Séquençage du génome complet microbien

Avec des décennies d'expérience dans les domaines de séquençage du génomeCD Genomics s'engage à fournir un service de séquençage de génome entier microbien précis et abordable. Nous combinons à la fois Illumina (lectures courtes) et Plateformes PacBio (lectures longues) pour le re-séquencement microbien et génome complet de novo séquençageNotre forte expertise est renforcée par des stratégies de séquençage flexibles et professionnelles. bioinformatique pipelines.

L'introduction du séquençage de génomes entiers de microbes

Il existe de grandes différences entre les microorganismes et les eucaryotes supérieurs. En plus de leur génome plus petit, la plupart des bactéries possèdent un seul chromosome circulaire (parfois plusieurs chromosomes, des chromosomes linéaires ou des combinaisons de chromosomes linéaires et circulaires). Les gènes dans les génomes microbiaux sont généralement un seul segment continu d'ADN, bien que plusieurs types d'introns existent rarement dans le génome bactérien. La présence de plasmides dans le génome bactérien est une autre différence majeure. Les plasmides, l'ADN circulaire extra-chromosomique, peuvent être transférés par transfert horizontal d'ADN, facilitant l'évolution rapide des microorganismes. Un virus est un organisme infectieux non cellulaire composé d'un noyau d'ADN ou d'ARN entouré d'une coque protéique.

Le séquençage du génome entier des microbes génère une quantité énorme de données permettant une évaluation complète de toutes les caractéristiques génétiques d'un microorganisme isolé. Séquençage shotgun la stratégie est une méthode principale de séquençage du génome entier des micro-organismes. Les étapes de séquençage ne nécessitent pas de cartographie et de clonage laborieux, ce qui permet d'économiser un temps et de l'argent considérables. De plus, séquençage à haut débit nous permet de séquencer des centaines de bactéries ou de virus en même temps grâce à la puissance du multiplexage. Dans le séquençage de génome entier par tir de fusil, le génome entier est découpé en petits fragments pour le séquençage, puis assemblé par des méthodes computationnelles basées sur les régions chevauchantes, ne nécessitant donc pas de génome de référence. Technologie SMRT de PacBio nous permet de fournir bactérien de novo séquençage du génome entier et fongique de novo séquençage du génome entier qui génèrent des séquences plus précises et continues.

Le séquençage du génome entier des micro-organismes est crucial pour une identification microbienne précise, la génération de génomes de référence complets.de novo séquençage), études génomiques comparatives (re-séquençage) et exploitation génomique. Les études génomiques comparatives peuvent identifier des variations génétiques individuelles et des variations structurelles à grande échelle au sein d'une population pour laquelle un génome de référence est disponible. Les caractéristiques évolutives et les relations phylogénétiques peuvent donc en être déduites. Le séquençage du génome entier des micro-organismes offre la possibilité de découvrir et d'annoter des gènes. Après que plusieurs gènes ont été expliqués, de nouvelles voies biochimiques susceptibles d'être bénéfiques pour la médecine et la biotechnologie seront probablement identifiées.

Avantages du séquençage du génome entier microbien

• Une approche efficace en termes de temps et rentable
• Applications variées : de novo séquençage, annotations génétiques, études génomiques comparatives, études évolutives des micro-organismes, etc.
• Découverte et développement de médicaments : évaluer la contribution de l'ADN à la pathogénie et comprendre le rôle des éléments mobiles dans la résistance aux médicaments et la transmission.

Application du séquençage du génome entier microbien

• Identification des pathogènes : Détermination rapide et précise de l'identité des pathogènes par comparaison avec des bases de données génomiques établies, facilitant les diagnostics cliniques et les enquêtes épidémiologiques.
• Surveillance de la résistance aux antibiotiques : Identification et analyse des gènes de résistance pour dévoiler les mécanismes de résistance microbienne, fournissant des orientations pour la gestion clinique et la surveillance de la diffusion de la résistance.
• Comparaisons génomiques : Analyse comparative des génomes à travers différentes souches pour délimiter les variations génétiques, aidant à la compréhension de l'évolution microbienne, de la diversité génétique et des dynamiques de population.
• Génomique fonctionnelle : Découverte de gènes fonctionnels et de voies métaboliques au sein des génomes pour déchiffrer les traits biologiques et les rôles écologiques des micro-organismes.
• Surveillance de la pollution environnementale : Analyse de séquençage des communautés microbiennes environnementales pour surveiller les effets des polluants et les réponses microbiennes, évaluant l'intégrité environnementale.
• Découverte de médicaments : Exploitation des données génomiques microbiennes pour l'exploration de nouvelles cibles médicamenteuses et de produits naturels, accélérant développement de médicaments et les efforts de découverte.
• Biosécurité et Contrôle : Surveillance vigilante et détection préventive des menaces potentielles de bioterrorisme ou de biosécurité, garantissant la sécurité publique et nationale.
• Surveillance de la sécurité alimentaire : Surveillance et détection de la contamination microbienne dans les aliments pour maintenir les normes de sécurité alimentaire et protéger la santé des consommateurs.

