Séquençage de l'ADN bisulfite à l'échelle du génome entier (WGBS)

En tant que fournisseur de services NGS de premier plan, CD Genomics propose un portefeuille intégré de services de séquençage de méthylationLe séquençage bisulfite de tout le génome (WGBS) est une stratégie efficace et fiable pour identifier les cytosines méthylées individuellement à l'échelle du génome. Avec plus de 10 ans d'expérience et à la pointe de la technologie. séquençage de nouvelle génération plateformes, nous pouvons tout à fait répondre à vos exigences de projet et à vos budgets dans l'exploration du méthylome.

Qu'est-ce que le séquençage bisulfite de tout le génome ?

Dans la biologie des mammifères, la 5-méthylcytosine implique un lien covalent entre un groupe méthyle et la position carbone 5' de la cytosine, conférant ainsi des caractéristiques capacitives supplémentaires pour la transduction du signal et la fonctionnalité régulatrice. En tant que l'une des modifications épigénétiques prédominantes, la 5-méthylcytosine joue un rôle essentiel dans de nombreux processus biologiques, y compris le silençage des gènes, la répression des transposons, l'inhibition des séquences répétées, l'imprégnation génomique et l'inactivation du chromosome X. La détection et la quantification de la méthylation sont fondamentalement critiques pour comprendre l'expression génique et d'autres processus soumis à la régulation épigénétique.

La méthylation de l'ADN constitue une partie vitale de épigénétique, jouant un rôle essentiel dans le maintien des fonctions cellulaires normales, l'imprégnation génétique, le développement embryonnaire et le début de la tumorigenèse humaine. Le WGBS utilisant une conversion au bisulfite des cytosines non modifiées en uraciles dans l'ADN génomique, permet de générer un profil de méthylation complet. En réalisant un séquençage à haut débit de l'ADN converti et en le comparant à un génome de référence, la méthode WGBS permet une analyse à l'échelle du génome des métriques de méthylation avec une résolution à base unique, offrant une grande précision. Son application plus large s'étend de l'exploration des mécanismes fondamentaux de la différenciation cellulaire et du développement des tissus à l'avancement des domaines de l'élevage agricole, de la santé humaine et du traitement des maladies.

WGBS est la méthode de choix pour établir des cartes complètes de la méthylation de l'ADN au niveau de la base individuelle. Cette approche, souvent qualifiée de "norme de référence" pour le séquençage de méthylation, se distingue par son débit élevé, son efficacité temporelle, sa résolution à une seule base et sa couverture étendue.

Principe de la WGBS

Le principe de la WGBS repose sur le traitement avec du bisulfite lourd pour convertir les cytosines non méthylées du génome en uraciles, qui deviennent des thymines après amplification par PCR et peuvent ainsi être distinguées des cytosines méthylées. Associée à la technologie de séquençage à haut débit et à la comparaison de séquences de référence, la méthylation aux sites CpG/CHG/CHH peut être déterminée, ce qui la rend particulièrement adaptée à la construction de cartes de méthylation de l'ADN à résolution d'une seule base sur l'ensemble du génome. Pour des informations plus détaillées, veuillez vous référer à l'article, "Principes et flux de travail du séquençage bisulfite de l'ensemble du génome.

Avantages de la WGBS

• Adapté à la recherche sur les humains et la plupart des animaux et des plantes (avec des génomes de référence connus).
• Modèles de méthylation de l'ADN à résolution unique et hautement intégrés.
• Obtenez de manière maximale des informations complètes sur la méthylation du génome entier, en cartographiant avec précision les motifs de méthylation.
• Fournir des informations sur l'engagement des cellules génétiques et le reprogrammation, ainsi que sur la régulation des gènes.
• Identification de nouvelles marques épigénétiques et de cibles de maladies.

Application de WGBS

• Régulation de l'expression génique
• Hétérogénéité épigénétique
• Environnement et épigénétique
• Développement embryonnaire
• Recherche sur les maladies
• Empreintes génétiques
• Recherche sur les tumeurs
• Recherche sur la stabilité du génome
• Recherche en biologie évolutive

Différentes techniques de détection de la méthylation de l'ADN

450K/850K

Cette technologie scanne et détecte environ 450K et 850K sites CpG importants connus dans le génome grâce au scan par puce. Elle présente une grande précision et une bonne répétabilité, mais elle est limitée aux échantillons humains et ne peut pas détecter de nouveaux sites CpG en dehors de la puce dans le génome.

