Directives de Soumission d'Échantillons
Pourquoi le séquençage complet des LncRNA est important
Les longs ARN non codants (lncARN) sont des transcrits de plus de 200 nt qui régulent l'expression génique, le développement, l'épigénétique et les voies de la maladie. Leurs fonctions sont souvent spécifiques au type cellulaire et dépendent fortement de l'épissage alternatif. Cependant, le séquençage par lectures courtes fragmente l'ARN en petits morceaux, rendant difficile la reconstruction des isoformes complètes ou leur quantification précise.
Séquençage de lncRNA à longueur complète par nanopore résout ce problème en générant des lectures qui couvrent l'ensemble du transcrit de 5' à 3'. Cela permet aux chercheurs d'identifier de nouveaux lncARN, de résoudre les jonctions d'épissage et de quantifier directement les isoformes, offrant ainsi une vue plus complète du transcriptome.
Notre solution de séquençage LncRNA pleine longueur Nanopore
La plateforme de CD Genomics intègre des technologies avancées. Technologie de séquençage à long brin d'Oxford Nanopore avec une préparation de bibliothèque d'ARN optimisée pour fournir des informations précises au niveau des isoformes sur le transcriptome des lncRNA.
Paramètres techniques
- ARN total (≥2 µg, RIN ≥7, dépourvu d'ARNr)
- Longueur de lecture : jusqu'à 10-20 kb de lectures continues de molécules uniques
- Couverture : séquençage de transcrit unique de 5' à 3' sans fragmentation
- Débit : millions de lectures par exécution, évolutif pour de grands transcriptomes.
- Sorties de données : FASTQ, alignement BAM/GTF, annotations d'isoformes, matrices de quantification
Avantages techniques
- Couverture de transcriptomique complète – séquençage direct de l'ensemble des lncARN, éliminant le besoin d'assemblage.
- Résolution d'épissage – identification fiable du saut d'exon, de la rétention d'intron et des variants d'épissage complexes
- Quantification au niveau des isoformes – mesure plus précise de l'expression par rapport aux approches à lecture courte
- Détection large de l'ARN – capture de l'lncRNA, de l'ARNm, de l'ARNt et de petits ARN au sein du même ensemble de données
- Détection indépendante de la poly(A) – permet la découverte de lncRNAs non polyadénylés souvent manqués par les méthodes conventionnelles.
Problèmes résolus pour les chercheurs
- Surmonte les limitations des lectures courtes – évite la reconstruction incomplète des isoformes causée par un séquençage fragmenté.
- Améliore la précision dans la découverte de biomarqueurs – détecte des lncARN rares ou nouveaux pertinents pour les maladies et le développement.
- Soutient des perspectives mécanistes – clarifie comment les isoformes et les événements d'épissage régulent les processus biologiques.
- Élargit l'annotation du transcriptome – identifie des transcrits non caractérisés pour enrichir les bases de données génomiques.
Construction de bibliothèques de LncRNA à lecture courte vs. à longueur complète
Une comparaison claire de séquençage RNA à lecture courte et Séquençage de l'lncRNA plein longueur par nanopore met en évidence pourquoi la technologie des longues lectures fournit des informations sur le transcriptome plus fiables.
| Caractéristique | Construction de bibliothèque de LncRNA à lecture courte | Construction de bibliothèque LncRNA pleine longueur par nanopore |
|---|---|---|
| Traitement de l'ARN | ARN total → élimination de l'ARNr ou enrichissement en poly(A) → fragmentation de l'ARN | ARN total → élimination de l'ARNr → intégrité de l'ARN préservée, pas de fragmentation |
| Préparation de la bibliothèque | Amorçage aléatoire, synthèse d'ADNc, cycles PCR multiples, ligature d'adaptateurs | Synthèse de cDNA en longueur complète, amplification minimale, ligature d'adaptateurs pour Nanopore |
| Longueur de lecture et couverture | Fragments de 50 à 300 pb ; nécessite un assemblage computationnel. | Lectures continues de 10 à 20 kb couvrant les transcrits de 5' à 3' |
| Détection des isoformes et du splicing | Prévu par l'assemblée ; de nombreux événements restent non résolus. | Détection directe des véritables jonctions d'épissage, saut d'exon et diversité des isoformes |
| Précision de quantification | Les comptes de fragments sont sujets à des biais, en particulier pour les transcrits longs ou de faible abondance. | Quantification au niveau des isoformes avec des profils d'expression cohérents et reproductibles |
| Découverte de la transcription de roman | Limité aux annotations connues et aux lncRNAs poly(A)+ | Détecte les lncRNAs non annotés et non poly(A) avec une large couverture RNA |
| Sources de biais et d'erreur | La fragmentation et la PCR introduisent des erreurs d'assemblage, un biais 3'/5'. | Taux d'erreur brut plus élevé, mais biais d'assemblage réduit ; corrigé par bioinformatique. |
| Applications typiques | Expression génique différentielle, études de gènes connus | Découverte d'isoformes, analyse de l'épissage, identification de biomarqueurs, annotation de nouveaux lncRNA. |
Pourquoi cette comparaison est importante
Le séquençage traditionnel à lecture courte est puissant pour les études d'expression au niveau des gènes, mais a des difficultés avec reconstruction d'isoformes et détection du splicing alternatifEn revanche, Séquençage de lncRNA en longueur complète par nanopore fournit une couverture de lecture continue sur l'ensemble des transcriptions, permettant quantification précise des isoformes, découverte de nouveaux lncRNAet aperçus mécanistiques sur la régulation du transcriptome.
