Directives de Soumission d'Échantillons
Pourquoi quantifier le nombre de copies de l'ADN mitochondrial ?
Le nombre de copies d'ADN mitochondrial (mtDNA-CN) reflète le nombre de génomes mitochondriaux par cellule. Cette mesure est fondamentale biomarqueur de l'activité mitochondriale et la santé bioénergétique cellulaire.
Raisons clés pour lesquelles les chercheurs choisissent la quantification de l'ADNmt-CN
- Biologie du cancer et diagnostics
La quantité d'ADNmt est souvent modifiée selon les types de cancer. Dans de nombreuses tumeurs—en particulier celles de la vessie, du sein et des reins—elle est inférieure par rapport aux tissus normaux. La quantification de ce changement à l'aide d'un test de nombre de copies d'ADNmt soutient la découverte de biomarqueurs et l'évaluation thérapeutique. - Maladies liées à l'âge et maladies métaboliques
Un faible nombre de copies d'ADNmt est corrélé avec le vieillissement, les maladies cardiovasculaires, la dysfonction rénale chronique et une mortalité accrue. Une quantification précise du nombre de copies d'ADN mitochondrial aide les études sur le métabolisme, la fragilité, la neurodégénérescence et les interventions liées au vieillissement. - Développement thérapeutique et tests de toxicité
Les changements dans le nombre de copies d'ADNmt peuvent indiquer une dysfonction mitochondriale due à des médicaments ou à un stress environnemental. Intégré dans les pipelines des CRO, le qPCR du nombre de copies d'ADNmt aide à signaler la toxicité mitochondriale et à comparer les effets des composés. - Évaluation méthodologique et standardisation
Plusieurs plateformes (qPCR, WGS, microarrays) peuvent mesurer la CN de l'ADNmt, mais des études montrent que le qPCR reste rentable et rapide, à condition que l'extraction de l'ADN et la conception de l'essai soient optimisées.
Qu'est-ce que le nombre de copies d'ADN mitochondrial ?
Les mitochondries contiennent des centaines à des milliers de génomes mitochondriaux par cellule, variant selon les tissus et la physiologie. Mesurer nombre de copies d'ADNmt par cellule quantifie le contenu mitochondrial et la biogenèse.
Évaluation des techniques d'estimation du nombre de copies de l'ADNmt
Parmi les essais, La qPCR reste la norme de référence., offrant une haute sensibilité (>30 pg), un délai d'exécution rapide et un haut débit. Il prend en charge la quantification en un tube avec détection de double cible (ADNmt contre ADN nucléaire), fournissant des résultats fiables lors de l'utilisation de primers et de sondes TaqMan validés.
Notre essai qPCR du nombre de copies d'ADNmt 🧪
Nous offrons une précision. nombre de copies d'ADNmt qPCR service utilisant un essai basé sur une sonde TaqMan qui mesure simultanément l'ADN mitochondrial et nucléaire en une seule réaction. Cette méthode garantit une précision quantification du nombre de copies d'ADN mitochondrial avec des performances robustes sur divers types d'échantillons.
Aperçu de l'essai et technologie
- La chimie des sondes d'hydrolyse TaqMan augmente la spécificité : l'exonucléase 5′–3′ clive la sonde uniquement lorsqu'elle est liée à la cible, produisant une fluorescence directement proportionnelle à la quantité d'ADN cible.
- Nous ciblons une région conservée de l'ADNmt avec des amorces et une sonde conçues sur mesure pour éviter l'amplification des pseudogènes mitochondriaux nucléaires (NUMTs).
- Un gène nucléaire de référence (par exemple, IFNB1 ou B2M) est amplifié en parallèle pour la normalisation, permettant un calcul précis du rapport mtADN-à-nADN par cellule.
Mesures de performance
- Haute sensibilité : détecte de manière fiable jusqu'à ~30 pg d'ADN d'entrée.
- Précision exceptionnelle : coefficient de variation (CV) < 5 % pour les valeurs de Cq ; CV < 15 % pour les copies calculées par cellule.
- Large plage dynamique : validé sur des dilutions en série, fournissant des courbes standard linéaires (efficacité 90–110 %).
Conception de primers et de sondes
- Les amorces d'ADNmt sont cartographiées sur la région D-loop ou ND1, choisies pour leur forte conservation et l'absence d'homologie avec les NUMT.
- Le primer de référence nucléaire correspond à un gène en copie unique (amplicon de 110 bp).
- Tous les conceptions sont rigoureusement évaluées pour leur spécificité à l'aide de courbes de fusion, d'électrophorèse sur gel et de vérifications BLAST in silico.
Quantification du nombre de copies en une étape
- Amplification à double cible (ADNmt + ADNn) dans un seul puits.
- Nombre de copies relatif : calculé via la méthode ΔΔCq.
- Nombre de copies absolu : en comparant aux courbes standard provenant d'ADN de référence avec une CNmt ADN connue.
Évitement des cibles non désirées
- Conçu pour exclure les amplicons non humains et dérivés de NUMT—confirmé par des valeurs Cq élevées ou aucune signal dans les contrôles négatifs/sans modèle.
