What type of controls are necessary for ATAC-Seq experiments?

In the realm of ATAC-Seq experiments, the incorporation of diverse controls is imperative to uphold precision and dependability. The utilization of an input DNA control serves the purpose of normalizing potential biases in DNA preparation and sequencing processes. Technical replicates play a crucial role in confirming the reproducibility and reliability of the outcomes. The inclusion of positive controls, representing established open chromatin regions, acts as a mechanism to authenticate the protocol. On the other hand, negative controls, indicative of anticipated closed chromatin regions, aid in the detection and mitigation of background noise.

How does ATAC-Seq compare to other chromatin accessibility assays like DNase-Seq and FAIRE-Seq?

DNase-Seq, ATAC-Seq, and FAIRE-Seq are all techniques utilized for studying open chromatin regions. DNase-Seq employs the use of DNase I endonuclease to identify accessible chromatin regions, FAIRE-Seq involves sonication followed by phenol-chloroform enrichment, and ATAC-Seq utilizes Tn5 transposase for enrichment and amplification. The high activity of Tn5 transposase makes ATAC-Seq a straightforward, efficient method requiring only 500-50,000 cells. The sensitivity and specificity of ATAC-Seq are comparable to DNase-Seq and superior to FAIRE-Seq.

What techniques are commonly combined with ATAC-seq for research?

ATAC-seq + RNA-seq : Generally, RNA-seq is performed prior to ATAC-seq to identify differentially expressed genes and enriched pathways, which suggest correlations. To determine which factors regulate these target genes, motif analysis via ATAC-seq can identify potential regulatory elements. Subsequent validation can be carried out through additional experiments or ChIP-seq. ATAC-seq + Hi-C: For studies investigating the effects of higher-order chromatin structures on biological processes, ATAC-seq is often used alongside Hi-C. Hi-C provides information on higher-order structures like compartment A/B, TADs, and loops, which indicate correlations. ATAC-seq can further identify promoters, enhancers, and other elements, elucidating how these structures influence gene expression. ATAC-seq + Histone Modifications: While ATAC-seq can predict the accessibility of specific sites and potential transcription factor binding, it does not reveal whether these factors promote or inhibit gene expression. Combining ATAC-seq with histone modification data (e.g., H3K27ac for activation or H3K27me3 for repression) can provide a more comprehensive understanding, making the data more robust and reliable.

ATAC-Seq

CD Genomics est désormais en mesure de fournir un essai pour la chromatine accessible aux transposases avec séquençage à haut débit (ATAC-seq), une méthode pour cartographier l'accessibilité de la chromatine à l'échelle du génome. Cette méthode est une alternative rapide et sensible au DNase-seq (séquençage des sites hypersensibles à la DNase I) ou au MNase-seq (séquençage des sites sensibles à la nucléase micrococcale). En utilisant notre service, vous pouvez détecter des profils à l'échelle du génome des régions ouvertes et accessibles de la chromatine qui sont indicatives de régions régulatrices actives.

Profilage à l'échelle du génome des régions de chromatine ouvertes et accessibles
Une alternative rapide et sensible à DNase-seq ou MNase-seq.
Appel de pics, annotation, analyse différentielle et interprétation fonctionnelle

Directives de soumission d'échantillons

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Les données de séquençage originales
Résultats expérimentaux
Rapport d'analyse des données
Détails dans ATAC-Seq pour votre rédaction (personnalisation)

Table des matières

Aperçu du service ATAC-Seq, de l'isolement des échantillons et des noyaux à la tagmentation Tn5, au séquençage et à l'interprétation fonctionnelle.

L'introduction de l'ATAC-Seq

Le génome eucaryote est fortement emballé pour tenir dans l'espace nucléaire très limité. En conséquence, l'accès à l'information génomique est étroitement régulé en fonction de l'état cellulaire. Les régions du génome qui sont accessibles révèlent beaucoup de choses sur l'état de la cellule. L'ATAC-seq est une technique pour localiser les régions de chromatine accessibles.

L'acronyme ATAC-seq signifie "Assai pour la chromatine accessible par transposase utilisant le séquençage", une technique qui examine l'accessibilité de la chromatine par la transposase à travers le séquençage. Cette approche implique la coupure des régions de chromatine ouverte dans des contextes temporels et spatiaux spécifiques par la transposase, capturant ainsi les séquences régulatrices des gènes activement transcrits dans le génome à ce moment précis. Nécessitant seulement un petit nombre de cellules, cette méthode fournit des informations en temps réel sur les séquences régulatrices contrôlant l'activité à l'échelle du génome. Ses applications incluent l'analyse de la liaison des facteurs de transcription, le positionnement des nucléosomes et la distribution des éléments régulateurs, offrant de vastes perspectives dans le domaine de la recherche épigénétique.

