2b-RAD

CD Genomics propose désormais le séquençage 2b-RAD, une méthode novatrice de séquençage du génome entier à représentation réduite et de séquençage associé aux sites de restriction (RAD) pour le cartographie de liaison et la détermination des variants à l'échelle du génome de manière économique.

Quelle est la méthode 2b-RAD ?

La méthode 2b-RAD (IIB-RAD), initialement décrite par Wang et al. en 2012, représente une approche de pointe dans le séquençage à haut débit. Génotypage SNP. En utilisant des endonucléases de restriction de type IIB, telles que Bcg I, cette technique génère des fragments d'ADN uniformes allant de 33 à 36 paires de bases en clivant à des sites de reconnaissance spécifiques. Cela élimine la nécessité d'étapes de sélection de taille ultérieures. L'un des principaux avantages de la méthodologie 2b-RAD est sa capacité à produire des longueurs de fragments cohérentes à travers une variété d'échantillons, facilitant ainsi un séquençage précis et efficace et la découverte subséquente de SNP. Bien que la méthode 2b-RAD génère moins de fragments par rapport aux approches RAD à enzyme unique, elle compense par une résolution et une couverture supérieures. Par conséquent, cette technique répond à plusieurs limitations inhérentes présentes dans les méthodes antérieures telles que RAD-Seq et GBS, offrant une alternative robuste pour une analyse complète des SNP.

Introduction au 2b-RAD

La méthode 2b-RAD utilise des enzymes de restriction de type IIB (RE), telles que Bcg I, qui clivent l'ADN génomique de part et d'autre de leurs sites de reconnaissance pour générer des fragments d'ADN double brin (dsDNA) de taille fixe avec des extrémités proéminentes et non cohésives. Par la suite, ces fragments d'ADN sont capturés à l'aide d'un adaptateur biotinylé spécifique à l'enzyme initiale. En comparaison avec des méthodes analogues telles que l'ADN associé au site de restriction (RAD) et le génotypage par séquençage (GBS), la technique 2b-RAD offre une spécificité supérieure aux régions d'intérêt tout en minimisant la génération de séquences provenant de régions non informatives et répétitives.

La génération cohérente de balises courtes et uniformes grâce à la méthode 2b-RAD offre de multiples avantages, notamment le ciblage de tous les sites de restriction, une profondeur de séquençage uniforme entre les sites, une grande reproductibilité pour les mesures quantitatives, des coûts de séquençage réduits par balise et une sensibilité diminuée à la dégradation de l'ADN. De plus, pour tirer parti des capacités de séquençage améliorées de séquençage de nouvelle génération (NGS) sur les plateformes, nous avons intégré un protocole avancé qui permet la préparation de cinq tags isoRAD concaténés pour le séquençage Illumina en paires (PE) de 150 pb. Ce protocole offre aux chercheurs une plus grande polyvalence et efficacité dans la conception de configurations de bibliothèques adaptées à des objectifs de recherche spécifiques.

Avantages de notre service 2b-RAD

• Caractérisé par une flexibilité considérable, le nombre de balises est contrôlable.
• Les étiquettes présentent des longueurs cohérentes, garantissant une efficacité d'amplification uniforme lors de la PCR.
• Ces étiquettes démontrent une spécificité positionnelle, indépendamment des séquences de référence et des résultats d'assemblage.
• En plus d'utiliser des marqueurs co-dominants comme les SNP, des marqueurs dominants peuvent également être employés.
• Précis et abordable
• Numéro de tag flexible
• Longueur d'étiquette cohérente
• Haute densité de marqueurs
• Ne nécessitant pas d'étapes de purification intermédiaires.
• Permettant une faible quantité d'ADN et de l'ADN dégradé
• Les bibliothèques 2b-RAD fortement réduites nécessitent beaucoup moins de séquençage pour un génotypage précis.