Flux de travail de séquençage du génome entier microbien

CD Genomics peut offrir des services de séquençage génomique intégrés pour les bactéries, les levures, les champignons, les phages et les virus. Notre équipe d'experts hautement expérimentés applique une gestion de haute qualité à chaque étape pour garantir des résultats fiables et impartiaux avec le système Illumina HiSeq et/ou PacBio SMRT. Le flux de travail général pour le séquençage du génome entier des micro-organismes est décrit ci-dessous.

Spécification de service

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage du génome entier microbien pour votre rédaction (personnalisation)

CD Genomics propose un service complet de séquençage de génome entier microbien, incluant la standardisation des échantillons, la construction de bibliothèques, le séquençage approfondi, le contrôle de qualité des données brutes, l'assemblage du génome et l'analyse bioinformatique en aval. Nous pouvons adapter ce processus à vos intérêts de recherche. Si vous avez des exigences supplémentaires ou des questions, n'hésitez pas à nous contacter.

Référence :

1. Fraser C. M., et al.Séquençage du génome microbien. Nature, 2000, 406(6797) : 799.

Résultats de la démo

Des résultats partiels sont présentés ci-dessous :

FAQ sur le séquençage du génome complet microbien

1. Comment préparer des échantillons ?

Vous pouvez soumettre des micro-organismes cultivés purs ou des échantillons d'ADN génomique extrait pour le séquençage du génome entier microbien. Pour les micro-organismes cultivés, les cellules purifiées doivent être centrifugées dans un tube de 1,5 mL ne contenant pas de milieu. Nous aurons besoin d'un minimum de 1 million de cellules, et plus vous pouvez en fournir, mieux c'est. Pour les échantillons d'ADN génomique, la quantité recommandée pour la soumission est de 2 µg ou plus avec une concentration supérieure à 20 ng/µl. Le rapport OD260/OD280 doit être compris entre 1,8 et 2,0. Les échantillons doivent être expédiés congelés sur de la glace carbonique.

Échantillons de fèces : conservez les échantillons de fèces en dessous de -80℃. Empiriquement, des fèces fraîches contribuent à l'isolement d'ADN de préférence.

2. Comment augmenter la précision de l'assemblage du génome lors de l'utilisation du système PacBio SMRT ?

Le taux d'erreur de lecture brute de PacBio SMRT système est substantiellement plus élevé à environ 14 % par rapport au taux d'erreur de 0,1 à 1 % des autres systèmes de séquençage de pointe. Cependant, le modèle d'erreur est stochastique, donc des lectures de très haute qualité sur toutes les bases peuvent être obtenues dans la séquence consensus. De plus, le Séquençage SMRT le système est capable de séquencer des régions à forte teneur en GC, ce qui conduit à une couverture du génome beaucoup plus uniforme.

Il existe trois façons d'assurer l'exactitude de l'assemblage du génome : (i) avant l'assemblage, corriger les séquences dans la séquence consensus ; (ii) corriger les résultats de l'assemblage des séquences en utilisant les données de séquençage ; (iii) corriger les résultats de l'assemblage des séquences en utilisant des données de haute qualité. séquençage de nouvelle génération données. Après les trois corrections, la précision de l'assemblage final de la séquence peut atteindre 99,99 %.

3. Comment atteindre un écart zéro ?

Actuellement, la carte de séquence complète de plus de 90 % des souches bactériennes peut être construite en utilisant une combinaison d'Illumina HiSeq et PacBio SMRT systèmes. La carte de séquence complète des 10 % restants des souches bactériennes peut être obtenue avec Séquençage de Sanger données.

4. Peut-on réaliser un assemblage complet du génome même dans les régions de haute ou basse teneur en GC, ainsi que dans les séquences répétitives ?

Le système Pacbio RS II peut surmonter les défis précédents. CD Genomics a réalisé des centaines de cas d'assemblage de génomes bactériens sans lacunes.

