oxBS-seq

La méthylation de l'ADN et l'hydroxyméthylation sont des modifications épigénétiques importantes pour la régulation de l'expression génique. La méthylation de l'ADN réprime généralement la transcription des gènes. L'hydroxyméthylation, au contraire, active l'expression des gènes ou incite à la déméthylation de l'ADN.

La 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) est convertie à partir de la 5-méthylcytosine (5mC) par un groupe d'enzymes appelées dioxygénases de la famille ten-eleven translocation (TET). Les technologies de conversion au bisulfite, considérées comme la référence en matière d'étude de la méthylation de l'ADN, ne distinguent pas entre 5mC et 5hmC. Cependant, de nouvelles approches pour cartographier la 5hmC à l'échelle du génome ont progressé rapidement, bien qu'il soit encore incertain de savoir comment les différentes méthodes se comparent en termes de précision pour identifier la 5hmC.

CD Genomics peut fournir trois approches de détection à l'échelle du génome pour 5hmC :

• Séquençage bisulfite/oxydatif de l'ADN à l'échelle du génome entierWGBS/WGoxBS-seq)
• Séquençage oxydatif de bisulfite représentatif réduitRRBS/RRoxBS)
• Immunoprécipitation basée sur des anticorps et séquençage de l'ADN hydroxyméthyléhMeDIP-seq).
• Séquençage ciblé de l'ADN par bisulfite/hydroxyméthylationTBS/ oxTBS-seq)
• Technologie de marquage chimique sélectif de 5hmC (5hmC -Seal)

L'introduction de l'oxBS-seq

La 5-méthylcytosine (5mC) peut être oxydée par un groupe d'oxygénases appelées enzymes de translocation dix-onze (Tets). Sous consommation d'oxygène et de 2-oxoglutarate, ces dioxygénases dépendantes du Fe(II) oxydent la 5mC dans une première réaction en 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), suivie de la 5-formylcytosine (5fC) et enfin de la 5-carboxycytosine (5caC). La forme la plus abondante de ces variantes de cytosine oxydées est la 5hmC.

La conversion oxydative du bisulfite (oxBS), une réaction d'oxydation pré-bisulfite, convertit 5hmC en 5fC, qui sera ensuite converti par le bisulfite en 5f-uracile et en thymine lors de la PCR subséquente. Cette bibliothèque est ensuite comparée à une bibliothèque de séquençage au bisulfite traditionnelle (BS-seq) construite sur le même échantillon pour déterminer la quantité de 5mC et 5hmC pour chaque cytosine modifiée au sein de l'ADN. L'oxBS-seq a un flux de travail expérimental relativement simple et rapide et peut obtenir simultanément le méthylome et l'hydroxyméthylome.

Si vous souhaitez en savoir plus sur l'introduction de l'oxBS-seq, vous pouvez consulter notre article : "oxBS-Seq, une méthode de séquençage épigénétique pour distinguer 5mC et 5hmC.

Figure 1. Schéma du principe de l'oxBS-seq. (Booth et al., 2013)

Quels sont les avantages de l'oxBS-seq ?

• La résolution à un nucléotide unique englobe à la fois la méthylation des CpG et des non-CpG à travers l'ensemble du génome.
• La densité de 5mC dans les régions répétitives et les régions de densité inférieure est couverte.
• Les méthodes distinguent clairement entre 5mC et 5hmC, permettant une identification précise de 5mC.
• Établissement d'un nouveau "standard d'or" pour la détection de la méthylation de l'ADN
• Détection à l'échelle du génome des modifications d'hydroxyméthylation de l'ADN à un seul nucléotide
• Validation multi-critères pour une efficacité d'oxydation élevée et un taux de conversion de bisulfite élevé
• Le biais expérimental est minimal, avec une haute reproductibilité (R²>0,98)
• Satisfaire des besoins divers en matière d'application de séquençage : Séquençage de méthylation d'oxydation à l'échelle du génome simplifié (oxRRBS), Séquençage de méthylation d'oxydation de région ciblée (Target-oxBS)

Quelles sont les applications de l'oxBS-seq ?