- L'analyse de la courbe de fusion garantit un pic d'amplification unique et spécifique, évitant les dimères d'amorces ou les produits non spécifiques.
Table : Séquences de primers utilisées dans notre essai qPCR sur le nombre de copies de l'ADNmt
| Gène cible | Nom du primaire | Direction | Séquence (5′ → 3′) | Longueur (pb) |
|---|---|---|---|---|
| mt-ND1 | mt-ND1-F | Transmettre | TACGGGCTACTACAACCCTTC | 21 |
| mt-ND1 | mt-ND1-R | Inverse | ATGGTAGATGTGGCGGGTTT | 20 |
| mt-ND5 | mt-ND5-F | Transmettre | CATTACTAACAACATTTCCCCCGC | 24 |
| mt-ND5 | mt-ND5-R | Inverse | GGCTGTGAGTTTTAGGTAGAGGG | 23 |
| (Control) | SERPINA1-F | Transférer | CAGTGAATAAATGAGGCGTACATCC | 25 |
| (Control) | SERPINA1-R | Inverse | GACTGTTTCTCATGCCTCTGGAAAG | 25 |
Remarque : Pour l'estimation du nombre de copies d'ADNmt, mt-ND1 est la cible principale. SERPINA1 peut servir de gène de référence nucléaire (selon le contexte). Aucune séquence de sonde TaqMan n'a été mentionnée ; si des sondes sont également disponibles, je peux les inclure..
Aperçu du flux de travail🔬
Étape 1 : Arrivée de l'échantillon et contrôle qualité
- Recevoir du sang, des tissus, des cellules ou de l'ADNg purifié.
- Vérifiez l'étiquetage, l'intégrité des tubes et les conditions de stockage.
- Effectuez une quantification de l'ADN (A260/280 ~1,8) et vérifiez l'entrée (≥ 5 ng)
Étape 2 : Extraction de l'ADN (si nécessaire)
- Utilisez un solvant organique ou un kit commercial.
- Privilégiez des méthodes biologiques pour maintenir un rendement constant en ADNmt/ADNn.
Étape 3 : Configuration et exécution de la qPCR
- Préparer un essai duplex TaqMan (mtND1/ND5 + référence nucléaire)
- Exécutez en triplicat avec des contrôles positifs, sans modèle et sans humain.
Étape 4 : Contrôle de qualité des données et analyse
- Assurez-vous que les réplicats en triplicat ont un SD <0,5.
- Vérifiez les courbes d'amplification et de fusion pour la spécificité.
- Calculez ΔCq et le nombre absolu de copies d'ADNmt par rapport à la courbe standard.
Étape 5 : Livraison du rapport
- Fournir un rapport PDF détaillé avec des graphiques de données et des métriques de contrôle qualité.
- Fournir des fichiers de données brutes, un résumé d'analyse et des notes d'interprétation.
- Téléchargez tous les livrables sur notre portail en ligne sécurisé.
Applications de recherche
Recherche sur le cancer
Détecter la déplétion ou l'amplification de l'ADNmt dans les tumeurs par rapport aux tissus normaux adjacents.
Études sur le vieillissement et la longévité
Surveillez le déclin mitochondrial avec l'âge ou après des interventions (régime, médicaments, exercice).
Troubles métaboliques et mitochondriaux
Identifier des altérations dans le mtDNA-CN liées au diabète, à l'obésité ou à des mutations héréditaires du mtDNA.
Exposition environnementale et professionnelle
Évaluer la toxicité mitochondriale due aux polluants, à la radiation ou aux produits chimiques.
Pharmacologie et toxicologie
Évaluer le stress mitochondrial induit par les médicaments dans les études de sécurité précliniques.
Ingénierie cellulaire et criblages CRISPR
Confirmer les effets mitochondriaux des modifications génétiques ou des traitements par petites molécules.
Pourquoi choisir CD Genomics ?
✅ Précision Scientifique
Nous utilisons des tests qPCR duplex validés avec une conception rigoureuse des amorces et des sondes. Chaque résultat est soutenu par des courbes d'amplification contrôlées en qualité, une vérification des courbes de fusion et une calibration de courbe standard.
✅ Compatibilité flexible des échantillons
De sang total à la salive, en passant par les tissus et les cellules cultivées, notre plateforme s'adapte à une grande variété de types d'échantillons, garantissant une quantification cohérente du ratio mtDNA/nDNA à travers divers modèles de recherche.
✅ Transparence des données de bout en bout
Nos livrables comprennent des conditions d'essai complètes, des métriques de contrôle qualité, des fichiers de données brutes et des sorties de nombre de copies normalisées, prêtes pour une interprétation ultérieure ou une documentation réglementaire.
✅ Fiabilité de niveau CRO
Nos flux de travail répondent aux normes de recherche et précliniques. Que vous meniez des études mécanistiques, des dépistages de toxicité ou des découvertes de biomarqueurs, nous aidons à garantir l'intégrité des données à chaque étape.