5. Quels sont les avantages du séquençage du génome entier des microbes dans la pratique clinique ?

Séquençage du génome entier a été un outil de routine pour la microbiologie clinique. Il peut réduire le temps de diagnostic et améliorer le contrôle et le traitement. Il décrit et améliore notre compréhension de l'évolution microbienne, des épidémies et des événements de transmission. Les procédures conventionnelles pour séquençage du génome entier incluent souvent plusieurs étapes de culture et d'incubation suivies de l'identification des espèces, des tests de sensibilité et du typage, ce qui peut prendre plusieurs semaines. Un certain nombre d'autres approches (comme les méthodes basées sur la PCR) sont peu coûteuses et rapides, mais limitées en termes de sensibilité. Bien que le séquençage du génome entier soit encore trop coûteux, le prix et le délai de traitement devraient probablement diminuer en raison de la concurrence entre les plateformes de séquençage.

Référence :

1. Hasman H., et al.Séquençage génomique complet rapide pour la détection et la caractérisation des micro-organismes directement à partir d'échantillons cliniques. Journal de microbiologie clinique, 2013 : JCM. 02452-13.

Études de cas sur le séquençage du génome entier microbien

Le séquençage du génome de la souche hybride interspécifique ISA1307, dérivée de Zygosaccharomyces bailii, hautement tolérante à l'acide acétique, isolée d'une usine de vin effervescent.

Journal : Recherche sur l'ADN
Facteur d'impact : 5,404
Publié : juin 2014

Contexte

Ce travail décrit le séquençage du génome et l'annotation de la souche de levure ISA1307, isolée d'une usine de production de vin mousseux. Cette souche, anciennement considérée comme la Zygosaccharomyces bailii espèce, est un hybride interspécifique entre Z. bailii et une espèce étroitement apparentée.

Méthodes

Résultats

1. La souche hybride ISA1307

La comparaison des séquences des gènes de ménage (y compris RPB1, RPB2, EF1-α et β-tubuline) a révélé que la souche ISA1307 est un hybride interspécifique entre Z. bailii et une espèce étroitement apparentée.

2. Assemblage du génome

La quantification par cytométrie en flux a révélé que la taille estimée de l'ISA1307 est d'environ 22,0 Mb, avec S. cerevisiae BY4741 et BY4743 utilisées comme courbe de calibration (Figure 1A). Un profilage PFGE de l'ISA1307 a été effectué, et 13 bandes chromosomiques ont été observées, avec des tailles allant de 733 à 2120 Mb (Figure 1B).

Figure 1. Estimation de la taille du génome et caryotypage de la souche ISA1307. (A) Histogramme d'analyse cellulaire représentatif. (B) Caryotype de la souche de référence Z. bailii ATCC58445 (couloir 2) et de la souche ISA1307 (couloir 1).

Le génome reconstruit final de la souche ISA1307 est réparti sur 154 échafaudages. La somme de la taille de tous les échafaudages est de 21241152 pb, ce qui correspond à 96 % de la taille du génome estimée par cytométrie en flux (Tableau 1).

3. Annotation

Un total de 9 925 gènes sont prévus d'être codés par la souche ISA1307, y compris 4 385 gènes dupliqués et 1 155 gènes en copie unique. Les fonctions prédites impliquent "le métabolisme et la génération d'énergie", "le repliement, la modification et le ciblage des protéines", et "la biogenèse des composants cellulaires". Les auteurs ont ensuite étudié les gènes et les protéines de l'ISA1307 impliqués dans les fonctions ci-dessus.

Figure 2. Classes fonctionnelles des gènes prédits comme étant codés par le génome de la souche ISA1307.

Conclusion

En conséquence, un ensemble d'allèles de référence spécifiques a été établi, en utilisant la technologie de séquençage de troisième génération, qui offre une exploration longitudinale approfondie des loci génétiques s'étendant sur plusieurs milliers de paires de bases. Cette nouvelle technique complète les techniques de séquençage de deuxième génération ou de lecture courte, s'avérant être d'une importance cruciale pour déchiffrer des allèles nouveaux, rares et nuls.

Référence :

1. Mira N. P., et al.La séquence génomique de la souche hybride interspécifique ISA1307, dérivée de Zygosaccharomyces bailii, hautement tolérante à l'acide acétique, isolée d'une usine de vin mousseux. Recherche sur l'ADN, 2014, 21(3) : 299-313.