Séquençage de criblage CRISPR

Introduction au séquençage des écrans CRISPR

Le criblage CRISPR efficace commence par une bibliothèque soigneusement conçue d'ARN guides simples (sgARN) ciblant des gènes ou des loci spécifiques. Le processus de conception implique la sélection de séquences appropriées, la synthèse des sgARN, puis leur clonage dans des vecteurs ou leur transcription en ARN pour la transfection cellulaire. Le criblage est ensuite réalisé en utilisant des méthodologies de sélection positives ou négatives. Après la transfection, les cellules sont triées physiquement en populations distinctes, suivies d'une amplification par PCR et d'un séquençage parallèle à haut débit. L'analyse des données identifie ensuite les sgARN et les gènes cibles correspondants d'intérêt.

L'utilisation de la technologie de criblage CRISPR pour des essais à haut débit facilite la génération de vastes bibliothèques cellulaires mutantes, qui peuvent être soumises à diverses conditions externes pour isoler des sous-ensembles de cellules mutantes. Séquençage à haut débit et les analyses de bioinformatique éclaircissent davantage les relations entre les phénotypes et les génotypes. Ce criblage à haut débit basé sur CRISPR/Cas9 offre des avantages significatifs par rapport aux techniques de criblage par interférence ARN (RNAi), notamment en surmontant les problèmes liés à la faible efficacité de transfection et à la capacité limitée de supprimer l'expression génique au niveau de l'ARNm.

À l'ère de la médecine de précision, le criblage CRISPR possède une valeur scientifique énorme et offre un potentiel vaste pour les applications de recherche. Cette méthode fournit une approche robuste, simple et programmable pour l'édition génétique à grande échelle—souvent appelée édition génétique à l'échelle du génome ou à haut débit—qui a démontré une efficacité substantielle, en particulier dans la recherche sur les mammifères.

Pour répondre aux besoins émergents des communautés de recherche, CD Genomics a développé une stratégie abordable, fiable et à haut débit pour le séquençage CRISPR Screen en s'appuyant sur le séquençage de nouvelle génération basé sur des amplicons. Notre service de séquençage CRISPR Screen peut vous fournir des informations directes et détaillées sur l'analyse des sgRNA et des gènes ciblés, ainsi que sur l'analyse d'enrichissement fonctionnel, afin d'aider les chercheurs à étudier les fonctions des gènes de manière à haut débit.

Figure 1. Vue d'ensemble du criblage CRISPR.

Avantages de notre service de séquençage CRISPR Screen

• Dépistage efficace : Il modifie plusieurs gènes simultanément, permettant un dépistage et une évaluation efficaces des fonctions génétiques.
• Évaluation complète : Fournit une approche systématique pour évaluer les fonctions des gènes au sein des cellules ou des organismes.
• Modifications génétiques précises : Cible des zones génomiques spécifiques pour réaliser des modifications génétiques précises telles que des knockouts ou des mutations.
• Interprétation rapide des données : Utilise une technologie de séquençage avancée pour une analyse des données rapide et précise.
• Applications polyvalentes : largement utilisées pour découvrir des cibles médicamenteuses, établir des modèles de maladies et faire progresser le développement thérapeutique.
• Processus rationalisés : Améliore l'efficacité et réduit les coûts par rapport aux méthodes conventionnelles, accélérant ainsi les efforts de recherche.
• Une flexibilité de multiplexage étendue et un séquençage à haut débit permettent de quantifier et de comparer les fréquences des sgRNAs.
• Coût-efficace et niveaux de détection très sensibles sans biais.
• Pas besoin d'étapes de clonage laborieuses et chronophages.
• Support dédié de scientifiques spécialisés au niveau doctorat.

Applications du séquençage CRISPR Screen

• Études de Fonction des Gènes : Le séquençage de criblage CRISPR permet aux chercheurs d'explorer systématiquement les fonctions des gènes dans les cellules ou les organismes, en particulier leurs rôles dans des processus biologiques complexes et le développement de maladies.
• Découverte de cibles médicamenteuses : Grâce à un dépistage à grande échelle et à l'analyse des modifications génomiques, des cibles médicamenteuses potentielles peuvent être découvertes et évaluées pour leur rôle dans le traitement des maladies.
• Établissement de modèles de maladie : Sur la base des résultats de séquençage de criblage CRISPR, des modèles de maladie plus précis peuvent être établis pour étudier les mécanismes de la maladie et tester des approches thérapeutiques.