Livrables
- Rapport PDF complet
Comprend un aperçu de la méthodologie, les séquences de l'amorce/probe, les conditions de réaction, les courbes d'amplification et de fusion, les valeurs Cq, les courbes standard et le rapport mtDNA/nDNA normalisé, avec des indicateurs de qualité pour la transparence. - Exportation de données brutes
Fichiers qPCR (.csv, .xlsx) contenant des seuils de cycle et la disposition des plaques pour l'intégration avec les pipelines d'analyse de données des clients. - Validation de la courbe standard
Linéarité de l'essai démontrée (R² >0,99, efficacité 90–110 %) et calibration du nombre de copies absolu. - Métriques d'assurance qualité
Coefficient de variation (CV) pour Cq <5 % et estimations de copies par cellule <15 %, conformément aux performances du kit RayBio. - Résumé de l'interprétation
Contexte scientifique bref décrivant si la CN de l'ADNmt montre une déplétion ou une élévation par rapport aux seuils de contrôle. - Accès au portail de données sécurisé
Rapport PDF et données brutes accessibles via la plateforme en ligne conforme de CD Genomics.
Exigences d'échantillon
| Type d'échantillon | Format et montant requis | Entrée d'ADN recommandée |
|---|---|---|
| Sang total | Tubes EDTA/héparine, 1–5 mL | ≥ 5 ng par réaction qPCR |
| PBMCs | 1–5×10⁶ cellules, fraîches ou congelées | ≥ 5 ng par réaction |
| Tissu (frais/surgelé) | ≥ 10 mg (congelé sur place/RNAlater) | ≥ 5 ng par réaction |
| Cellules cultivées | ≥ 1×10⁶ cellules | ≥ 5 ng par réaction |
| Salive / écouvillon buccal | Collecté dans un tampon stabilisant l'ADN | ≥ 5 ng par réaction |
| Urine / LCR / lavage | Volume de 1 à 5 mL | Variable ; viser ≥ 5 ng si possible |
| ADNg purifié | A260/280 ≈ 1,8–2,0 ; faible fragmentation | ≥ 0,1 ng par réaction |
1. Qu'est-ce que le nombre de copies de l'ADN mitochondrial ?
Le nombre de copies d'ADN mitochondrial (mtDNA-CN) fait référence au nombre moyen de copies du génome mitochondrial par cellule. C'est un indicateur clé de la fonction mitochondriale, et les écarts—qu'il s'agisse d'une déplétion ou d'une amplification—sont liés à diverses conditions telles que le cancer, le vieillissement et les maladies rénales.
2. Pourquoi utiliser la qPCR pour la quantification du nombre de copies d'ADNmt ?
La qPCR en temps réel est la norme de référence pour la quantification du nombre de copies d'ADNmt en raison de son équilibre entre sensibilité (jusqu'à ~30 pg d'ADN), efficacité, spécificité et débit. Elle surpasse les microarrays en termes de coût et de rapidité, ce qui la rend idéale pour les flux de travail pilotés par des CRO.
3. Quelle est la précision de l'approche qPCR ?
- Des triplicats avec un SD < 0,5 garantissent la précision.
- La sensibilité de l'essai permet de détecter des différences subtiles, bien que des changements inférieurs à 2 fois puissent remettre en question l'exactitude.
- Les études de validation croisée, y compris la COMPARAISON PLOS du qPCR par rapport au WGS/WES, confirment la fiabilité du qPCR pour l'estimation de l'ADNmt.
4. Quels échantillons sont compatibles avec votre test ?
Nous acceptons le sang EDTA, les PBMC, divers types de tissus, des cellules cultivées, de la salive, de l'urine, du LCR et de l'ADN génomique purifié. Nous suivons des protocoles validés adaptés au type d'échantillon, garantissant une analyse cohérente et fiable du nombre de copies de l'ADNmt.
5. Ce service peut-il détecter des variations du nombre de copies d'ADNmt dans les études sur le cancer ?
Absolument. La variation de la quantité d'ADN mitochondrial (mtDNA-CN) est bien documentée dans de nombreux types de cancer, y compris les cancers du sein, du rein et de la vessie. Notre test de quantification du nombre de copies d'ADN mitochondrial fournit des données quantitatives pour soutenir les études sur les biomarqueurs du cancer et les mécanismes.
6. Comment gérez-vous les séquences mitochondriales nucléaires (NUMTs) ?
Notre essai utilise des amorces et des sondes ciblant des régions hautement conservées du génome mitochondrial (par exemple, ND1, ND5) et inclut une courte référence de gène nucléaire. Ce design évite la co-amplification des NUMT. Les contrôles de courbe de fusion et sans modèle garantissent en outre la spécificité.
7. La quantité d'ADN de faible qualité ou fragmenté peut-elle être quantifiée avec précision ?
Bien que la qPCR fonctionne mieux sur de l'ADN intact, nos tests tolèrent une fragmentation modérée (<120 pb cibles). Des tests de contrôle qualité en série de qPCR peuvent également détecter de l'ADN dégradé et exclure des échantillons inexactes.
