent de près ceux des systèmes conventionnels. WGBS données, garantissant ainsi l'intégrité et la fiabilité des données obtenues.

Quelles sont les applications du séquençage de la méthylation de l'ADN à cellule unique ?

Dans le domaine de la recherche scientifique, les enquêtes sur les motifs de méthylation dans des cellules uniques et des échantillons rares et minimes sont principalement appliquées dans divers domaines de recherche tels que l'élucidation de l'étiologie des tumeurs, les études sur le cancer, les diagnostics d'embryons pré-implantation, le développement embryonnaire précoce, la recombinaison des cellules germinales, la recherche sur les cellules souches et l'exploration de l'hétérogénéité cellulaire. Ces efforts impliquent souvent des échantillons comprenant des cellules uniques, de petites populations cellulaires et des quantités infimes d'ADN. Cette méthodologie est particulièrement adaptée à l'analyse de spécimens insaisissables qui sont difficiles à obtenir et d'échantillons de tissus présentant une hétérogénéité cellulaire significative.

• Hétérogénéité tumorale : Révéler le paysage de méthylation des cellules cancéreuses.
• Différenciation cellulaire : Cartographie des cartes régulatrices épigénétiques de la différenciation cellulaire.
• Microenvironnement immunitaire : Élucidation des mécanismes régulateurs épigénétiques sous-jacents à l'activation, à la différenciation des cellules immunitaires et à d'autres processus.
• Neurosciences : Classification des sous-types de cellules neuronales et exploration des mécanismes moléculaires sous-jacents aux troubles neuroliés.

Flux de travail de séquençage de la méthylation de l'ADN à cellule unique

Avec la préparation de bibliothèque post-bisulfite pour WGBSLe flux de travail peut être complété en quelques heures. Le flux de travail général pour le séquençage de méthylation à cellule unique est décrit ci-dessous.

Spécification de service

	Exigences d'échantillon Des plaques de 96 puits de suspension de cellules vivantes sont recommandées pour cette procédure. Des cellules congelées dans des lysats spécifiquement congelés peuvent également être utilisées comme matériau de départ. ScWGBS Type d'échantillon : lignées cellulaires, cellules primaires, tissu frais, cellules congelées ; Quantité et qualité recommandées : utiliser des tubes PCR de 200 µl pour stocker les cellules (cellules uniques ou multiples), 5 µl de lysat par tube, et pas plus de 1 µl de tampon lors de la collecte des cellules. ≥3 réplicats biologiques. Type d'échantillon ScRRBS : Lignes cellulaires, cellules primaires, tissu frais, cellules congelées ; Quantité et qualité recommandées : Utilisez des tubes PCR de 200 µl pour stocker les cellules (cellules uniques ou multiples), 5 µl de lysat par tube, et pas plus de 1 µl de tampon lors de la collecte des cellules. ≥3 réplicats biologiques. >100 pg d'ADN extrait doit être exempt d'inhibiteurs enzymatiques et peut être suspendu dans de l'eau, du TE ou un tampon à faible teneur en sel.
	Séquençage Les options de service flexibles incluent HiSeq X
	Analyse bioinformatique Alignement par rapport à un génome de référence Analyse de la profondeur de séquençage et de la couverture mC appelant Analyse du niveau de méthylation Tendances mondiales du méthylome Analyse de la densité de méthylation Analyse des régions différentiellement méthylées (DMRs) Annotation DMR et analyse d'enrichissement (GO/KEGG) Analyse de regroupement

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage de la méthylation de l'ADN à cellule unique pour votre rédaction (personnalisation)

La conférence sur le séquençage unicellulaire de CD Genomics se concentre sur les liens entre la variation cellulaire dans les tissus et la fonction des organes, et éclaire davantage les origines des maladies. Si vous avez des exigences supplémentaires ou des questions, n'hésitez pas à nous contacter.

Référence :

1. Gravina, S et al. Le séquençage bisulfite à l'échelle du génome à cellule unique révèle une hétérogénéité extensive dans le méthylome du foie de souris. Biologie Génomique, 2016 17(1):150.

1. Quels sont les avantages du séquençage de la méthylation de l'ADN à cellule unique ?

L'utilisation du séquençage de la méthylation de l'ADN à cellule unique confère de multiples avantages. Tout d'abord, elle permet d'examiner l'hétérogénéité observée entre les cellules individuelles, de suivre des populations cellulaires rares et de surveiller de près les altérations dynamiques de la méthylation de l'ADN au cours des phases de développement ou de progression des maladies. Cela élucide les empreintes épigénétiques spécifiques aux cellules et facilite l'examen de la régulation épigénétique à un niveau cellulaire individuel.