Applications du 2b-RAD

• Construction de la carte bin et localisation des QTL
• Génétique des populations étudier
• Évolution de la population analyse
• Étude d'association à l'échelle du génome
• Phylogénie du génome
• Sélection génomique
• Cartographie de liaison et d'association
• Discrimination des souches microbiennes
• Détection des mutations somatiques

Flux de travail 2b-RAD

Le flux de travail général pour 2b-RAD comprend la préparation des échantillons, la préparation de la bibliothèque 2b-RAD, le séquençage à haut débit et l'analyse bioinformatique. Notre équipe d'experts hautement expérimentés exécute la gestion de la qualité, suivant chaque procédure pour garantir des résultats fiables et impartiaux. La construction de la bibliothèque pour 2b-RAD se compose de quatre étapes majeures (digestion par BsaXI, ligation, amplification et marquage).

Spécifications de service

	Exigences d'échantillon ADN génomique ≥ 200 ng, quantité minimale : 50 ng, concentration ≥ 5 ng/µL Les échantillons d'ADN doivent avoir un rapport OD260/280 aussi proche que possible de 1,8 à 2,0. Tout l'ADN doit être traité avec de l'ARNase et ne doit montrer aucune dégradation ni contamination. Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégie de séquençage Illumina HiSeq X ten, PE 150 Densité moyenne des étiquettes du génome : 2 kb La profondeur moyenne de l'étiquette ≥ 20X Précision de classification ≥ 95%
	Analyse bioinformatique Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Contrôle de la qualité des données brutes Analyse statistique Génotypage SNP Annotation du locus SNP Construction d'une carte de liaison génétique Études de population Remarque : Les sorties de données recommandées et les contenus d'analyse affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails dans 2b-RAD pour votre écriture (personnalisation)

CD Genomics est heureux de proposer une technologie de séquençage 2b-RAD à la pointe, offrant un service complet qui englobe l'ensemble du flux de travail, de la contrôle de qualité de l'ADN génomique à la détermination des génotypes et à l'évaluation de la diversité des populations. Nous vous invitons à nous contacter si vous avez des besoins ou des questions spécifiques concernant nos services. En tant que fournisseur agréé de cette technologie avancée, CD Genomics garantit la conformité et l'excellence dans la fourniture de solutions génomiques robustes. Il est important de noter que Keygene N.V. détient les brevets et les demandes de brevet protégeant la propriété intellectuelle associée aux technologies de génotypage basées sur le séquençage.

Les résultats partiels sont affichés ci-dessous :

1. Quels sont les avantages du 2b-RAD ?

CD Genomics est fier d'offrir une technologie de séquençage 2b-RAD avancée, qui présente de nombreux avantages par rapport à l'original. RAD-seq et GBSLa comparaison entre les différentes méthodes de séquençage du génome entier par représentation réduite est présentée dans le tableau 1.

Tableau 1. Comparaison technique entre 2b-RAD et d'autres méthodes de génotypage à représentation réduite basées sur le NGS.

2. Quels sont les inconvénients du 2b-RAD ?

Bien que le 2b-RAD soit une méthode puissante pour le haut débit génotypage, cela présente également certains inconvénients. Le 2b-RAD ne fonctionne que sur des espèces diploïdes. De plus, les courtes étiquettes peuvent ne pas être suffisamment longues pour la discrimination des loci dans des génomes complexes.

3. Comment la bibliothèque 2b-RAD est-elle préparée ?

La construction de la bibliothèque pour le 2b-RAD se compose de quatre étapes majeures (digestion par BsaXI, ligature, amplification et codage). Après la digestion de l'ADN par BsaXI, des adaptateurs sont ligaturés aux fragments par des extrémités cohésives, et des codes-barres spécifiques sont incorporés dans chaque échantillon par amplification PCR à l'aide de linkers dégénérés. Ensuite, les constructions à étiquette unique sont produites en utilisant des adaptateurs modifiés et des amorces marquées par la biotine, qui peuvent être ensuite digérées par SapI pour générer des extrémités cohésives distinctes, puis ligaturées dans un ordre prédéfini pour produire cinq étiquettes concaténées. Les échantillons sont ensuite regroupés et séquencés en utilisant la technologie Illumina.

