MeDIP‑Seq / hMeDIP‑Seq (Profilage de la méthylation et de l'hydroxyméthylation de l'ADN)

CD Genomics propose le MeDIP-seq pour le profilage de la méthylation à l'échelle du génome et le hMeDIP-seq pour capturer sélectivement la 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), permettant une analyse parallèle de multiples modifications de la cytosine.

Introduction au MeDIP seq et hMeDIP seq

La méthylation de l'ADN fait référence à l'entretien post-réplicatif ou à l'ajout de novo d'un groupe méthyle à la position carbone-5 de l'anneau pyrimidine de la cytosine par des ADN méthyltransférases. Chez les mammifères, la méthylation de l'ADN se produit généralement dans des contextes CG (mCG) et non-CG (mCHG ou mCHH, collectivement appelés mC). Le mCG à lui seul représente environ 60 à 80 % de tous les dinucléotides CG. En plus de la 5-méthylcytosine (5mC), plusieurs modifications de la cytosine ont été identifiées, y compris la 5-hydroxyméthylcytosine (5hmC), la 5-formylcytosine et la 5-carboxylcytosine. Parmi elles, la 5hmC est structurellement similaire à la 5mC mais beaucoup moins abondante, et elle est générée par l'oxydation de la 5mC par la famille TET de dioxygénases.

La méthylation et l'hydroxyméthylation de l'ADN sont toutes deux des marques épigénétiques cruciales impliquées dans la régulation des gènes, le développement embryonnaire, la différenciation cellulaire et la stabilité du génome. L'analyse à l'échelle du génome des 5mC et 5hmC fournit des informations essentielles sur la dynamique épigénétique, en particulier dans les études sur le développement et la réponse au stress.

MeDIP-seq associe l'immunoprécipitation avec séquençage à haut débit pour enrichir et profiler 5mC à travers le génome. Il utilise des anticorps anti-5mC pour capturer sélectivement des fragments d'ADN contenant des cytosines méthylées (dans les contextes mCG et mCH). Ces fragments enrichis sont séquencés, et leur distribution de lectures peut être utilisée pour estimer les niveaux de méthylation relatifs.

Pour distinguer et profiler spécifiquement 5hmC, CD Genomics propose également hMeDIP‑seq, qui utilise des anticorps spécifiques à 5hmC pour enrichir les fragments d'ADN hydroxyméthylés. Cette approche complémentaire permet aux chercheurs de profiler séparément les modifications 5mC et 5hmC en parallèle, améliorant ainsi la résolution de la cartographie épigénétique à travers divers types d'échantillons. Les méthodes MeDIP‑seq et hMeDIP‑seq sont toutes deux non destructives, sans conversion, et ne dépendent pas du traitement au bisulfite ou des polymérases tolérantes à l'uracile, et sont compatibles avec des échantillons à faible entrée.

Avantages de MeDIP-Seq / hMeDIP-Seq

• Peut cibler mC, mCG ou hmC
• Génome entier ou toute région d'intérêt
• Quasi-neutre et hypothèse
• Découverte de biomarqueurs épigénétiques
• Résolution à un nucléotide et coût-efficacité
• Exigence en ADN à faible entrée

Applications de MeDIP-Seq / hMeDIP-Seq

• Hétérogénéité épigénétique
• Environnement et Épigénétique
• Régulation de l'expression génétique
• Recherche sur les maladies
• Impression génétique
• Développement embryonnaire
• Détection des régions enrichies en méthylation de l'ADN dans des échantillons de maladie et inférence de jeux de gènes candidats dont l'expression est supprimée dans les échantillons.
• Surveillance des motifs dynamiques de méthylation de l'ADN à différents stades de survenue et de développement de la maladie, en particulier dans les sites de lésions, afin de rechercher des marqueurs épigénétiques qui aident à définir l'étendue de la progression de la maladie.
• Analyse comparative des différences dans la distribution des signaux et des localisations des régions de méthylation de l'ADN entre les échantillons malades et normaux, identification des régions de méthylation de l'ADN spécifiques à la maladie, et observation des gènes entourant ces régions pour réduire la liste des gènes candidats liés à la maladie.
• Cartographie des paysages d'hydroxyméthylation (5hmC) dans les tissus, les modèles de différenciation cellulaire ou de réponse au stress à l'aide de hMeDIP-seq.

Flux de travail MeDIP-Seq / hMeDIP-Seq

Le flux de travail général pour le séquençage MeDIP est décrit ci-dessous. En résumé, l'ADN extrait est fragmenté, dénaturé, ligaturé avec un adaptateur et capturé à l'aide de l'anticorps dirigé contre la 5-méthylcytosine (pour MeDIP-seq) ou la 5-hydroxyméthylcytosine (pour hMeDIP-seq), suivi de la préparation de la bibliothèque et du séquençage sur des plateformes Illumina.