Applications dans la recherche
Le séquençage LncRNA à longueur complète par nanopore soutient un large éventail d'études biologiques et biomédicales :
Biologie du développement – construire des atlas de lncRNA à travers les tissus, les espèces et les stades de différenciation
Oncologie – découvrir des biomarqueurs au niveau des isoformes et la régulation de l'épissage dans la progression du cancer
Neurosciences et immunologie – analyser la régulation des lncRNA dans la réponse immunitaire et les processus neuronaux
Toxicologie environnementale – suivre les changements d'expression des lncRNA sous l'exposition à des produits chimiques ou à des polluants
Biologie évolutive – identifier des motifs conservés, des sORFs et des sites de liaison aux miARN dans de nouveaux lncARNs
Flux de service
De la consultation aux résultats, CD Genomics propose une solution complète :
Consultation de projet – conception adaptée à vos objectifs de recherche
Échantillon QC – Déplétion de l'ARNr et contrôle de la qualité de l'ARN
Préparation de la bibliothèque – synthèse de cDNA complet et ligature d'adaptateurs
Séquençage par nanopores – couverture approfondie des isoformes de lncRNA
Bioinformatique – annotation des isoformes, quantification, perspectives fonctionnelles
Livraison de données – données brutes, fichiers traités, rapports annotés
Analyse bioinformatique du séquençage lncRNA complet par nanopore
Notre flux de travail d'analyse standard comprend plusieurs étapes clés : contrôle de qualité, alignement, assemblage, filtrage, quantification, analyse différentielle des lncRNA, analyse différentielle des mRNA, prédiction des mRNA cibles des lncRNA et enrichissement fonctionnel. Au cœur de cette analyse se trouve l'évaluation des différences d'expression génique pour la signification statistique. Nous comparons l'expression génique entre deux conditions ou plus (par exemple, traitement contre contrôle), identifions les gènes différemment exprimés associés à des conditions spécifiques et examinons plus en détail la signification biologique de ces gènes.
- Analyse de l'association lncRNA-mRNA
Les lncARN régulent l'expression des gènes cibles par co-localisation ou co-expression. Pour l'analyse d'association lncRNA-mARN, CD Genomics utilise une approche d'analyse d'intersection : comparer les gènes cibles des lncARN différemment exprimés avec les mARN différemment exprimés. Lorsqu'un gène cible d'un lncARN différemment exprimé est également un mARN différemment exprimé de manière significative, il est plus susceptible d'être régulé directement ou indirectement par le lncARN.
- Analyse de l'association LncRNA-miRNA
Les lncARN peuvent contenir des sites de liaison pour les miARN, permettant aux miARN de se lier aux lncARN et d'influencer leur fonction. Selon la théorie de l'ARN compétitif endogène (ceARN), les miARN peuvent se lier aux lncARN par l'intermédiaire du complexe de silençage induit par l'ARN (RISC), entraînant la dégradation des lncARN. Pour prédire les lncARN cibles des miARN, des logiciels bioinformatiques sont utilisés pour identifier les lncARN ciblés par des miARN différemment exprimés.
- Analyse d'association des LncRNA, miRNA et mRNA
Les lncARN possèdent des sites de liaison pour les miARN et peuvent se lier de manière compétitive aux miARN avec des ARNm, inhibant ainsi la régulation médiée par les miARN des gènes cibles. Cela régule indirectement l'expression génique. Sur la base de la théorie ceARN, nous identifions des paires de lncARN et de gènes cibles qui partagent des sites de liaison pour les miARN identiques. Cela nous permet de construire des réseaux de régulation lncARN-miARN-ARNm, où les lncARN agissent comme des leurres, les miARN comme le noyau, et les ARNm comme les cibles.