MeDIP-seq

Séquençage par immunoprécipitation de l'ADN méthylé (MeDIP-seq) enrichit et séquence les régions subissant une méthylation, obtenant le statut de méthylation des régions les plus méthylées à travers tout le génome. Il manque de résolution à base unique et de quantification absolue des niveaux de méthylation, ne fournissant que des niveaux de méthylation relatifs. Il est adapté pour explorer le statut de méthylation à l'échelle du génome sans nécessiter de résolution à base unique.

WGBS

Cette technique peut détecter des sites CpG efficaces atteignant plus de 75 % de tous les sites CpG dans l'ensemble du génome, atteignant une résolution à une seule base. Elle est adaptée pour étudier de manière systématique et complète l'état de méthylation à l'échelle du génome.

RRBS

Séquençage bisulfite à représentation réduite (RRBS) détecte l'état de méthylation des régions riches en sites de type CG (principalement des régions régulatrices) dans le génome, avec une résolution à base unique et un rapport coût-efficacité élevé. Il est adapté pour étudier l'état de méthylation des régions régulatrices.

Cible-BS

Séquençage par bisulfite ciblé conçoit des amorces pour des fragments cibles, effectue l'amplification PCR après conversion BS, et construit enfin des bibliothèques pour le séquençage de nouvelle génération. La profondeur de séquençage des régions cibles peut atteindre de centaines à des dizaines de milliers, permettant une détection précise des niveaux de méthylation aux sites C dans les régions cibles. Cela est utilisé pour la vérification ultérieure de la méthylation des gènes cibles.

Microarray de méthylation de l'ADN

Le Service d'analyse de méthylation de l'ADN Illumina 935K est un outil sophistiqué conçu pour l'exploration de la méthylation de l'ADN. Le BeadChip Infinium MethylationEPIC v2.0 (935K) facilite l'examen à haut débit d'environ 935 000 sites CpG dispersés dans tout le génome humain. Cette version améliorée offre une couverture et une précision accrues, garantissant la conformité avec les bases de données génomiques les plus récentes. Les caractéristiques notables de cet appareil comprennent des capacités d'investigation du génome entier, une fiabilité confirmée et une large compatibilité avec diverses catégories d'échantillons, y compris les tissus fixés au formol et inclus dans la paraffine. Le service s'adresse spécifiquement à l'étude épigénétique complète, fournissant aux chercheurs les moyens de décoder les mécanismes sous-jacents des maladies et d'identifier des biomarqueurs potentiels.
L'Illumina Array de dépistage de méthylation 270K (MSA270K) représente une innovation de pointe conçue pour des examens de méthylation minutieux spécifiquement réalisés au sein de cohortes de maladies distinctes et d'évaluations de santé étendues. Englobant environ 270 000 loci de méthylation, cet outil offre une efficacité améliorée en permettant un débit de 48 échantillons par puce, ce qui constitue une augmentation sextuple par rapport à son prédécesseur. En permettant aux scientifiques de progresser dans des recherches exploratoires liées aux schémas phénotypiques des maladies, aux influences environnementales sur l'épigénétique et aux modifications de la méthylation liées au vieillissement, le MSA270K renforce considérablement notre compréhension de la méthylation de l'ADN et de ses effets conséquents sur la santé humaine et les conditions de maladie. Cela catalyse des changements de paradigme dans la compréhension fondamentale de notre blueprint génétique inné, ouvrant des avenues thérapeutiques potentielles pour l'avenir.

Flux de travail WGBS

Notre équipe d'experts hautement expérimentés et notre contrôle qualité rigoureux à chaque étape garantissent des résultats complets et précis. Avant le séquençage à haut débit, l'échantillon d'ADN est traité par conversion au bisulfite de cytosine, suivi d'un marquage aux extrémités 5' et 3', et de l'introduction des adaptateurs Illumina par amplification PCR.

Afin d'assurer l'exactitude et la fiabilité des données de séquençage, CD Genomics exécute méticuleusement chaque étape expérimentale, de l'échantillonnage de l'ADN à l'acquisition du rapport final de données, en passant par des évaluations de contrôle qualité rigoureuses. Cette approche globale garantit fondamentalement une production de données de haute qualité. Assurer des données de haute qualité est le prérequis fondamental pour des résultats précis, complets et crédibles. bioinformatique analyse.