La technique ATAC-seq est une méthode innovante dans la recherche épigénétique qui utilise la transposase Tn5 pour cliver et marquer les sites de chromatine ouverte, permettant un séquençage efficace des cartes d'accessibilité de la chromatine. La transposase Tn5 se lie de manière aléatoire et coupe l'ADN dans les régions de chromatine ouverte, insérant simultanément des séquences d'adaptateur aux sites de clivage. En introduisant le complexe de transposase portant des étiquettes de séquence ADN connues (c'est-à-dire, la transposase Tn5 avec des étiquettes de séquence rouge et verte) dans le noyau pour co-incubation, suivie d'une amplification PCR utilisant les étiquettes de séquence connues, une bibliothèque peut être générée, et le séquençage peut fournir des informations sur les régions de chromatine ouverte.

Avantages de l'ATAC-Seq

Obtenez des connaissances mécanistiques sur la régulation des gènes, la réponse cellulaire au traitement ou à la maladie.
Identifiez quels facteurs de transcription influencent le destin cellulaire, la maladie ou la réponse.
Échantillons de patients limités
Exigences faibles sur la quantité d'échantillon biologique, et l'ensemble du protocole nécessite 3 heures au total.

Applications de l'ATAC-Seq

Positionnement des nucléosomes
Identification des facteurs de transcription clés
Détection des régions promoteurs, des amplificateurs potentiels ou des silencieux
Intégration des données multi-omiques
Cartographie de l'accessibilité de la chromatine
Identification des gènes cibles régulés par les facteurs de transcription

Flux de travail ATAC-Seq

La partie clé de la procédure ATAC-seq est l'action de la transposase Tn5 sur l'ADN génomique de l'échantillon. Les transposases sont des enzymes qui catalysent le déplacement des transposons vers d'autres parties du génome. Alors que les transposases naturellement présentes ont un faible niveau d'activité, l'ATAC-seq utilise une transposase hyperactive mutée. La haute activité permet une coupure très efficace de l'ADN exposé et une ligation simultanée de séquences spécifiques, appelées adaptateurs. Les fragments d'ADN ligaturés avec des adaptateurs sont ensuite isolés, amplifiés par PCR et utilisés pour séquençage de nouvelle générationLe pipeline expérimental de l'ATAC-seq est illustré dans la Figure 1.

Figure 1. Workflow schematic of the ATAC-seq process. Figure 1. Schéma du flux de travail du processus ATAC-seq.

Spécification de service

	Exigences d'échantillon Type d'échantillon : Tissus humains, de souris et de rats, cellules vivantes, pas d'ADN génomique. Cellule ≥ 1 x10⁶Quantité minimale : 5 x 10⁴ Tissu ≥ 500 mg, Quantité minimale : 200 mg Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégies de séquençage Illumina HiSeq PE50 ou PE150. Pour certaines applications telles que le cartographie des nucléosomes, le séquençage en paires d'extrémités est préféré. Illumina HiSeq PE150. ≥50M Lectures.
	Analyse de données Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Contrôle de qualité Cartographie du génome de référence Appel de pics Annotation Analyse différentielle Découverte de motifs Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

The Data Analysis Pipeline of ATAC-Seq.

Livrables

Les données de séquençage originales
Résultats expérimentaux
Rapport d'analyse des données
Détails dans l'ATAC-Seq pour votre rédaction (personnalisation)

CD Genomics assure que nous fournirons un service de haute qualité, et notre équipe professionnelle ne vous décevra pas. Forts de plus de 10 ans d'expérience à servir des chercheurs du monde entier pour le NGS, je pense que nous pourrions l'être. N'hésitez pas à nous contacter si vous avez des questions sur notre service.

Sorties d'analyse ATAC-Seq représentatives

Les sorties dé-identifiées suivantes proviennent d'un projet d'analyse comparative de séquençage ATAC en vrac terminé et illustrent l'évaluation de la qualité des données, la distribution des pics, les relations globales entre les échantillons, l'accessibilité différentielle et l'interprétation fonctionnelle en aval. Les identifiants spécifiques au projet et les résultats biologiques ont été supprimés.

