Validation des cibles hors cible de CRISPR

Introduction à la validation des effets hors cible de CRISPR

Le système CRISPR/Cas9 a révolutionné l'ingénierie génétique, fournissant aux chercheurs un outil sans précédent pour un édition précise du génome. Néanmoins, la propension du système aux effets hors cible—modifications non intentionnelles dans des régions génomiques non ciblées—pose une préoccupation prononcée. Ces mutations hors cible peuvent induire des altérations phénotypiques inattendues, compliquant ainsi l'interprétation des résultats expérimentaux et mettant potentiellement en péril les applications thérapeutiques. S'attaquer à ces défis nécessite la mise en œuvre de protocoles de validation hors cible rigoureux.

Dans ce but, CD Genomics propose des services sophistiqués de validation des effets hors cible de CRISPR, en utilisant technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS) pour évaluer et valider méticuleusement la spécificité des modifications CRISPR/Cas9. Pour la détection de potentiellement des centaines d'effets hors cible, CD Genomics utilise des PCR multiplex ou des panneaux de conception de sondes ciblant ces sites spécifiques, tirant parti du séquençage de nouvelle génération (NGS) pour vérifier la présence et la fréquence des modifications à ces loci.

Comment détecter les effets hors cible

La technologie CRISPR implique la formation d'un complexe entre l'ARN guide unique (sgRNA) et les protéines Cas. Le sgRNA identifie et s'apparie avec la séquence cible complémentaire sur un brin d'ADN, tandis que la protéine Cas reconnaît la séquence de motif adjacent au protospacer (PAM). Lorsque les séquences PAM et cible correspondent, la protéine Cas clive l'ADN cible, entraînant des cassures à double brin. Le mécanisme de réparation par jonction non homologue de la cellule tente ensuite de réparer la cassure, ce qui conduit souvent à des erreurs facilitant l'édition génétique.

Cependant, un défi majeur de la technologie CRISPR est les effets hors cible, où le sgRNA peut se lier par erreur à des séquences non ciblées, entraînant des modifications non intentionnelles dans d'autres régions génomiques. Cela soulève des inquiétudes concernant la vérification des fonctions des gènes et la sécurité des applications d'édition génétique. Par conséquent, la détection des effets hors cible est cruciale, avec des méthodes de séquençage de première génération et de nouvelle génération disponibles à cet effet.

Pour un aperçu détaillé des méthodes de détection des effets hors cible de CRISPR, vous pouvez consulter les articles.

• Séquençage de nouvelle génération : Validation de votre modification CRISPR/Cas9
• Résumé des méthodes de détection des effets hors cible de CRISPR-Cas9

Avantages du service de validation des effets hors cible de CRISPR

• Analyse multiplexeAnalyse simultanément des centaines de sites cibles au sein d'une seule expérience, améliorant l'efficacité et fournissant des informations plus approfondies sur les effets de l'édition CRISPR.
• Design personnalisableExploitez notre outil de conception avancé pour créer des amorces sur mesure qui garantissent une amplification précise des séquences cibles et non cibles, répondant à vos besoins de recherche spécifiques avec précision.
• Haute Sensibilité et SpécificitéCD Genomics utilise Plateformes basées sur le NGS pour atteindre une couverture de séquençage approfondie, permettant la détection de mutations hors cible à faible fréquence qui pourraient autrement passer inaperçues. Cette haute sensibilité est essentielle pour garantir que l'édition génétique soit précise et efficace.
• Rapports completsLe processus de validation comprend des rapports détaillés qui fournissent des informations sur les effets hors cible, permettant aux chercheurs de prendre des décisions éclairées concernant leurs conceptions et applications CRISPR. Les experts de CD Genomics offrent des consultations pour interpréter les résultats et suggérer des modifications afin d'améliorer la spécificité.
• Flux de travail rationaliséLe processus de validation de bout en bout simplifie l'analyse des modifications CRISPR. En offrant un service tout-en-un, de la préparation des échantillons à la rédaction du rapport final, CD Genomics améliore l'efficacité, permettant aux chercheurs de se concentrer sur leurs objectifs principaux sans être accablés par des procédures de validation complexes.

Applications de la validation des effets hors cible du CRISPR

• Thérapie géniqueLes modifications CRISPR doivent être précises dans les contextes thérapeutiques pour garantir la sécurité des patients en évitant les mutations hors cible. Des protocoles de validation rigoureux des effets hors cible sont essentiels pour confirmer que les modifications génomiques sont limitées aux sites prévus, minimisant ainsi les effets indésirables potentiels.
• Biotechnologie agricoleLa technologie CRISPR transforme la biotechnologie agricole, permettant la création de cultures génétiquement modifiées. La validation des effets hors cible est essentielle pour garantir que les traits souhaités sont intégrés dans le génome de la culture sans nuire à la santé ou au développement des plantes, assurant ainsi la sécurité et la durabilité des produits agricoles.
• Recherche fondamentaleDans la recherche fondamentale, un éditing génétique précis est nécessaire pour comprendre la fonction des gènes. Une validation fiable des effets hors cible permet aux chercheurs d'interpréter avec précision les résultats, garantissant que les phénotypes observés sont dus uniquement aux modifications intentionnelles, ce qui est essentiel pour faire progresser la connaissance des voies et des mécanismes génétiques.