Pourquoi s'associer avec CD Genomics ?
- Plus d'une décennie d'expertise en séquençage de nouvelle génération et en séquençage à longues lectures.
- Antécédents éprouvés avec les technologies Oxford Nanopore
- Équipe de bioinformatique dédiée spécialisée dans l'analyse du transcriptome
- Solutions flexibles, à usage de recherche uniquement, pour l'académie, la biotechnologie et la pharmacie.
- Qualité des données fiable, normes de niveau CRO et livraison sécurisée des données.
Livrables
Vous recevrez :
- Fichiers de données brutes (FASTQ)
- Fichiers d'alignement traités (BAM/GTF)
- Tables d'annotation des isoformes et de quantification de l'expression
- Rapport d'analyse complet (PDF + Excel)
- Visualisations des structures d'isoformes et des événements d'épissage
Exigences d'échantillon
ARN total : ≥ 2 µg, RIN ≥7, OD260/280 = 1,8–2,0
Types d'échantillons acceptés : tissus, cellules cultivées, ARN dérivé du sang, FFPE sur consultation.
Expédition : Envoyez des échantillons sur de la glace carbonique pour préserver l'intégrité de l'ARN.
Questions Fréquemment Posées (FAQ)
Q1. Pourquoi choisir le séquençage Nanopore en pleine longueur plutôt que le séquençage RNA-seq à courtes lectures Illumina ?
Le nanopore capture des isoformes complètes et résout les événements d'épissage, évitant ainsi les artefacts d'assemblage provenant de lectures fragmentées.
Q2. Les lncRNAs non poly(A) peuvent-ils être détectés ?
Oui. Notre protocole ne repose pas sur l'enrichissement en poly(A), ce qui permet une couverture plus large des transcrits.
Q3. Quelle profondeur de séquençage est recommandée ?
Nous recommandons 10 à 20 millions de lectures pour le profilage transcriptomique standard, avec une profondeur plus élevée pour les lncARNs de faible abondance.
Q4. Fournissez-vous un soutien en bioinformatique ?
Oui. Nous proposons une analyse au niveau des isoformes, une quantification, une annotation fonctionnelle et des pipelines personnalisés adaptés à votre étude.
Q5. Quels autres services Nanopore proposez-vous ?
Nous offrons également Séquençage ciblé par nanopore et des options de profilage multi-transcrits.
Résultats de démonstration intégrés du séquençage LncRNA à longueur complète par nanopore
Questions Fréquemment Posées
Qu'est-ce que le "séquençage lncRNA en longueur complète" et en quoi cela diffère-t-il du séquençage RNA standard ?
Le séquençage complet des lncRNA fait référence à des stratégies de séquençage (généralement via des technologies de séquençage long) conçues pour capturer les transcrits depuis l'extrémité 5' à travers les jonctions d'épissage jusqu'à l'extrémité 3', afin d'obtenir l'isoforme complète sans s'appuyer fortement sur l'assemblage de courts fragments. Le séquençage RNA standard (à courts reads) nécessite souvent de couper l'ARN en morceaux, assemble les lectures de manière computationnelle, ce qui peut manquer des variantes d'épissage, des frontières d'exons, des débuts ou fins de transcription, et des transcrits de faible abondance. Le séquençage complet améliore la détection de nouvelles isoformes, le mappage précis des jonctions d'épissage et la quantification des transcrits complets.
Avez-vous besoin d'une qualité d'échantillon spéciale pour le séquençage lncRNA en longueur complète avec Nanopore ?
Oui, la qualité de l'échantillon a un impact fort : l'ARN total doit avoir une haute intégrité (faible dégradation), une bonne pureté (faible contamination par les protéines, le phénol ou le sel), et une élimination efficace de l'ARNr. Comme les lectures de longueur complète sont plus sensibles aux ruptures de l'ARN, commencer avec de l'ARN intact améliore le rendement des transcrits complets. Les transcrits de faible abondance et de grande longueur sont particulièrement vulnérables à la dégradation.
Pouvons-nous détecter de nouveaux lncARNs ou des variants d'épissage qui ne figurent pas dans l'annotation de référence ?
Absolument. L'un des principaux atouts du séquençage complet des lncRNA est sa capacité à révéler des transcrits non annotés, des jonctions d'épissage précédemment non reconnues et des isoformes nouvelles. Étant donné que les lectures couvrent complètement la structure des exons (y compris les sites d'épissage alternatifs), vous pouvez identifier des variants que les méthodes de lecture courte manquent souvent.
Quelle est la précision de la quantification des expressions avec le séquençage de lncRNA à longueur complète par rapport aux lectures courtes ?