Flux de travail de séquençage de criblage CRISPR

Notre équipe d'experts hautement expérimentés exécute la gestion de la qualité en suivant chaque procédure pour garantir des résultats complets et précis. Notre flux de travail de séquençage CRISPR Screen est décrit ci-dessous, y compris l'isolement de l'ADN, les expériences de PCR, le séquençage et l'analyse bioinformatique. Notre séquençage CRISPR Screen peut également aider les chercheurs à identifier quels knockouts de gènes ont produit des phénotypes pertinents pour le Screen.

Spécifications de service

	Exigences d'échantillon Types d'échantillons : cellules ou échantillons d'ADN après sélection positive/négative Échantillon d'ADN : ~1,5 μg (concentration ≥ 30 ng/μl ; OD260/280 = 1,8~2,0) Échantillon cellulaire : 5×106 cellules Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégie de séquençage Plateformes Illumina HiSeq Paired-end 150 pb ou 300 pb Analyse des métriques de qualité de séquençage
	Analyse bioinformatique Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Contrôle qualité des données brutes Alignement de référence analyse de l'abondance des sgRNA Analyse différentielle des abondances des sgRNAs Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont uniquement à titre de référence. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse de données
• Détails dans le séquençage de l'écran CRISPR pour votre rédaction (personnalisation)

CD Genomics propose des services pour identifier les séquences sgRNA et les gènes cibles d'intérêt, suivis d'un séquençage profond, à des prix très compétitifs. Nos capacités permettent le séquençage simultané de centaines d'échantillons. Nous utilisons l'outil MAGeCK pour l'analyse de l'abondance des sgRNA et de l'expression différentielle entre les groupes. Si vous avez des exigences ou des questions supplémentaires, n'hésitez pas à nous contacter.

Références

1. Ella H, et al.Écrans génétiques et génomique fonctionnelle utilisant la technologie CRISPR-Cas9. Journal FEBS, 2015, 1383-1393.
2. Zhou Y, et al.Dépistage à haut débit d'une bibliothèque CRISPR/Cas9 pour la génomique fonctionnelle dans des cellules humaines. Nature, 2014, 509(2):487-491.

Des résultats partiels sont affichés ci-dessous :

1. Comment concevoir des bibliothèques de sgRNA pour des séquences de génome entier ou de génome partiel ?

La conception de bibliothèques de sgRNA pour le séquençage de génomes entiers ou partiels est un aspect crucial de l'utilisation efficace de la technologie CRISPR-SCREEN. Pour atteindre une efficacité d'édition élevée, minimiser les effets hors cible et garantir des mutations de décalage de cadre lors de l'inactivation des gènes, il est nécessaire d'évaluer de manière exhaustive plusieurs facteurs. Les considérations clés suivantes sont essentielles pour une conception optimale de sgRNA :

• Analyse du contenu en GC ;
• Sélection des positions de coupe ;
• Analyse des structures secondaires dans la séquence ;
• Évaluation de la spécificité des gRNA ;
• Éviter les séquences dans le gRNA (hors PAM) comportant quatre nucléotides T consécutifs ou plus dans la séquence cible ;
• Prédiction du score d'efficacité de la séquence gRNA ;
• Évaluation des effets hors cible potentiels et des discordances dans la séquence du gRNA.

2. Quels types de dépistages CRISPR peuvent être réalisés ?

• Écrans de sélection positiveIdentifier des gènes dont la disruption confère un avantage de croissance ou une résistance dans des conditions spécifiques.
• Écrans de sélection négativeIdentifier des gènes dont la disruption entraîne une perte de viabilité ou une sensibilité à des traitements spécifiques.
• Écrans regroupésUtilisez une population mixte de cellules transduites avec différents sgARN, permettant une analyse à haut débit.
• Écrans disposésChaque puits ou échantillon contient des cellules transduites avec un seul sgRNA, facilitant une analyse phénotypique détaillée.

