Séquençage de l'ADN mitochondrial humain (ADNmt)

Introduction au séquençage de l'ADN mitochondrial humain (ADNmt)

Les mitochondries, appelées "centrales énergétiques de la cellule", sont des organites vitaux dans les cellules humaines. Les ADN mitochondriaux humains (ADNmt) forment des molécules circulaires à double brin qui contiennent environ 16 569 paires de bases d'ADN et codent 37 gènes (Fig. 1). Il y a des milliers de molécules d'ADNmt dans les mitochondries, qui sont très mutables car elles ne sont pas protégées par des histones. Les ADNmt mutés coexistent avec les ADNmt de type sauvage dans un état appelé hétéroplasmie, qui a été détecté comme étant associé à un large éventail de maladies humaines, telles que le trouble du spectre autistique (TSA), la neuropathie optique héréditaire de Leber (LHON), le cancer du sein, la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et l'hypertension. Par conséquent, le génome mitochondrial est un objet de recherche significatif dans le diagnostic clinique.

CD Genomics a développé des panneaux qui capturent spécifiquement l'ensemble du génome mitochondrial humain. Ceux-ci sont basés sur la PCR multiplex et la capture par sonde. séquençage ciblé des approches qui pourraient couvrir 100 % du génome mitochondrial humain. En utilisant ce panel, les clients n'ont plus besoin de fournir de l'ADNmt purifié. L'enrichissement de l'ADNmt est réalisé par amplification PCR multiplex ou capture par sonde du génome mitochondrial. L'ADNmt enrichi est ensuite soumis à la préparation de bibliothèque et à un séquençage ultra-profond. CD Genomics fournit cette technologie pour aider les clients à rechercher des maladies liées au génome mitochondrial.

Figure 1. Le génome mitochondrial humain circulaire.

Avantages de notre service de séquençage de l'ADN mitochondrial humain (ADNmt)

• Accès plus facile aux échantillons initiaux : ADN génomique humain, contenant à la fois de l'ADNmt et de l'ADN nucléaire.
• Séquençage ultra-profond : couverture >1000x, avec la plateforme Illumina PE150
• Haute précision : couverture de 100 % des amplicons ou des sondes de toutes les régions du génome mitochondrial.
• Prix le plus bas : qui dépend de la taille de l'échantillon, veuillez nous contacter pour un devis.
• Délai d'exécution le plus rapide : 3-4 semaines

Flux de travail de séquençage de l'ADN mitochondrial humain (ADNmt)

Spécifications du service

	Exigences d'échantillon Échantillon de PCR multiplex : ADN génomique ≥ 200 ng, Quantité minimale : 50 ng, Concentration ≥ 5 ng/µL Probes de séquençage de l'ADNmt humain : ADN génomique ≥ 500 ng, Quantité minimale : 200 ng, Concentration ≥ 10 ng/µL Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégies de séquençage Plateformes Illumina Efficacité de capture : 60 % à 80 %
	Analyse bioinformatique Le service de bioinformatique pour le séquençage standard de l'ADNmt humain comprend Contrôle qualité des données brutes Alignement au génome de référence mitochondrial Appel de variantes (SNP/indel) Analyse des annotations L'analyse de l'hétéroplasmie et du haplogroupe est disponible sur demande. Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage de l'ADN mitochondrial humain (ADNmt) pour votre écriture (personnalisation)

Résultats de cartographie et de couverture du séquençage de l'ADNmt, ainsi que l'affichage des profils pathologiques de l'ADNmt. (Yao et al., 2019)

Référence :

1. Yao Y, Nishimura M, Murayama K, et al. Une méthode simple pour séquencer l'ensemble du génome mitochondrial humain directement à partir d'échantillons et son application aux tests génétiques. Rapports scientifiques, 2019, 9(1) : 17411.

1. Le séquençage du génome entier inclut-il l'ADN mitochondrial ?

Séquençage du génome entier (SGE) englobe intrinsèquement l'ADN mitochondrial dans son champ d'application. Cette technique de séquençage complète implique l'extraction et le séquençage de l'ADN nucléaire et mitochondrial. En raison de l'abondance de copies d'ADNmt dans les cellules, séquençage du génome entier assure une couverture complète du génome mitochondrial, permettant une analyse simultanée avec le génome nucléaire.

2. Quelles sont les méthodes de séquençage de l'ADN mitochondrial humain ?

Différentes méthodologies sont utilisées pour séquencer l'ADN mitochondrial humain (ADNmt). Les approches courantes comprennent Séquençage Sanger, séquençage de nouvelle génération plateformes (par exemple, séquençage Illumina) et technologies de séquençage à longues lectures (par exemple, Technologies Oxford Nanopore et Pacific BiosciencesChaque méthodologie offre des avantages, des inconvénients et une applicabilité distincts, permettant aux chercheurs d'adapter leur choix en fonction des objectifs de recherche spécifiques et des considérations de ressources.