Notre analyse oxBS-seq présente des applications polyvalentes dans divers domaines de recherche :

• Épigénétique : En facilitant les investigations sur l'interaction entre la méthylation de l'ADN et l'hydroxyméthylation dans divers scénarios biologiques, notre analyse oxBS-seq offre une compréhension nuancée des modifications épigénétiques liées à la régulation génique, à la différenciation cellulaire et aux voies de développement.
• Recherche sur les maladies : Grâce à un examen minutieux des motifs de méthylation et d'hydroxyméthylation de l'ADN dans des échantillons de maladies, notre analyse oxBS-seq révèle des altérations épigénétiques liées à des affections telles que le cancer, les troubles neurologiques et les maladies cardiovasculaires.
• Environnemental ÉpigénomiqueLargement utilisé pour examiner l'influence des stimuli environnementaux sur la dynamique de la méthylation et de l'hydroxyméthylation de l'ADN, notre analyse oxBS-seq aide à discerner les changements épigénétiques induits par des expositions environnementales variées, éclairant ainsi leurs implications potentielles sur la santé et la susceptibilité aux maladies.
• Biologie du développement : Facilitant l'exploration des dynamiques de méthylation de l'ADN tout au long du développement embryonnaire et des processus de différenciation tissulaire, notre analyse oxBS-seq fournit des paysages de méthylation complexes à haute résolution.

Flux de travail de séquençage oxBS-seq

L'ADN génomique a été traité pour obtenir des fragments de 10 kb. L'ADN fragmenté a été concentré à l'aide de colonnes de purification. Cet ADN fragmenté et purifié a été soumis à un traitement d'oxydation + bisulfite. Un échange de tampon, une dénaturation, une oxydation, une conversion au bisulfite, un nettoyage et une évaluation qualitative de l'oxydation de la 5-hydroxyméthylcytosine ont été réalisés. Enfin, l'ADN oxBS et l'ADN converti au BS ont été utilisés pour construire des bibliothèques oxBS-seq et BS-seq correspondantes. Tout l'ADN double et simple brin a été quantifié sur un bioanalyseur Agilent 2100 avant la génération de clusters et le séquençage sur la plateforme Illumina selon les protocoles du fabricant.

Figure 2. Schémas des étapes pour le séquençage à haut débit du répertoire de séquences d'Ig (Georgiou et al., 2014).

Spécification du service

	Exigences d'échantillon oxWGBS-Seq ADN génomique ≥ 3 µg, Quantité minimale : 1 µg, Concentration ≥ 30 ng/µL OxRRBS-Seq ADN génomique ≥ 2µg, Concentration ≥ 50 ng/µL oxTBS-Seq ADN génomique ≥ 1µg, Concentration ≥ 20 ng/µL Montant initial d'ADN génomique ≥ 3 µg (5hmC Seal-seq), Concentration de l'échantillon ≥ 50 ng/µl Tous les échantillons d'ADN sont validés pour leur pureté et leur quantité. Pour cfDNA, 15-40 ng (5hmC Seal-seq)
	Séquençage Illumina, PE150 WGBS+oxWGBS : >=30X RRBS+oxRRBS : données de 10 Go) TBS+oxTBS : profondeur de séquençage >= 200X hMeDIP-seq(IP+Input) : >=20M lectures 5hmC Seal-seq (IP+Input) : >=20M lectures Plus de 80 % des bases avec un score de qualité ≥Q30
	Analyse bioinformatique Nous proposons des analyses bioinformatiques personnalisées, y compris : Contrôle de la qualité des données de séquençage Alignement par rapport au génome de référence Distribution des niveaux de méthylation et d'hydroxyméthylation du génome entier Analyse de corrélation Analyse PCA Analyse de la méthylation différentielle et analyse de l'hydroxyméthylation différentielle Annotation fonctionnelle avec analyse GO/KEGG Analyse du niveau d'expression différentielle des gènes associés aux pics