3. Comment garantissez-vous des effets hors cible minimaux dans le séquençage CRISPR Screen ?

• Conception de sgRNAUtilisez des outils de bioinformatique pour concevoir des sgRNAs avec une haute spécificité pour les sites cibles et un minimum de sites hors cible prédits.
• ValidationRéaliser des expériences pour valider la spécificité des sgRNAs sélectionnés.
• Variantes de Cas9 à haute fidélitéUtilisez des variantes de Cas9 conçues pour réduire l'activité hors cible.

4. Comment analysez-vous les données du séquençage de l'écran CRISPR ?

L'analyse des données implique plusieurs étapes :

• Contrôle de la qualité des données de séquençageVérifiez la qualité des lectures de séquençage.
• Cartographie des lecturesAlignez les lectures sur le génome de référence pour identifier les séquences sgRNA.
• Identification des frappesDéterminez quels sgRNAs sont significativement enrichis ou appauvris par rapport aux témoins.
• Analyse fonctionnelleInterprétez la signification biologique des résultats identifiés, en utilisant souvent des outils de bioinformatique pour analyser les voies et interactions des gènes.

Un criblage de bibliothèque CRISPR/Cas9 à l'échelle du génome identifie PCMT1 comme un moteur critique de la métastase du cancer de l'ovaire.

Journal : Journal de la recherche expérimentale et clinique sur le cancer

Facteur d'impact : 12,568

Publié : 15 janvier 2022

Contexte

La métastase du cancer implique la migration et l'invasion des cellules tumorales, nécessitant une résistance à l'anoïkis. La matrice extracellulaire (MEC) est cruciale dans ce processus. En utilisant le criblage par knockout CRISPR/Cas9 dans des cellules de cancer de l'ovaire, PCMT1 a été identifié comme essentiel pour la résistance à l'anoïkis. PCMT1 interagit avec la protéine de la MEC LAMB3, activant des voies qui aident à l'adhésion et à l'invasion des cellules. L'élévation de PCMT1 dans les métastases met en évidence son potentiel en tant que cible thérapeutique.

Matériaux et Méthodes

Résultats

Un criblage CRISPR/Cas9 à l'échelle du génome dans des cellules de cancer de l'ovaire a identifié des gènes liés à la résistance à l'anoïkis. En utilisant la bibliothèque GeCKO v2, les cellules SKOV3 ont été criblées dans des conditions standard et d'ultra-faible adhérence. Le séquençage a révélé 286 gènes issus de la sélection négative et 122 de la sélection positive. Les voies clés comprenaient la réparation des protéines et l'initiation de la traduction, avec des gènes connus de résistance à l'anoïkis tels que RAN, KIF11 et ECT2 également identifiés.

Fig 1. Un criblage CRISPR à l'échelle du génome en pool dans un modèle de métastase du cancer de l'ovaire.

IP-MS a identifié que PCMT1 interagit avec LAMB3. Parmi les 39 protéines interagissant avec PCMT1 à haute confiance, LAMB3 était lié aux traits de métastase cellulaire. Des études fonctionnelles ont confirmé l'interaction entre PCMT1 et LAMB3, et le silençage de LAMB3 a réduit la formation de sphéroïdes cellulaires et la migration dans des cellules cancéreuses ovariennes surexprimant PCMT1, indiquant que LAMB3 est une cible en aval de PCMT1 dans la métastase du cancer.

Fig 2. La MS-IP indique que PCMT1 interagit avec LAMB3.

Conclusion

En résumé, cette étude identifie PCMT1 comme un moteur clé de la résistance à l'anoïkis, améliorant l'adhésion cellulaire, la migration et l'invasion. PCMT1 régule à la hausse le signalement FAK-Src, favorise la métastase et est corrélé au stade métastatique dans le cancer de l'ovaire. Un taux élevé de PCMT1 dans le sérum peut indiquer un potentiel métastatique, et cibler PCMT1 avec des anticorps montre des promesses en tant que stratégie thérapeutique pour la métastase du cancer de l'ovaire.

Référence

1. Zhang J, Li Y, Liu H, et al. Un dépistage de bibliothèque CRISPR/Cas9 à l'échelle du génome identifie PCMT1 comme un moteur critique de la métastase du cancer de l'ovaire. Journal d'Expérimentation & Recherche Clinique sur le Cancer, 2022, 41(1) : 24.