Spécification de service

	Exigences d'échantillon ADN génomique ≥ 2 μg, Quantité minimale : 1 μg, Concentration ≥ 100 ng/µl OD 260/280=1,8~2,0 Tout l'ADN doit être traité avec de l'ARNase et ne doit montrer aucune dégradation ni contamination. Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégies de séquençage Préparation de bibliothèque MeDIP/hMeDIP Illumina HiSeq4000, PE150 50 millions de lectures ou 10 Go de données par échantillon Plus de 80 % des bases avec un score de qualité ≥Q30
	Analyse de données Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Alignement par rapport au génome de référence Alignement par rapport au génome de référence Distribution des régions du génome entier Statistiques de distribution de pointe Dépistage des gènes associés au pic Annotation fonctionnelle avec analyse GO/KEGG Analyse du niveau d'expression différentielle des gènes associés aux pics Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont uniquement à titre de référence. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails dans MeDIP-Seq / hMeDIP-Seq pour votre rédaction (personnalisation)

Avec des capacités de bioinformatique professionnelles, CD Genomics propose un service épigénétique de haute qualité MeDIP-Seq de bout en bout, à l'échelle du génome, pour identifier les régions méthylées différemment et, en fin de compte, aider à accélérer la recherche épigénétique. Si vous avez des exigences ou des questions supplémentaires, n'hésitez pas à contactez-nous.

Référence :

1. Taiwo O, Wilson G A, Morris T, et al.Analyse du méthylome utilisant MeDIP-seq avec de faibles concentrations d'ADN. Protocoles de la nature, 2012, 7(4) : 617.

Les résultats partiels sont affichés ci-dessous :

1. Comparé à d'autres méthodes, quels sont les avantages du séquençage MeDIP ?

Actuellement, l'approche basée sur le séquençage pour l'analyse du méthylome peut être classée en méthodes basées sur la conversion au bisulfite et en méthodes basées sur l'enrichissement. Les méthodes basées sur la conversion au bisulfite incluent génome entier ou ciblé séquençage au bisulfite ou séquençage bisulfite à représentation réduite (RRBS)Bien que les méthodes basées sur la conversion au bisulfite soient considérées comme la référence en matière d'analyse de la méthylation de l'ADN avec une résolution à base unique, elles ne peuvent pas faire la distinction entre mC et hmC. De plus, séquençage bisulfite de l'ensemble du génome est coûteux pour les applications sur de grandes tailles d'échantillons et par de plus petits groupes de recherche. De plus, le RRBS ne peut fournir qu'une couverture génomique limitée (5-10 %) et est centré sur les îlots CpG et les régions promoteurs.

En plus du séquençage MeDIP, les technologies basées sur l'enrichissement incluent également le MBD-seq, qui utilise les protéines de liaison à la méthylation MBD2 et MDB3L1, et le methylCap-seq qui utilise le domaine de liaison à la méthylation de MECP2 pour la capture de méthyle. Cependant, le MBD-seq et le methylCap-seq sont limités à l'analyse de l'mCG et les protocoles de génome entier nécessitent souvent des concentrations élevées d'ADN génomique (plus de 1 000 ng). Par conséquent, le MeDIP est une méthode polyvalente, précise et coûteuse avec une faible exigence en ADN d'entrée et est applicable à un large éventail d'échantillons et d'études.

2. Quelles sont les exigences pour les échantillons de séquençage MeDIP ?

Les échantillons de séquençage MeDIP nécessitent un génome de référence ou des séquences pour l'alignement, et les résultats assemblés affectent directement la précision de l'analyse des données. Un génome de référence provenant d'espèces étroitement apparentées ou des résultats assemblés à partir du transcriptome peuvent également être utilisés malgré la perte d'informations partielles sur la méthylation.

3. Quels facteurs peuvent affecter les résultats de MeDIP-seq ?

Chaque processus impliqué dans le MeDIP-seq peut affecter les résultats, en particulier l'immunoprécipitation et la PCR. L'immunoprécipitation est le processus qui permet d'enrichir les régions méthylées, et les conditions de réaction peuvent influencer les résultats d'enrichissement. Si l'ADN recyclé est insuffisant, la PCR est utilisée pour l'amplifier, ce qui peut biaiser les résultats. De plus, la contamination doit être évitée tout au long du processus.