12 sorties · 5 étapes

Évaluation de la qualité des données

Profil d'enrichissement TSS L'enrichissement centré sur les TSS fournit une vue au niveau du projet sur la concentration des signaux d'accessibilité autour des sites de début de transcription avant l'interprétation des pics en aval.

Paysage de pointe et contexte génomique

Annotation de pic Les pics appelés peuvent être attribués à des promoteurs, des régions non traduites, des exons, des introns, des régions en aval et des régions intergéniques distales pour résumer la distribution génomique de la chromatine accessible.

Distribution des pics à l'échelle du chromosome La distribution des pics à l'échelle des chromosomes offre un aperçu au niveau du génome de la manière dont les régions accessibles sont réparties dans l'assemblage de référence.

Distribution de pic par rapport à la TSS Les distances des pics par rapport aux sites de début de transcription aident à résumer le contexte régulatoire des régions de chromatine accessible.

Exploration croisée des échantillons

Chevauchement de pics L'analyse de chevauchement des ensembles de pics résume les régions accessibles partagées et spécifiques à chaque ensemble de données à travers plusieurs échantillons.

PCA d'échantillon global Les profils de comptage de pics peuvent être comparés par analyse en composantes principales pour examiner les relations globales entre les échantillons, la cohérence des répliques, la séparation des groupes et les valeurs aberrantes potentielles avant les tests différentiels.

Accessibilité différentielle

Graphique volcanique d'accessibilité différentielle L'analyse des pics différentiels identifie des régions avec une accessibilité modifiée à travers des comparaisons prédéfinies.

Graphique MA d'accessibilité différentielle Les graphiques MA offrent une vue complémentaire des changements d'accessibilité dans la plage de signaux de pics classés.

Interprétation fonctionnelle

enrichissement GO L'analyse d'enrichissement GO résume les motifs de processus biologiques, de composants cellulaires et de fonctions moléculaires associés aux gènes liés aux pics.

Classification fonctionnelle GO La classification fonctionnelle GO organise les gènes liés aux pics en grandes catégories d'ontologie pour une vue d'ensemble complémentaire de la composition de l'annotation.

Aperçu de l'enrichissement KEGG Les diagrammes en points KEGG comparent l'enrichissement relatif, la représentation des gènes et la signification ajustée à travers les catégories de voies classées.

Résumé du chemin KEGG Les résumés des voies KEGG offrent une vue alternative classée de la représentation des gènes associés aux voies et de leur signification.

FAQ sur l'ATAC-Seq

1. Quels types de contrôles sont nécessaires pour les expériences ATAC-Seq ?

Dans le domaine des expériences ATAC-Seq, l'incorporation de divers contrôles est impérative pour maintenir la précision et la fiabilité. L'utilisation d'un contrôle d'ADN d'entrée sert à normaliser les biais potentiels dans les processus de préparation et de séquençage de l'ADN. Les réplicats techniques jouent un rôle crucial dans la confirmation de la reproductibilité et de la fiabilité des résultats. L'inclusion de contrôles positifs, représentant des régions de chromatine ouverte établies, agit comme un mécanisme pour authentifier le protocole. D'autre part, les contrôles négatifs, indicatifs des régions de chromatine fermée anticipées, aident à la détection et à l'atténuation du bruit de fond.

2. Comment l'ATAC-Seq se compare-t-il à d'autres tests d'accessibilité de la chromatine comme le DNase-Seq et le FAIRE-Seq ?

Le DNase-Seq, l'ATAC-Seq et le FAIRE-Seq sont toutes des techniques utilisées pour étudier les régions de chromatine ouverte. Le DNase-Seq utilise l'endonucléase DNase I pour identifier les régions de chromatine accessibles, le FAIRE-Seq implique une sonication suivie d'un enrichissement au phénol-chloroforme, et l'ATAC-Seq utilise la transposase Tn5 pour l'enrichissement et l'amplification. La haute activité de la transposase Tn5 rend l'ATAC-Seq une méthode simple et efficace nécessitant seulement 500 à 50 000 cellules. La sensibilité et la spécificité de l'ATAC-Seq sont comparables à celles du DNase-Seq et supérieures à celles du FAIRE-Seq.

3. Quelles techniques sont couramment combinées avec l'ATAC-seq pour la recherche ?

ATAC-seq + RNA-seqEn général, le RNA-seq est réalisé avant l'ATAC-seq pour identifier les gènes exprimés de manière différentielle et les voies enrichies, ce qui suggère des corrélations. Pour déterminer quels facteurs régulent ces gènes cibles, l'analyse de motifs via l'ATAC-seq peut identifier des éléments régulateurs potentiels. Une validation ultérieure peut être effectuée par le biais d'expériences supplémentaires ou de ChIP-seq.