Figure 1. Vue d'ensemble schématique de la procédure 2b-RAD.

4. Le 2b-RAD peut-il détecter des SNP dans des régions répétitives ?

2b-RAD peut ne pas détecter les SNP dans les régions répétitives qui comprennent un petit nombre de sites de restriction.

5. Combien d'individus sont nécessaires pour la construction d'une carte de liaison ?

Au moins plus de 100 individus sont nécessaires pour la construction. carte de liaison génétique.

6. Pour les populations naturelles, combien d'échantillons sont nécessaires ?

Les populations naturelles ont souvent plus de SNP. Le nombre d'échantillons dépend du phénotype d'intérêt, allant de dizaines d'échantillons à des centaines. Plus vous soumettez d'échantillons, plus les résultats de génotypage sont précis.

7. Quelle est l'exigence pour les espèces ?

Les diploïdes avec ou sans génome de référence sont adaptés pour le 2b-RAD. Cependant, les polyploïdes pour le 2b-RAD devraient de préférence avoir un génome de référence, et des risques subsistent encore.

Une carte de liaison génétique à haute résolution et un affinement de QTL pour des traits liés à la croissance et au sexe chez la carpe commune du fleuve Yangtsé.Cyprinus carpio haematopterus)

Journal : BMC Genomics

Publié : 02 avril 2018

Contexte

Les auteurs ont construit une haute résolution. carte de liaison génétique en utilisant 7820 2b-RAD et 295 marqueurs microsatellites dans une famille F2 de la carpe commune du fleuve Yangtsé (C. c. haematopterus). Ils ont cartographié un ensemble de QTL suggestifs et significatifs pour des traits liés à la croissance et au sexe sur cette carte de liaison. La carte génétique et ces gènes candidats et marqueurs dérivés des QTL sont utiles pour des études ultérieures sur la carpe commune du fleuve Yangtsé.

Matériaux et Méthodes

Résultats

1. Construction de la carte de liaison à haute résolution

Un total de 8115 marqueurs (7820 marqueurs 2b-RAD et 295 SSR) ont été regroupés en 50 LG, ce qui est cohérent avec le nombre de chromosomes haploïdes, en utilisant le logiciel JoinMap 4.1.

Figure 1. La carte de liaison génétique moyenne par sexe du carpe commun du fleuve Yangtsé. C.c. haematopterus construit sur la base de marqueurs 2b-RAD et de microsatellites.

2. Cartographie génomique comparative

Figure 2. Diagramme Circos représentant les relations de syntenie entre C. c. haematopterus (droit) et (a et b) C. c. carpe (gauche) et Danio rerio et (d) diagrammes de Venn décrivant les chevauchements parmi les marqueurs alignés de manière unique qui se sont intégrés au génome de C. c. carpe (Cc), D. rerio (Dr) et C. idellus (Ci).

3. Cartographie QTL fine pour les traits liés à la croissance et au sexe.

Un total de 21 QTL associés à des traits liés à la croissance ont été détectés sur 12 LG, y compris deux QTL significatifs à l'échelle du génome et 19 QTL significatifs à l'échelle des chromosomes.

Figure 3. Un scan génomique des profils LOD pour (a) la longueur totale, (b) la longueur du corps, (c) la hauteur du corps, (d) la longueur de la tête, (e) le poids du corps et (f) le sexe dans C. c. hématoptèreLes lignes en pointillés et les lignes pleines indiquent les seuils de signification à l'échelle des chromosomes et à l'échelle du génome.

4. Gènes candidats potentiels pour la croissance

Figure 4. La région QTL pour les traits de croissance sur LG27 de C. c. hasematopterus et sa région homologue dans les génomes de D. rerio et C. idellus.

Référence

1. Feng X, Yu X, Fu B, et al.Une carte de liaison génétique haute résolution et un cartographie fine des QTL pour les traits liés à la croissance et au sexe chez la carpe commune du fleuve Yangtsé.Cyprinus carpio haematopterus). BMC génomique, 2018, 19(1) : 230.