Altérations épigénétiques chez les souris TRAMP : profilage de la méthylation de l'ADN épigénomique utilisant MeDIP-seq

Journal : Cellules & Biosciences
Publié : 12 janvier 2018

Résumé

Les auteurs ont profilé le méthylome du modèle de cancer de la prostate de la souris (TRAMP) et ont analysé les interactions entre les gènes ciblés et la voie fonctionnelle associée. En utilisant le séquençage MeDIP, ils ont analysé Méthylation de l'ADN des profils et a réalisé des analyses informatiques pertinentes, qui pourraient fournir des stratégies pour les approches de prévention et de traitement du cancer de la prostate.

Matériaux et Méthodes

Résultats

1. Comparaison des résultats MeDIP-seq

Au total, 2147 gènes entre les animaux TRAMP et les témoins ont montré un changement significatif dans les pics de méthylation. Par rapport au témoin, une méthylation significativement accrue de 1042 gènes et une méthylation significativement diminuée de 1105 gènes ont été observées chez TRAMP. Quatre gènes d'intérêt, DYNC1I1, SLC1A4, XRCC6BP1 et TTR, ont été analysés par IGV. Les souris TRAMP ont montré un ratio de méthylation accru de DYNC1I1 et SLC1A4, et un ratio de méthylation diminué de TTR et XRCC6BP1, ce qui était en accord avec les résultats de MeDIP-seq.

Figure 1. Visualisation de l'outil d'intégration génomique des distributions des lectures alignées par rapport au génome de référence pour quatre gènes cibles : DYNC1I1, SLC1A4, XRCC6BP1 et TTR.

2. Validation de l'expression génique sélectionnée par qPCR

Les niveaux d'expression de CRYZ, DYNC1I1, HNMT, SLC1A4 et TTR ont été mesurés dans les groupes TRAMP et de type sauvage (Figure 2). Parmi eux, l'expression de TTR a augmenté de 9,05 fois par rapport au type sauvage. De plus, les niveaux d'expression de TTR étaient significativement plus élevés dans le tissu cancéreux de la prostate que dans le tissu normal et dans le tissu d'hyperplasie bénigne de la prostate. En outre, ils ont observé une diminution de la méthylation dans la région promotrice de TTR mais une augmentation de l'expression génique. En revanche, la méthylation de l'ADN dans le corps du gène ou en aval peut ou non suivre une relation réciproque.

Figure 2. Comparaison de l'expression des miARN de CRYZ, DYNC1I1, HNMT, SLC1A4 et TTR entre des échantillons de prostate de souris de type sauvage et de souris TRAMP.

3. Voie canonique, maladies et fonctions, et analyses de réseau.

Les 2147 gènes présentant un changement significatif de méthylation ont été analysés. Les réseaux liés au cancer représentaient la majorité (Tableau 2), ce qui suggérait que la différence entre le TRAMP et le témoin résidait dans le développement des organes et le développement du cancer. Les maladies les plus associées, à savoir le cancer, les maladies gastro-intestinales, les anomalies organiques, les maladies du système reproducteur et les maladies dermatologiques, étaient classées parmi les cinq premières (Figure 3).

Tableau 1. Dix principales voies canoniques altérées.

Tableau 2. Réseaux principaux analysés.

Figure 3. Cinq principales catégories de maladies associées (a) et cinq principaux sous-types de cancer (b) analysés.

Discussion

L'analyse des voies canoniques fournirait des informations pour le développement de nouvelles cibles thérapeutiques. Comme le montre la Figure 4, les gènes présentant une méthylation significative dans la voie canonique principale étaient ceux de la voie de signalisation de la douleur neuropathique, ce qui est cohérent avec la découverte précédente selon laquelle la malignité la plus courante dans TRAMP est d'origine neuroendocrine. Le Tableau 3 répertorie les gènes impliqués dans cette voie qui ont montré une méthylation modifiée. Il a été constaté que CREB était étroitement lié à la prolifération cellulaire, à la différenciation et aux réponses adaptatives dans le système neuronal, et la méthylation du gène CREB1 a été réduite de 2,274 dans TRAMP. De plus, il a également été constaté que CREB régule d'autres voies de carcinogenèse. Toutes ces données indiquent que CREB est fortement lié à la thérapie du cancer et pourrait constituer une nouvelle stratégie pour la prévention et le traitement du cancer de la prostate.

Figure 4. Gènes cartographiés sur la voie de signalisation canonique de la douleur neuropathique.

Tableau 3. Gènes de méthylation altérés cartographiés sur la voie de signalisation de la douleur neuropathique.

Référence :

1. Li W, Huang Y, Sargsyan D, et al.Altérations épigénétiques chez les souris TRAMP : profilage de la méthylation de l'ADN épigénomique utilisant MeDIP-seq. Cellule et biosciences, 2018, 8(1) : 3.