Spécification de service

	Exigences et préparation des échantillons Sources d'échantillons comprenant des humains, des animaux, des plantes et des micro-organismes. ADN génomique (ADN ≥ 1 µg ; concentration ≥ 10 ng/µl ; OD260/280=1,8-2,0) Cellule≥1x106 Échantillons de tissu ≥50 mg Protocole de préparation d'échantillons comprenant probablement l'extraction de l'ADN génomique, la purification, la quantification, le contrôle de qualité, etc.
	Séquençage Plateformes HiSeq, paire de 150 pb Plus de 80 % des bases avec un score de qualité ≥Q30 Profondeur de séquençage > 20X
	Analyse de données Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Alignement par rapport au génome de référence Analyse de la profondeur de séquençage et de la couverture mC appelant Analyse du niveau de méthylation Tendances mondiales du méthylome Analyse de la densité de méthylation Analyse des régions différentiellement méthylées (DMRs) Analyse d'annotation et d'enrichissement DMR (GO/KEGG) Analyse de regroupement

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails dans WGBS pour votre écriture (personnalisation)

Bénéficiant des plateformes de séquençage de nouvelle génération à la pointe de la technologie et d'une riche expérience, nous vous garantissons des données de haute qualité et des analyses bioinformatiques intégrées. Si vous êtes intéressé par ce que CD Genomics peut réaliser avec le séquençage bisulfite de génome entier, n'hésitez pas à nous contacter. Nous sommes impatients de faire avancer votre projet.

Références :

1. Huang, K., & Fan, G. La méthylation de l'ADN dans la différenciation cellulaire et le reprogrammation : une nouvelle perspective systématique. Médecine régénérative, 2010, 5(4), 531-544.
2. Beck D, Ben Maamar M, Skinner M K. Comparaison des méthodes d'analyse de la densité des CpG et de la méthylation de l'ADN (MeDIP, RRBS et WGBS) à l'échelle du génome. Épigénétique, 2022, 17(5) : 518-530.
3. Abante J, Fang Y, Feinberg A P, et al. Détection de la méthylation de l'ADN spécifique à l'allèle dépendante du haplotype dans les données de séquençage du génome entier. Communications Nature, 2020, 11(1) : 5238.
4. Suzuki M, Liao W, Wos F, et al. Séquençage du génome entier par bisulfite avec une précision et un coût améliorés. Recherche génomique, 2018, 28(9) : 1364-1371.

1. Quelles espèces sont adaptées au séquençage bisulfite de génome entier ?

Les espèces soumises au séquençage du génome par bisulfite doivent répondre aux trois conditions suivantes :

a. Eucaryotes.
b. Son génome de référence a été assemblé au moins au niveau du squelette.
c. Annotations génomiques relativement complètes.

2. Quels sont les principaux contenus de l'analyse bioinformatique avancée dans le WGBS ?

L'analyse de la corrélation entre les niveaux de méthylation et les niveaux de transcription constitue un élément majeur de l'analyse bioinformatique avancée dans le séquençage de méthylation du génome entier. Elle englobe principalement quatre aspects :

1. Niveaux de méthylation des gènes différemment exprimés.
2. Niveaux de méthylation des éléments transposables différemment exprimés.
3. Relation entre les modifications de méthylation et la régulation de l'expression.
4. Analyse de l'expression des gènes méthylés et non méthylés.

3. Quels sont les avantages du WGBS par rapport à d'autres méthodes de séquençage de méthylation ?

Dans le domaine du séquençage de la méthylation de l'ADN, les principales méthodologies actuelles incluent le séquençage bisulfite de l'ensemble du génome (WGBS), Immunoprécipitation de l'ADN méthylé (MeDIP)et Séquençage bisulfite à représentation réduite (RRBS)WGBS présente l'avantage de permettre l'évaluation du statut de méthylation à presque tous les sites CpG. Cette évaluation peut s'étendre à des zones de faible densité de CpG, y compris les "déserts géniques" intergéniques, les domaines partiellement méthylés et les éléments régulateurs distants. De plus, WGBS peut révéler les niveaux absolus de méthylation de l'ADN et le contexte de séquence de méthylation. Cependant, il convient de noter que MeDIP ne peut pas atteindre une résolution de méthylation à une seule base, et que RRBS sélectionne généralement des zones avec un degré de méthylation plus élevé pour l'analyse, ce qui empêche d'obtenir le statut de méthylation au niveau du gène entier.

4. Quelles sont les limitations du WGBS ?

1. Cette méthode ne peut détecter que 5mC ou 4mC et ne peut pas détecter 6mA.
2. Le traitement avec du bisulfite entraîne une fragmentation significative de l'ADN, ce qui peut affecter l'amplification.
3. La conversion des cytosines non méthylées en uraciles lors du traitement au bisulfite augmente la complexité de la préparation des bibliothèques. Une conversion incomplète peut également introduire un biais dans les résultats.
4. La méthode n'est pas capable de distinguer efficacement entre 5mC et 5hmC.