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails dans oxBS-seq pour votre écriture (personnalisation)

Références:

1. Giehr, Pascal, Kyriakopoulos, et al. Deux valent mieux qu'un : HPoxBS - séquençage bisulfite oxydatif en épingle à cheveux. Recherche sur les acides nucléiques, 2018.
2. Skvortsova K, Zotenko E, Luu P L, et al. Évaluation complète des approches de profilage du 5-hydroxyméthylcytosine à l'échelle du génome dans l'ADN humain. Épigénétique et chromatine, 2017, 10(1):16.
3. Booth M J, Ost T W B, Beraldi D, et al. Séquençage bisulfite oxydatif de la 5-méthylcytosine et de la 5-hydroxyméthylcytosine. Protocoles de la nature, 2013, 8(10) : 1841-1851.
4. Han Y, Ji L, Guan Y, et al. Un paysage épigénomique de la néoplasie intraépithéliale cervicale et du cancer du col de l'utérus utilisant le méthylome et l'hydroxyméthylome à résolution d'une seule base. Médecine clinique et translationnelle, 2021, 11(7) : e498.

(Han et al., 2021)

1. Qu'est-ce que l'oxBS-seq ?

oxBS-seq est une séquençage à haut débit technique utilisée pour mesurer la distribution de la méthylation et de l'hydroxyméthylation de l'ADN. Elle combine un traitement au bisulfite oxydatif (oxBS) avec une analyse de séquençage pour distinguer 5mC et 5hmC à une résolution d'une seule base, fournissant des informations détaillées sur ces deux modifications dans le génome.

2. En quoi l'oxBS-seq diffère-t-elle de la BS-seq traditionnelle ?

La séquençage BS traditionnel (séquençage au bisulfite) convertit les cytosines non méthylées (Cs) en uraciles (Us) tout en préservant les Cs méthylés. Cependant, 5hmC est également converti en T par le BS, le rendant indistinguable de 5mC. En revanche, l'oxBS-seq oxyde chimiquement 5hmC en C avant le traitement au BS, permettant ainsi de différencier 5mC et 5hmC.

3. Quel est le flux de travail de l'oxBS-seq ?

Le flux de travail oxBS-seq comprend plusieurs étapes clés : extraction de l'ADN, traitement par méthylation oxydative, traitement par bisulfite (BS), séquençage et analyse des données qui s'ensuit. Initialement, 5hmC subit une oxydation en C, suivie d'un traitement par BS pour convertir les Cs non méthylés en Ts tout en préservant 5mC et 5hmC. Par la suite, des données de séquençage sont générées et soumises à une analyse complète utilisant des outils de bioinformatique.

4. Quelles sont les méthodes d'analyse des données oxBS-seq ?

Les rubriques analytiques appliquées aux données oxBS-seq englobent plusieurs aspects : le prétraitement, l'alignement, l'évaluation des niveaux de méthylation et l'analyse des modifications différentielles. L'étape de prétraitement comprend les tâches de contrôle de qualité et de découpage des séquences. L'alignement est une tâche qui facilite l'appariement des données de séquençage à un génome de référence, permettant l'estimation des niveaux de méthylation à chaque site et permettant de différencier 5mC et 5hmC. Une série d'analyses statistiques ultérieures et d'interprétations biologiques sont déployées pour mettre en lumière des conclusions pertinentes à la question de recherche principale.

5. Comment concevoir des expériences oxBS-seq ?

La stratégie des expériences oxBS-seq nécessite l'exécution de certaines tâches telles que la sélection des échantillons, l'élaboration du plan expérimental, la détermination de la profondeur de séquençage et la planification de l'analyse des données. Pour répondre de manière holistique à une série de questions de recherche, l'expérimentateur peut ajuster les paramètres de l'expérience, garantissant ainsi une meilleure fiabilité et précision des résultats expérimentaux. De plus, il est essentiel d'incorporer des témoins expérimentaux et des répliques efficaces, afin de soutenir la reproductibilité et la stabilité des résultats.

