Séquençage TCR-Seq et BCR-Seq de haute qualité pour le profilage du répertoire immunitaire

Représentations courantes des données liées aux TCR. (Frank et al., 2023)

À quoi sert le séquençage TCR ?

Le séquençage des TCR représente une approche technique essentielle pour étudier la diversité et la composition clonale des récepteurs des cellules T (TCR), ainsi que leurs fonctions lors des réponses immunitaires et des processus pathologiques. Il offre un outil efficace pour surveiller l'état et la fonction des cellules T dans le cadre du rejet de greffe, des infections et de la thérapie immunosuppressive. En analysant les répertoires de TCR dans le sang périphérique ou les tissus d'un patient, notre compréhension de la récupération de la fonction immunitaire et de la progression de la maladie peut être considérablement améliorée.

Le séquençage des TCR facilite une compréhension plus approfondie de la maturation, de la différenciation et de la fonction des cellules T. Il permet de révéler les mécanismes régulateurs génétiques et épigénétiques des TCR, ainsi que leurs interactions avec d'autres cellules immunitaires et voies de signalisation, grâce à l'étude de la diversité des TCR et de l'infrastructure clonale.

Dans tumeur immunothérapie, analyse de la composition des TCR de tumeur Les lymphocytes infiltrants (TIL) peuvent aider à évaluer la réponse potentielle d'un patient à l'immunothérapie. De plus, dans les maladies auto-immunes, l'analyse de la composition des TCR des cellules T d'un patient pourrait permettre de révéler des réponses immunitaires anormales et une prolifération clonale.

En explorant la composition des TCR des cellules T, il est possible d'identifier des biomarqueurs probables de réponse thérapeutique et d'évaluer davantage l'impact pharmacodynamique des traitements sur le système immunitaire.

Comment sélectionner les matériaux pour la recherche en séquençage TCR ?

La méthodologie pour le TCR-Seq peut être délimitée en deux catégories saillantes en fonction du matériel primaire utilisé : l'ADN et l'ARN. Les méthodes basées sur l'ADN se distinguent par leur capacité à quantifier avec précision des clones TCR individuels, étant donné que chaque cellule possède un modèle unique. Cependant, cette unicité pourrait potentiellement contribuer à une augmentation du coût global du TCR-Seq. D'autre part, les méthodes basées sur l'ARN offrent un degré élevé de sensibilité, permettant une estimation quantitative à la fois de l'abondance des TCR et de l'expression génique. De plus, les méthodes basées sur l'ARN peuvent facilement se combiner avec des codes-barres moléculaires pour réduire le biais de PCR et améliorer la précision de l'identification des variantes rares.

Quels sont les avantages et les inconvénients de deux stratégies de construction de bibliothèques de TCR ?

Les méthodes principales pour le séquençage des récepteurs des cellules T (TCR) sont la PCR multiplex (mPCR) et l'amplification rapide des extrémités 5' de l'ADNc (5'RACE). La mPCR, prenant en charge à la fois l'initiation de l'ADN et de l'ARN, comprend généralement deux cycles de PCR. Le premier cycle vise à amplifier le locus du gène du récepteur et intègre des séquences connues pour les sites de primers de la seconde PCR, avec des adaptateurs de séquençage et des indices qui sont ensuite incorporés. Cependant, la grande diversité aux sites de primers des sites de chevauchement dans le premier cycle de PCR nécessite un grand nombre de primers dégénérés, prédisposant ainsi à un biais de PCR.

La technique 5'RACE, en revanche, utilise l'ARN comme modèle et ne nécessite qu'une seule paire d'amorces par cycle de PCR. Cela réduit considérablement le biais de PCR et garantit que les résultats reflètent fidèlement l'état authentique des échantillons.

Quelle est la différence entre TCR et BCR ?

Récepteurs des cellules T (TCR) et Récepteurs des cellules B (BCR) représentent des classes distinctes de récepteurs immunitaires qui présentent des différences significatives tant dans leur fonction que dans leur structure. Comme leurs noms l'indiquent, ces récepteurs sont présents à la surface de différents types de cellules. Le TCR, une construction relativement plus simple, se compose uniquement de deux chaînes, tandis que le BCR comprend quatre chaînes. Une fonction cardinale du TCR consiste à reconnaître des peptides antigéniques spécifiquement présentés à la surface des cellules, généralement présentés par des molécules du Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH). En revanche, le rôle principal du BCR est l'identification de molécules antigéniques qui flottent librement dans une solution, englobant une gamme d'entités moléculaires, y compris des protéines, des polysaccharides, entre autres.