2. Quels sont les défis associés au séquençage de la méthylation de l'ADN à cellule unique ?

Malgré une pléthore d'avantages, la pratique du séquençage de la méthylation de l'ADN à cellule unique n'est pas exempte de défis. Principalement, elle implique des nuances techniques complexes telles que l'isolement et l'amplification de cellules individuelles, ce qui, associé au fardeau financier et à la complexité du séquençage de cellules uniques, pose des obstacles substantiels. De plus, des défis considérables sont rencontrés lors de l'analyse des données compte tenu de la rareté des données à cellule unique. épigénomique données et le besoin subséquent d'appareils de bioinformatique sur mesure.

3. Comment le séquençage de la méthylation de l'ADN à cellule unique fait-il progresser notre compréhension de la biologie et des maladies ?

Le séquençage de la méthylation de l'ADN à cellule unique ouvre de nouvelles perspectives sur les variations entre les cellules individuelles, leurs rôles dans les processus de développement biologique et les mécanismes sous-jacents aux maladies. En mettant en lumière les nuances épigénétiques au sein des cellules individuelles, cette technique démystifie les complexités de la détermination du destin cellulaire, de la régénération des tissus et de l'évolution des maladies. Elle possède un grand potentiel pour révéler de nouveaux objectifs thérapeutiques, augmentant ainsi le diagnostic et le traitement d'un éventail de maladies, y compris les cancers et les troubles neurologiques.

4. Quelles sont les différences entre les méthodes unicellulaires basées sur le RRBS et les méthodes unicellulaires basées sur le WGBS ?

Couverture :

RRBSLe RRBS est spécialement conçu pour examiner les régions des îlots CpG dans le génome par un mécanisme connu sous le nom de digestion par des enzymes de restriction. Bien que son étendue génomique soit limitée, il offre une couverture de profondeur remarquable grâce à ce ciblage spécifique.

WGBS : Contrairement à RRBS, WGBS explore le paysage de méthylation de l'ensemble du génome, qui englobe les îlots CpG ainsi que les régions chromatiniennes caractérisées par une méthylation faible. Bien qu'il offre une couverture génomique plus étendue, la profondeur de couverture est souvent compromise.

Profondeur et Résolution :

RRBSPrincipalement, en raison de son enrichissement spécialisé des régions des îles CpG, le RRBS offre souvent une couverture en profondeur robuste bien que la résolution soit réduite, ce qui nuit à la capacité de discerner les régions non-îles CpG présentes dans le génome.

WGBS : Alternativement, considérant que le WGBS couvre l'ensemble du génome, sa profondeur peut être potentiellement entravée, en particulier dans les contextes de séquençage unicellulaire, lorsqu'il est comparé au RRBS. Néanmoins, la résolution supérieure offerte par le WGBS facilite la capture de motifs de méthylation génomique plus larges.

Volume de données et complexité analytique :

RRBS : Étant donné son spectre cible contraint, le volume de données généré par RRBS est relativement compact, ce qui simplifie le traitement ultérieur des données.

WGBS : En revanche, WGBS cela entraîne généralement un volume de données énorme, nécessitant ainsi une capacité de stockage et de calcul augmentée. Par conséquent, cela se traduit souvent par des procédures de gestion des données et d'interopérabilité plus complexes.

Applications :

RRBS : En ce qui concerne l'investigation de la méthylation au sein des domaines des îlots CpG, RRBS brille comme un choix optimal. Il est particulièrement compétent pour explorer les incidents de méthylation qui sont essentiels au fonctionnement du génome et à sa régulation épigénétique.

WGBS : D'autre part, WGBS se présente comme un choix supérieur pour réaliser une élucidation complète des motifs de méthylation à l'échelle du génome. Il est instrumental pour révéler les contours de méthylation globaux et aide à étudier les événements de méthylation spécifiques aux types cellulaires et ceux susceptibles de variations dynamiques.

Séquençage du méthylome d'ADN à cellule unique des embryons humains préimplantatoires

Journal : Nature génétique
Facteur d'impact : 27,125
Publié : 18 décembre 2017

Contexte

Dans les génomes des mammifères, la cytosine, principalement dans les dinucléotides CpG, subit une méthylation sous la catalyse des ADN méthyltransférases. La recherche a révélé que la méthylation de l'ADN est cruciale pour de nombreux processus biologiques, y compris la répression de l'expression génique, la régulation de l'activité transcriptionnelle des transposons, l'inactivation du chromosome X et le maintien de l'empreinte génomique. Des études antérieures ont indiqué une déméthylation de l'ADN à grande échelle durant le développement embryonnaire préimplantatoire. Cependant, les données de recherche actuelles suggèrent qu'après la fécondation par le spermatozoïde et la fusion de l'ovocyte, en plus d'une déméthylation massive de l'ADN dans les premiers embryons humains, il y a également une méthylation de novo hautement spécifique et étendue. Cela implique que le 'résultat net' de la déméthylation globale de l'ADN durant le premier cycle de reprogrammation du méthylome de l'ADN dans les premiers embryons humains se manifeste en réalité comme un équilibre dynamique produit par le concours du processus de déméthylation de l'ADN organisé et étendu et de la méthylation localisée. Méthylation de l'ADN.