6. Quelles sont les limitations de l'oxBS-seq ?

Bien que l'oxBS-seq présente de nombreux avantages, elle n'est pas sans limitations. Par exemple, un spectre de faibles niveaux de méthylation ou des zones de faible complexité génomique peuvent potentiellement compromettre l'exactitude de la technique. De plus, la rigueur technique exigée par les procédures expérimentales et l'analyse des données qui suit peut poser des défis considérables.

Modifications de la méthylation et de l'hydroxyméthylation de l'ADN à l'échelle du génome révélées par la régulation épigénétique de la neuromodulation et de la myélinisation dans l'hypothalamus de yak.

Journal : Frontières en Génétique
Facteur d'impact : 4,772
Publié : 27 septembre 2021

Contexte

La 5-méthylcytosine (5mC) et la 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC) sont des modifications épigénétiques significatives intégrales au processus de neurodéveloppement. Cependant, peu de recherches existent pour identifier les motifs à l'échelle du génome de 5mC et 5hmC dans les régions cérébrales animales en fonction des environnements naturels en haute altitude.

Méthodes

Résultats

RRBS et oxRRBS fournissent un profilage de la méthylation et de l'hydroxyméthylation avec une résolution d'une seule base à travers 3,28 millions de sites CpG, avec oxRRBS montrant une corrélation plus élevée entre les brins opposés. La cohérence plus faible dans RRBS peut être due à l'implication dynamique de 5hmC dans la déméthylation de l'ADN. L'analyse axée sur les sites "vrais" de 5hmC a révélé des différences spécifiques aux tissus entre le yak et le bétail, en particulier dans l'hypothalamus, le cervelet et le tronc cérébral.

Fig 1. Méthylation et hydroxyméthylation de l'ADN global parmi les échantillons.

L'étude a élucidé des schémas de distribution distincts des niveaux de 5mC et de 5hmC à travers les gènes, mettant en évidence des différences significatives entre les tissus, en particulier dans l'hypothalamus. Des comparaisons par paires entre les cerveaux de yak et de bovins ont révélé des régions de méthylation et d'hydroxyméthylation différentielles (DMRs et DhMRs), principalement entraînées par des niveaux altérés de 5mC et de 5hmC. L'analyse d'enrichissement des termes d'ontologie génique (GO) a souligné des mécanismes régulateurs spécifiques aux tissus, en particulier dans les voies liées au système nerveux, suggérant une régulation épigénétique complexe dans la fonction cérébrale à travers les espèces.

Fig 2. Identification des DMR et DhMR chez le yak et le bovin.

Conclusion

Cette étude utilise des techniques de RRBS et de RRBS oxydatif (oxRRBS) pour révéler des variations significatives dans 5mC et 5hmC présentes dans l'hypothalamus et d'autres régions cérébrales des yacks et des vaches. Cela inclut l'identification de régions méthylées de manière différentielle (DMRs) et de régions hydroxyméthylées de manière différentielle (DhMRs), dont la plupart se chevauchent. Par conséquent, des gènes exprimés de manière différentielle (DEGs) potentiellement régulés par les DMRs et les DhMRs, qui pourraient jouer des rôles cruciaux dans la régulation neuronale et la formation de myéline, ont été validés. En résumé, les résultats indiquent que la régulation épigénétique médiée par 5mC et 5hmC pourrait avoir un impact considérable sur le développement et les fonctions biologiques de l'hypothalamus, contribuant possiblement à l'amélioration de l'adaptabilité physiologique dans des conditions d'altitude élevée.

Référence:

1. Chai Z, Wu Z, Ji Q, et al. Des changements de méthylation et d'hydroxyméthylation de l'ADN à l'échelle du génome ont révélé la régulation épigénétique de la neuromodulation et de la myélinisation dans l'hypothalamus du yak. Frontières en Génétique, 2021, 12 : 592135.