La réponse immunitaire médiée par les TCR concerne principalement l'immunité cellulaire, englobant la reconnaissance et l'élimination des microorganismes infectieux et des cellules tumorales. D'autre part, les réponses immunitaires médiées par les BCR impliquent principalement l'immunité humorale, s'étendant à la génération d'anticorps et à la neutralisation et l'élimination des antigènes. Les TCR, principalement exprimés sur les cellules T dans les tissus lymphoïdes, participent à la modulation des réponses immunitaires cellulaires. En revanche, les BCR, principalement exprimés sur les cellules B, participent aux réponses immunitaires humorales.

Le séquençage des récepteurs des cellules T révèle les caractéristiques immunitaires du carcinome hépatocellulaire selon les stades du cancer du foie de Barcelone au sein du tissu hépatique et du sang périphérique.

Journal : Science du Cancer
Facteur d'impact : 5,7
Publié : 14 novembre 2023

Arrière-plans

Les lymphocytes T, reconnaissant les molécules du complexe majeur d'histocompatibilité (CMH) via le récepteur des cellules T (TCR) présent à la surface de leurs cellules, sont essentiels à la réponse immunitaire adaptative humaine. Le carcinome hépatocellulaire (CHC) se classe au quatrième rang mondial en termes de mortalité liée au cancer. Le microenvironnement immunitaire du CHC englobe différents sous-groupes fonctionnels de lymphocytes T. Actuellement, les caractéristiques clonales et la diversité des TCR à différents stades du CHC restent largement inexplorées. Les dernières découvertes de recherche, publiées dans Cancer Science par l'équipe dirigée par le professeur Wang Yijin à l'Université des Sciences et Technologies du Sud, s'efforcent d'examiner les caractéristiques immunologiques des cellules T provenant de différents tissus à divers stades du CHC. Cette recherche contribuera à élucider les mécanismes de progression du CHC et ouvrira la voie au développement de méthodes thérapeutiques basées sur des cellules ciblant des néoantigènes spécifiques.

Méthodes

Résultats

Analyse de l'hétérogénéité interpatiente des séquences CDR3

Cette étude a examiné les séquences CDR3 partagées à travers tous les types d'échantillons de 25 patients atteints de HCC. Le pourcentage de séquences CDR3 partagées entre les tissus adjacents et les tissus tumoraux était de 4,3 %, et entre les PBMC et les tissus tumoraux de 1,5 %. Aucune différence significative n'a été observée dans les séquences CDR3 partagées entre les tissus adjacents et les tissus tumoraux, ou entre les PBMC et les tissus tumoraux à travers les trois stades. Bien que les clonotypes TCR partagés soient limités dans les tissus adjacents et les PBMC, il y avait plus de clonotypes TCR partagés dans les tissus tumoraux au stade BCLC_C par rapport aux stades BCLC_A et BCLC_B. La similarité TCR a été évaluée à l'aide de l'Indice de Jaccard, révélant une plus grande similarité dans les tumeurs par rapport aux tissus adjacents mais similaire aux PBMC. Les patients au stade BCLC_C ont montré une augmentation de la similarité TCR à travers tous les types d'échantillons. L'Indice de Chevauchement de Morisita a été utilisé pour évaluer quantitativement les clonotypes chevauchants, indiquant un degré de chevauchement plus élevé chez les patients au stade BCLC_C par rapport aux stades BCLC_A et BCLC_B, bien que non statistiquement significatif.

Figure 1. Analyse de l'hétérogénéité interpatient des séquences CDR3

2. Diversité et clonalité des séquences CDR3

L'étude a examiné l'expression des segments de gènes V et J, en se concentrant sur les séquences CDR3 pour évaluer la diversité et la clonalité des TCR à différents stades du CHC. Elle a identifié des segments de gènes fortement exprimés et analysé la fréquence des 100 principales séquences CDR3 dans les tissus tumoraux et les échantillons de PBMC à travers les stades, indiquant une clonalité TCR plus élevée dans le CHC avancé. De plus, des analyses détaillées des distributions de fréquence CDR3 et des fractions de clones ont révélé une diversité diminuée et une clonalité accrue dans les stades avancés du CHC, soutenues par diverses mesures quantitatives. Dans l'ensemble, les résultats suggèrent un déclin progressif de la diversité des cellules T avec la progression du CHC dans les PBMC.