ATAC-seq + Hi-CPour les études investiguant les effets des structures chromatiniennes de haut niveau sur les processus biologiques, l'ATAC-seq est souvent utilisé en complément du Hi-C. Le Hi-C fournit des informations sur les structures de haut niveau telles que les compartiments A/B, les TADs et les boucles, qui indiquent des corrélations. L'ATAC-seq peut en outre identifier les promoteurs, les amplificateurs et d'autres éléments, éclaircissant ainsi comment ces structures influencent l'expression génique.

ATAC-seq + Modifications des HistonesBien que l'ATAC-seq puisse prédire l'accessibilité de sites spécifiques et le potentiel de liaison des facteurs de transcription, il ne révèle pas si ces facteurs favorisent ou inhibent l'expression génique. Combiner l'ATAC-seq avec des données de modification des histones (par exemple, H3K27ac pour l'activation ou H3K27me3 pour la répression) peut fournir une compréhension plus complète, rendant les données plus robustes et fiables.

Études de cas ATAC-Seq

Analyses multiomiques des effets de la lumière blanche LED sur le mûrissement des fruits d'abricot.

Journal : Journal de Recherche Avancée
Facteur d'impact : 12,822
Publié : Disponible en ligne le 9 janvier 2024

Contexte

AbricotPrunus armeniaca L..), originaire d'Asie centrale et largement cultivé dans des régions comme le Méditerranée et la Chine, est populaire pour sa couleur, son goût et ses nutriments, mais a une durée de conservation courte de 3 à 5 jours. Le processus de maturation et de sénescence, régulé par l'éthylène, implique des changements physiologiques complexes. Malgré des recherches approfondies, les changements de métabolites et les mécanismes régulateurs pendant le stockage après récolte ne sont pas entièrement compris. Les diodes électroluminescentes (DEL) offrent une méthode écologique pour prolonger la durée de conservation en retardant la sénescence et en maintenant la qualité. Cette étude examine les effets de la lumière blanche des DEL sur la qualité des fruits d'abricot, transcriptome, métabolome et accessibilité de la chromatine, visant à améliorer les méthodes de stockage et à prolonger la durée de conservation.

Matériaux et Méthodes

Préparation de l'échantillon :

Préparation d'échantillons
Fruits d'abricot mûrs
600 fruits non endommagés et sans pourriture
Extraction et détection de l'ARN
Collecte de cellules

Séquençage :

Construction de bibliothèque
Séquençage du transcriptome
séquençage ATAC
Réaction de transposition et purification

Analyse de données:

Dépistage et analyse des gènes exprimés de manière différentielle
Analyse d'enrichissement
Analyse des régions différemment accessibles
Analyse de la fonction des gènes

Résultats

Dans cette étude, la transcriptomique des fruits a utilisé le PCC comme indice pour évaluer la corrélation entre les réplicats biologiques, montrant des valeurs élevées (>0,9), indiquant une forte similarité (Fig. 1F). L'analyse a révélé des motifs d'expression génique différentielle à travers les comparaisons : CK-0 d vs. CK-8 d (6 256 gènes différentiellement exprimés), CK-0 d vs. LED-8 d (8 110 gènes différentiellement exprimés), et CK-8 d vs. LED-8 d (1 792 gènes différentiellement exprimés), avec des chevauchements variables (Fig. 1I). L'enrichissement KEGG et GO a mis en évidence des voies telles que la biosynthèse de métabolites secondaires et les rôles régulateurs des gènes différentiellement exprimés dans la saveur, la texture, la couleur, la biosynthèse de l'éthylène, les facteurs de transcription et les processus oxydatifs. La lumière LED a régulé 56 gènes différentiellement exprimés lors de la maturation des fruits, impactant les voies métaboliques et les activités transcriptionnelles.

Fig. 1. Impact of LED treatment on physiological traits and gene expression in apricot fruits. (Bai et al., 2024) Fig. 1. Effets du traitement par LED sur la qualité physiologique et la transcription des fruits d'abricot.