Flux de validation des effets hors cible de CRISPR

Le flux de validation des effets hors cible de CRISPR chez CD Genomics implique la soumission d'échantillons, la construction de bibliothèques de régions cibles, la réalisation de séquençage à haut débit, l'exécution d'analyses bioinformatiques pour l'alignement de référence et l'annotation visuelle, ainsi que l'évaluation de l'activité cible. etc..

Spécifications de service

	Exigences d'échantillon Lignes cellulaires après édition génétique (congelées ou en plaques de culture) Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégie de séquençage Plateforme Illumina basée sur le NGS
	Analyse bioinformatique Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Évaluation des données brutes Élagage et filtrage Alignement de lecture Identification des sites potentiels hors cible Quantification des mutations Annotation des variantes …et plus encore Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Données brutes
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données

Références

1. Park S H, Lee C M, Bao G. Identification et validation de l'activité hors cible de CRISPR/Cas9 dans les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques//Essais sur les cellules souches : Méthodes et protocoles. New York, NY : Springer US, 2022 : 281-306.
2. Kang S H, Lee W, An J H, et al. Validation des effets hors cible de CRISPR hautement sensibles basée sur la prédiction en utilisant l'enrichissement en ADN spécifique à la cible. Communications Nature, 2020, 11(1) : 3596.

Des résultats partiels sont présentés ci-dessous :

1. Comment puis-je minimiser les effets hors cible lors de la conception de mes expériences CRISPR ?

Pour réduire les effets hors cible, assurez-vous que votre gRNA a un contenu en GC optimal (40%-60%) et mesure environ 17 nucléotides de long. Utilisez des outils informatiques pour prédire les sites hors cible et choisissez des gRNAs avec moins de correspondances potentielles dans le génome.

2. Comment CD Genomics garantit-il l'exactitude de ses services de validation des effets hors cible ?

CD Genomics utilise des technologies de pointe technologies NGS couplé à des analyses bioinformatiques rigoureuses pour garantir une haute sensibilité et spécificité dans la détection des mutations hors cible. Des rapports complets et une consultation d'experts renforcent encore la fiabilité de nos services de validation.

3. La validation hors cible est-elle nécessaire pour toutes les expériences de CRISPR ?

Bien que la validation hors cible soit particulièrement critique pour les applications thérapeutiques et les projets à enjeux élevés, elle est également conseillée dans les environnements de recherche où la précision est primordiale. Cette validation aide à garantir que les résultats sont attribuables aux modifications prévues.

Validation des off-targets CRISPR hautement sensibles basée sur des prédictions utilisant un enrichissement en ADN spécifique à la cible.

Journal : Nature Communications
Facteur d'impact : 16,6
Publié : 17 juillet 2020

Contexte

Le système CRISPR-Cas permet un édition génétique précise, mais peut provoquer des mutations hors cible, en particulier dans les génomes de grande taille. Bien que les méthodes de séquençage de nouvelle génération (NGS) soient utilisées pour détecter ces mutations, elles manquent souvent de sensibilité. Une nouvelle méthode utilisant des endonucléases CRISPR et la PCR améliore la détection des mutations hors cible à faible abondance, augmentant ainsi la précision pour des thérapies géniques sûres.

Matériaux et Méthodes

Résultats

Pour évaluer les mutations hors cible avec CRISPR–Cas9, une amplification CRISPR a été utilisée pour détecter les mutations hors cible prédites dans des cellules HEK293FT. Cette méthode, améliorée par Cas12a pour une amplification sélective, a révélé des augmentations significatives d'indels et a permis la détection de mutations à faible fréquence que le séquençage de nouvelle génération conventionnel a manquées. L'amplification CRISPR a également distingué les véritables effets hors cible des faux positifs, prouvant son efficacité pour un dépistage sensible.

Fig. 1 : Détection des mutations hors cible induites par CRISPR–Cas9.

L'amplification CRISPR a efficacement détecté des substitutions de base unique A>G induites par des éditeurs de base d'adénine (ABE) dans des cellules HEK293FT, révélant des mutations que le séquençage de nouvelle génération conventionnel a manquées et montrant une grande sensibilité pour identifier des changements spécifiques hors cible.

Fig. 2 : Détection des mutations hors cible à base unique induites par ABE.

Conclusion

Les auteurs ont développé une méthode d'amplification CRISPR pour améliorer la détection des mutations hors cible en enrichissant l'ADN mutant et en éliminant l'ADN de type sauvage. Cette approche améliore la sensibilité, révélant des mutations à faible abondance qui échappent aux méthodes de séquençage de nouvelle génération (NGS) conventionnelles. Elle est efficace pour divers effecteurs CRISPR, y compris Cas9, Cas12a et les éditeurs de bases d'adénine (ABE), et fournit une analyse précise pour la thérapie génique et l'ingénierie génomique de précision.

Référence

1. Kang S H, Lee W, An J H, et al. Validation des effets hors cible de CRISPR hautement sensibles basée sur la prédiction en utilisant l'enrichissement en ADN spécifique à la cible. Communication de la natures, 2020, 11(1) : 3596.