Méthodes

Résultats

Dans cette enquête, nous avons réalisé une analyse de séquençage de méthylome d'ADN PBAT à cellule unique sur une cohorte comprenant 480 cellules individuelles. Cette cohorte comprenait 50 ovocytes humains, dont 42 ovocytes matures et 8 ovocytes de vésicule germinale (GV), ainsi que 23 spermatozoïdes uniques et 62 embryons préimplantatoires. L'effort de séquençage a produit un ensemble de données substantiel, atteignant 6,5 téraoctets. En moyenne, chaque cellule individuelle a été séquencée pour 8,4 gigaoctets, facilitant la couverture d'environ 10,8 millions de sites CpG (≥1×). Notamment, notre analyse a identifié 3 ovocytes aneuploïdes et 33 embryons contenant au moins un blastomère aneuploïde. Ces spécimens aberrants ont ensuite été exclus de toute analyse ultérieure.

Une enquête détaillée a révélé trois vagues de déméthylation globale durant le développement de l'embryon préimplantatoire. La première vague, survenant dans les 10 à 12 heures suivant la fécondation, a montré une diminution significative des niveaux de méthylation de l'ADN dans les génomes paternel et maternel. Des vagues de déméthylation subséquentes ont été observées depuis le zygote tardif jusqu'au stade à deux cellules et depuis le stade à huit cellules jusqu'au stade de la morula, avec des dynamiques de méthylation distinctes dans les régions génomiques enrichies en amplificateurs, corps de gènes, introns et SINEs.

Fig. 1. Modèles de méthylation de novo dans les premiers embryons humains.

De plus, des événements de méthylation de l'ADN de novo drastiques ont été observés pendant le développement préimplantatoire, en particulier lors de deux vagues distinctes : de la phase pronucléaire masculine précoce à la phase pronucléaire intermédiaire et de la phase à quatre cellules à la phase à huit cellules. Ces régions méthylées de novo étaient principalement enrichies en éléments répétés tels que les SINE, les LINE et les LTR, suggérant un mécanisme de répression de leur activité transcriptionnelle.

Fig. 2. Dynamiques de méthylation de l'ADN des régions nouvellement méthylées et analyse d'enrichissement des régions déméthylées.
De plus, les différences dans la dynamique de déméthylation entre les génomes paternel et maternel ont été élucidées, le génome paternel présentant des taux de déméthylation plus rapides que le génome maternel durant les premières étapes embryonnaires. Notamment, le schéma de méthylation favorisant le génome maternel a persisté tout au long du développement préimplantatoire et postimplantatoire à travers les lignées embryonnaires et extra-embryonnaires.

Enfin, l'examen des régions différemment méthylées (DMRs) entre les ovocytes et les spermatozoïdes a révélé des sites génomiques spécifiques enrichis en DMRs paternels et maternels. Ces résultats soulignent les motifs de méthylation de l'ADN spécifiques aux parents qui jouent des rôles essentiels dans la modulation de l'expression génique et l'empreinte génomique tout au long du développement embryonnaire.

Fig. 3. Caractérisation des régions différentielles de méthylation spécifiques aux gamètes.

Conclusion

Dans cette enquête, nous avons entrepris un voyage pour plonger plus profondément dans les complexités dynamiques du reprogrammation de la méthylation de l'ADN au niveau de la cellule unique. En tirant parti de la technologie de séquençage à haut débit de pointe, nous avons réalisé une analyse de la méthylation de l'ADN à l'échelle du génome entier au niveau de la cellule unique. Cette approche novatrice nous a permis d'examiner systématiquement des étapes clés du développement embryonnaire humain pré-implantation avec une précision sans précédent, révélant des aperçus à une résolution de cellule unique et de base unique. Nos explorations ont abouti à plusieurs découvertes marquantes :

(1) Révélation d'une méthylation de l'ADN de novo spécifique : Pour la première fois, nous avons révélé la présence d'un volume substantiel de méthylation de l'ADN de novo spécifique tout au long du développement embryonnaire humain pré-implantation.
(2) Révélations sur la dynamique de méthylation du génome parental : Dans une révélation révolutionnaire, nous avons observé un renversement des niveaux de méthylation résiduelle sur les génomes parentaux, commençant dès le stade de l'embryon à deux cellules. Fait intéressant, au sein de la même cellule unique, les niveaux de méthylation résiduelle sur le génome maternel surpassaient significativement ceux du génome paternel.
(3) Perspectives sur la distribution asymétrique de la méthylation de l'ADN : Notre étude a révélé, pour la première fois, que la distribution asymétrique de la méthylation de l'ADN durant la première division embryonnaire constitue un outil prometteur pour retracer la lignée génétique des cellules individuelles au sein d'un même embryon.

Référence

1. Zhu P, Guo H, Ren Y, et al. Séquençage du méthylome d'ADN à cellule unique des embryons humains préimplantatoires. Génétique de la nature, 2018, 50(1) : 12-19.