Des analyses transcriptomiques et métabolomiques combinées ont révélé qu'en présence d'irradiation LED, la pyrophosphorylase UDP-sucrose (USP) était régulée à la hausse, augmentant la synthèse de D-glucuronate, tandis que l'inositol oxydase (MIOX) et la déshydrogénase d'aldéhyde (ALDH) étaient régulées à la baisse, réduisant l'accumulation de myo-inositol. Le traitement par LED a également diminué l'accumulation de L-déhydroascorbate en affectant les activités de la peroxydase de L-ascorbate (APX) et de l'oxydase de L-ascorbate (AO). De plus, les augmentations induites par la LED des niveaux de cinnamoyl-CoA ont régulé à la hausse la synthase de chalcone (CHS) et la synthase de phlorizine (PTG1), modifiant le métabolisme des flavonoïdes et favorisant la biosynthèse des anthocyanines par la régulation à la hausse de la dihydroflavonol 4-réductase (DFR).

Fig. 2. Integration of transcriptomic and metabolomic data reveals the pathway of flavonoid biosynthesis. (Bai et al., 2024) Fig. 2. La voie métabolique de la biosynthèse des flavonoïdes a été analysée en combinant les données de transcriptome et de métabolome.

L'analyse ATAC-seq des fruits d'abricot après traitement par LED a révélé 616,85 millions de lectures propres avec des pourcentages de bases Q30 élevés, indiquant une qualité de données robuste. L'analyse de corrélation a montré une forte reproductibilité parmi les réplicats biologiques au sein de chaque groupe. L'analyse différentielle a identifié 4492, 1769 et 123 régions d'accessibilité différentielle (DARs) dans CK-0 d vs. CK-8 d, CK-0 d vs. LED-8 d, et CK-8 d vs. LED-8 d, respectivement. L'analyse des motifs a mis en évidence 76 facteurs de transcription (TFs), y compris des facteurs de réponse à l'éthylène (ERF2, ERF9, ERF069, ERF104 et MYB124), impliqués dans la régulation des DARs et des gènes cibles. Ces résultats soulignent les changements induits par les LED dans l'accessibilité de la chromatine et la régulation des TF, influençant l'expression des gènes et le développement des fruits chez les abricots.

Fig. 3. ATAC-seq profiling during apricot fruit ripening. (Bai et al., 2024) Fig. 3. Vue d'ensemble des données ATAC-seq de la maturation des fruits d'abricot.

Fig. 4. (A) Differential gene expression and chromatin accessibility heatmap. (B) Integration of transcriptomic, metabolomic, and ATAC-seq data elucidates phenylpropanoid biosynthesis pathways. (Bai et al., 2024) Fig. 4. (A) Expression génique différentielle et carte thermique des régions chromatiniennes ouvertes. (B) La voie métabolique de la biosynthèse des phénylpropanoïdes a été analysée en combinant les données de transcriptome, de métabolome et d'ATAC-seq.

Dans les fruits d'abricot traités par LED, l'intégration des analyses transcriptomiques et ATAC-seq a révélé des gènes avec une accessibilité chromatinienne et des niveaux d'expression modifiés. HCT a montré une accessibilité chromatinienne réduite et une diminution de l'expression génique, tandis que POD et 4CL ont présenté des changements variables dans l'accessibilité associés à une régulation mixte à la hausse et à la baisse de l'expression génique.

L'analyse métabolomique a mis en évidence que la biosynthèse des phénylpropanoïdes était significativement affectée par le traitement aux LED. Les changements dans l'expression de HCT ont influencé l'accumulation de métabolites spécifiques comme l'acide p-coumaroyl shikimique et l'acide caféoyl quinique. La POD et la 4CL, avec une accessibilité chromatinienne modifiée et une expression génique variée, ont joué des rôles dans les voies de synthèse de la lignine, essentielles pour maintenir la qualité des fruits d'abricot pendant le stockage.

Fig. 5. Regulatory network model of LED light effects on apricot fruit ripening. (Bai et al., 2024) Fig. 5 Modèle du réseau de régulation de la lumière LED pendant le mûrissement des fruits d'abricot récoltés.

Conclusion

Le traitement par LED a modifié les voies de métabolisme de l'acide ascorbique et des uronates, la biosynthèse des flavonoïdes et la biosynthèse des phénylpropanoïdes dans les fruits d'abricot, influençant l'expression des gènes liés à la signalisation des hormones végétales, à la qualité des fruits et à l'activité antioxydante. Cette recherche met en évidence le potentiel des LED pour prolonger la conservation et la durée de vie des fruits et légumes.

Référence :

Bai C, Zheng Y, Watkins CB, et al.Analyses multiomiques des effets de la lumière blanche LED sur le mûrissement des fruits d'abricot. Journal de recherche avancée. 2024.

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