Une méthode pour le séquençage multiplexé de molécules uniques de pleine longueur du génome mitochondrial humain

Journal : Nature Communications

Facteur d'impact : 16,7

Publié : 06 octobre 2022

Contexte

Les mitochondries contiennent des génomes circulaires avec des fonctions vestigiales. L'hétéroplasmie peut avoir un impact significatif sur la santé, nécessitant une détection précise des variants pour le diagnostic et le traitement. Les méthodes de séquençage traditionnelles ont des limitations, mais les technologies de séquençage à longues lectures comme ONT et PacBio offrir une précision améliorée. L'utilisation de Cas9 pour l'enrichissement ciblé avec la chimie Q20+ d'ONT améliore la précision des lectures et réduit les coûts, ce qui le rend adapté aux échantillons de faible qualité et étend son utilisation dans la recherche mitochondriale et les applications cliniques.

Méthodes

Résultats

Les auteurs ont affiné le protocole d'enrichissement Cas9-mtDNA pour permettre un séquençage de molécules uniques de mtDNA à partir d'échantillons d'ADNg humain, facilitant le multiplexage sans étapes de codage supplémentaires. Cette méthode implique une digestion par l'exonucléase V pour l'enrichissement du mtDNA, la déphosphorylation des extrémités de l'ADNg, et une coupure spécifique de la séquence par l'endonucléase Cas9 guidée par ARN double. Cette approche génère un code-barres au site de coupure de Cas9, facilitant la préparation de la bibliothèque et le séquençage. Après la coupure par Cas9, les échantillons sont traités avec de la protéinase K pour éliminer la protéine Cas9 liée, suivie de la ligature des adaptateurs de séquençage ONT aux sites de coupure phosphorylés.

Fig. 1 Approche d'enrichissement Cas9-ADNmt, de marquage, de regroupement et de démultiplexage pour le séquençage à longue lecture.

L'analyse d'enrichissement Cas9-mtDNA détecte avec précision l'hétéroplasmie dans des SNV pathogènes à travers 14 échantillons cliniques. La méthode, sans traitement par Exonucléase V, atteint une couverture variable du génome mtDNA (×33 à ×2335), corrélant avec les niveaux de dégradation de l'ADN des échantillons. L'inclusion à la fois de lectures complètes et de lectures commençant à des codes-barres de sites de coupure Cas9 spécifiques augmente la couverture et la confiance dans l'appel des variants. Toutes les hétéroplasmiques rapportées sont confirmées, avec des fréquences allant de <0,2 % à 100 %, et aucune grande délétion observée. De plus, des sites polymorphiques non pathogènes et des variants de signification inconnue sont identifiés, soulignant l'importance d'évaluer la fréquence des variants au sein de la population générale et des haplogroupes spécifiques.

Tableau 1. Identification des SNV pathogènes et détermination de l'hétéroplasmie dans les échantillons cliniques confirmés avec des altérations de l'ADNmt

L'analyse d'enrichissement de Cas9-mtDNA identifie avec succès plusieurs délétions de l'ADN mitochondrial dans un cas clinique complexe. En utilisant trois gARNs couvrant le génome mitochondrial, la méthode détecte deux grandes délétions : m.3264_16070del (7,6 % d'hétéroplasmie) et m.10751_14129del (84,1 % d'hétéroplasmie), en plus de l'ADN mitochondrial de type sauvage (8,3 % de fréquence). La comparaison avec lrPCR et le séquençage Illumina confirme l'avantage du séquençage natif de l'ADN mitochondrial, surmontant les biais et fournissant des estimations plus précises des populations d'ADN mitochondrial.

Fig. 2 Multiples délétions d'ADNmt dans un échantillon clinique.

Conclusion

Cette méthode utilise la nucléase Cas9 et le séquençage par nanopores pour cibler et séquencer efficacement le génome mitochondrial humain dans son intégralité. Elle atteint une couverture élevée, détectant avec précision les SNV et les multiples délétions dans des échantillons cliniques. Le pipeline d'analyse personnalisé des auteurs permet un appel de variants précis et facilite une analyse complète de l'ADNmt, bénéficiant au diagnostic moléculaire et aux études de population. De plus, elle a des applications potentielles dans l'investigation des mutations somatiques et des modifications de l'ADN, s'étendant aux espèces animales pour la génétique de conservation et la recherche en phylogénétique.

Référence :

1. Keraite I, Becker P, Canevazzi D, et al. Une méthode pour le séquençage multiplexé de molécules uniques en pleine longueur du génome mitochondrial humain. Communications Nature, 2022, 13(1) : 5902.