Figure 2. Analyse de la quantification des séquences CDR3 aux stades BCLC_A–C dans les tumeurs, les tissus adjacents et les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMCs)

3. Longueur du CDR3 et composition en acides aminés

Les aberrations dans la longueur et la composition de la région déterminant la complémentarité 3 (CDR3) peuvent avoir un impact significatif sur la réponse immunitaire adaptative d'un patient. Dans les trois stades - au sein de la tumeur, dans les tissus adjacents et dans les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) - aucune différence significative dans la distribution de la longueur de CDR3 n'a été observée. L'analyse a révélé un enrichissement plus faible en acides aminés hydrophobes aux positions 6 et 7 chez les patients atteints de carcinome hépatocellulaire (CHC) à un stade avancé, indiquant une altération dans le développement et la fonction des cellules T autoréactives.

Figure 3. Analyse de la longueur du CDR3 et composition en acides aminés.

4. Comparaison des répertoires de TCR entre les patients en rechute et ceux sans rechute

En utilisant la méthode de Kaplan-Meier, la survie globale (SG) a été calculée pour les groupes de patients BCLC_B et BCLC_C. La SG médiane a été estimée à 13,0 mois (IC à 95 % 10,1–15,9) pour le stade BCLC_B et à 5,5 mois (IC à 95 % 3,2–6,8) pour le stade BCLC_C. L'analyse du rapport de risque a révélé des disparités pronostiques distinctes entre les différents stades BCLC, avec des ratios de risque plus faibles pour les patients au stade BCLC_C par rapport aux patients au stade BCLC_A et BCLC_B. Une analyse supplémentaire a identifié une corrélation entre une fréquence plus élevée des 100 premiers CDR3 et un pronostic amélioré. Parmi les patients avec récidive, ceux présentant la tumeur et les PBMC montraient une plus grande diversité de TCR par rapport aux patients non récidivants, tandis que la fréquence des acides aminés hydrophobes était plus faible chez les patients récidivants.

Figure 4 (A) Analyse des différences des répertoires TCR chez les patients en rechute et ceux sans rechute. (B) Chevauchement des séquences CDR3 entre les patients en rechute et ceux sans rechute. (C) Les données de séquençage TCR ont montré les 100 séquences CDR3 les plus fréquentes. (D) Visualisation des proportions de clones occupées par les séquences CDR3.

5. Analyse du répertoire TCR chez un patient avec une tumeur en rechute

Le séquençage des TCR effectué sur la tumeur originale d'un patient récurrent (T1), les tumeurs nouvellement développées (T2 et T3) et les PBMC (P1 et P2) a révélé un degré élevé de chevauchement des clones de TCR dans les PBMC, potentiellement attribuable à une abondance de la séquence CDR3 CATSDPSTGTTGELFF. Les indices clonaux ont indiqué une clonalité plus élevée dans P1 que dans P2 et dans T1 plus que dans T2 et T3, malgré des différences statistiquement non significatives. La recombinaison des gènes TRBV et TRBJ a montré une similarité élevée entre T1, T2 et T3, suggérant des variations potentiellement substantielles dans les répertoires de TCR entre les tumeurs primaires et récurrentes.

Figure 5. Analyse de la clonalité et de la diversité chez les patients en rechute et non en rechute. groupe

Conclusion

La recherche élucide les caractéristiques distinctes des séquences de récepteurs des cellules T (TCR) à travers divers tissus — y compris les tissus tumoraux, les tissus non tumoraux adjacents et les cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) — à différents stades du système de classification du cancer du foie de la clinique de Barcelone (BCLC). Une analyse longitudinale systématique de différentes étapes temporelles, combinée à une analyse transversale à travers divers échantillons, révèle l'évolution des caractéristiques des TCR pendant la progression du carcinome hépatocellulaire (CHC). Notamment, la clonalité des TCR dans les cellules T du sang périphérique montre une augmentation significative au stade BCLC_C par rapport aux stades antérieurs, tandis que la diversité est considérablement réduite. Cela indique que les PBMC pourraient offrir une délimitation plus éclairante des caractéristiques des TCR à travers les différents stades tumoraux chez les patients atteints de CHC, par rapport aux tissus tumoraux. Nous avons clairement établi une relation entre les caractéristiques des TCR et le pronostic du CHC ; les patients présentant une clonalité accrue des TCR font face à des risques plus faibles de récidive tumorale, ce qui conduit à de meilleures prévisions. Nous émettons l'hypothèse que le niveau de clonalité des TCR dans les tissus à un stade précoce pourrait être un marqueur prédictif précieux pour la récidive post-opératoire chez les patients.

Référence:

1. Li R, Wang J, Li X, et al. Le séquençage des récepteurs des cellules T révèle les caractéristiques immunitaires du carcinome hépatocellulaire selon les stades du cancer du foie de Barcelone dans le tissu hépatique et le sang périphérique. Science du cancer, 2024, 115(1) : 94-108.