Références :

1. Beck D, Ben Maamar M, Skinner M K. Comparaison des méthodes d'analyse de la densité de CpG et de la méthylation de l'ADN à l'échelle du génome (MeDIP, RRBS et WGBS). Épigénétique, 2022, 17(5) : 518-530.
2. Suzuki M, Liao W, Wos F, et al. Séquençage bisulfite de tout le génome avec une précision et un coût améliorés. Recherche génomique, 2018, 28(9) : 1364-1371.

Des motifs de méthylation de l'ADN divergents associés à l'expression génique chez des cultivars de riz présentant des réponses contrastées au stress de sécheresse et de salinité.

Journal : Scientific Reports
Facteur d'impact : 4,259
Publié : 09 octobre 2015

Contexte

La méthylation de l'ADN joue un rôle central dans la régulation de l'activité des gènes et de la structure de la chromatine en réponse aux conditions environnementales. La compréhension de la méthylation de l'ADN à l'échelle du génome offre des perspectives sur les mécanismes régulateurs de la réponse/adaptation au stress abiotiques.

Matériaux : Trois cultivars de riz (Oryza sativa), IR64 (sensible à la sécheresse et à la salinité), Pokkali (tolérant à la salinité) et Nagina 22 (tolérant à la sécheresse).

Méthodes

Résultats

Les chercheurs ont étudié les différences entre les trois cultivars en matière de motifs de méthylation de l'ADN, de DMR (Régions différemment méthylées) et d'expression génique, et ont en outre examiné les corrélations sous-jacentes.

1. La méthylation différentielle est couplée à l'expression génique différentielle dans différentes cultivars.

En comparaison avec tous les gènes, ceux situés à proximité des régions différentielles de méthylation (DMRs) hautement méthylées montrent un niveau d'abondance des transcrits plus faible, ce qui indique une régulation à la baisse. En revanche, les gènes proches des DMRs faiblement méthylées présentent des niveaux d'abondance des transcrits similaires ou légèrement plus élevés, suggérant une régulation à la hausse. Pour les DMRs, la méthylation de l'ADN semble également corréler avec le statut on/off de l'expression génique, comme en témoignent 14,5 % dans N22/IR64 et 7,2 % dans PK/IR64.

Figure 1. Relation entre la méthylation différentielle et l'abondance des transcrits des gènes codant des protéines.

2. Méthylation différentielle des gènes associés à la réponse au stress et régulation épigénétique de l'expression génique.

Le niveau de méthylation différentielle et l'expression génique différentielle correspondante des gènes de riz dans N22/IR64 et PK/IR64 sont montrés dans la Fig. (a) ci-dessous. L'analyse GO des gènes associés aux DMR dans N22/IR64 et PK/IR64 a révélé un enrichissement significatif de gènes participant à la réponse au stress.

Figure 2. Méthylation différentielle, abondance des transcrits et enrichissement GO des gènes codant des protéines.

Le statut de méthylation des éléments transposables est corrélé avec la transcription des gènes codant des protéines proximaux.

L'enrichissement des TEs était substantiellement plus élevé pour les DEGs associés aux DMR par rapport aux non-DEGs pour N22/IR64 (valeur P 1,49e-05) et PK/IR64 (valeur P 5,26e-05) (a). Des différences significativement plus élevées dans le niveau de méthylation des DMR sont associées aux TEs par rapport aux gènes codant des protéines pour PK/IR64 (b).

Figure 3. Corrélation entre l'expression différentielle et le niveau de fréquence/méthylation des TEs.

Conclusion

Les résultats suggèrent le rôle potentiel des motifs de méthylation de l'ADN spécifiques aux cultivars comme un mécanisme régulateur crucial pour la détection et la réponse aux conditions de stress via la modulation de l'expression des gènes réactifs au stress. Les investigations suggèrent que la variabilité de la tolérance à la sécheresse ou à la salinité dans le germoplasme du riz dépend de l'étendue et des motifs de méthylation de l'ADN. Et les preuves suggèrent que la méthylation de l'ADN joue un rôle important dans la réponse au stress abiotiques en régulant l'expression d'un ensemble de gènes réactifs au stress dans le riz, principalement via la méthylation ou la déméthylation des éléments transposables proximaux.

Référence :

1. Garg R, Chevala V V S N, Shankar R, et al. Modèles de méthylation de l'ADN divergents associés à l'expression génique chez des cultivars de riz avec des réponses contrastées au stress de sécheresse et de salinité. Rapports scientifiques, 2015, 5.