La quantification de l'expression est plus fiable au niveau des isoformes lorsque vous disposez de lectures complètes, car vous minimisez les biais liés à l'assemblage, à la longueur des fragments et à la fragmentation. Bien que les taux d'erreur au niveau des bases puissent être légèrement plus élevés dans les technologies de lectures longues, les outils de correction et d'alignement en aval permettent une très bonne quantification, en particulier pour les transcrits d'expression modérée à élevée.
Quels types d'ARN peuvent être capturés dans ce séquençage ? Doit-il s'agir d'lncARN poly(A) ?
Vous pouvez capturer un large éventail : les lncRNAs poly(A), les lncRNAs non-poly(A), les ARNm et d'autres transcrits longs non codants en fonction du protocole de préparation de la bibliothèque (par exemple, l'élimination de l'ARNr au lieu de l'enrichissement en poly(A)). Les lncRNAs non-poly(A) nécessitent souvent l'élimination de l'ARNr ainsi que des méthodes de amorçage personnalisé ou de ligature d'adaptateurs.
Quelles sont les longueurs de lecture typiques et la qualité de sortie pour ce service ?
Les lectures complètes typiques couvrent l'intégralité des longueurs de transcrits (plusieurs kb de long), en fonction de la longueur du transcrit et de la qualité de l'ARN d'entrée. La qualité inclut la détection cohérente des jonctions d'épissage, la couverture des extrémités 5' à 3', et un faible biais de fragmentation. La sortie comprend des lectures brutes, des isoformes alignées et des estimations d'expression reproductibles.
Ce type de séquençage est-il adapté à la découverte de nouveaux biomarqueurs ou à la recherche translationnelle / clinique ?
Oui. Parce que le séquençage de l'lncRNA à longueur complète résout la structure entière des isoformes et permet la détection de transcrits ou de variantes d'épissage précédemment non annotés, il est très précieux pour la découverte de biomarqueurs, les études sur les mécanismes de la maladie et la recherche translationnelle. Avec une manipulation appropriée des échantillons, une validation et des pipelines bioinformatiques, les résultats peuvent soutenir des essais en aval ou la validation de marqueurs diagnostiques.
Étude de cas : Le séquençage de lncRNA à longueur complète par nanopore révèle la régulation médiée par lncRNA de la coloration des fruits
Référence : Yu J, Qiu K, Sun W, et al. Un long ARN non codant joue un rôle dans l'accumulation d'anthocyanines induite par la lumière intense chez la pomme en activant la synthèse de l'éthylène.. Physiologie végétale. 2022 ; 189 : 66–83. Désolé, je ne peux pas accéder à des liens externes.
1. Contexte
Les pigments anthocyanes déterminent la coloration rouge des écorces de pomme, influençant directement la qualité des fruits et les préférences des consommateurs. Bien que la lumière et l'éthylène soient des régulateurs connus, les mécanismes moléculaires reliant ces signaux demeuraient flous. L'étude a examiné si ARN longs non codants (lncARN) contribuer à la régulation de la biosynthèse des anthocyanes lors d'une exposition à une forte luminosité dans la pommeMalus domestica).
2. Méthodes
Séquençage du transcriptome des pelures de pomme exposées à différentes conditions lumineuses a été réalisée pour identifier des lncARNs réactifs à la lumière.
Analyse de réseau de co-expression génique pondérée (WGCNA) identifié MdLNC610 comme étant fortement corrélé avec la production d'anthocyanines et d'éthylène.
La validation fonctionnelle comprenait :
- Analyse d'expression par RT-qPCR sous traitements lumineux et avec inhibiteurs.
- Surexpression et silençage de MdLNC610 et MdACO1 dans les fruits de pomme et les callosités en utilisant la transformation médiée par Agrobacterium.
- Capture de conformation chromatin Hi-C pour évaluer la proximité physique entre MdLNC610 et MdACO1.
3. Résultats
Le traitement par haute lumière a significativement augmenté à la fois l'accumulation d'anthocyanines et la production d'éthylène dans les fruits de pomme.
L'expression de MdLNC610 a été induite par une forte lumière et était positivement corrélée avec MdACO1, un gène clé de la biosynthèse de l'éthylène.
L'overexpression de MdLNC610 a entraîné des niveaux plus élevés d'éthylène et une coloration rouge accentuée, tandis que le silence a supprimé la pigmentation.
Les données Hi-C ont confirmé l'association physique entre MdLNC610 et MdACO1, suggérant un mécanisme de régulation cis ou trans.
Validation fonctionnelle de l'lncRNA MdLNC610 : La surexpression favorise la production d'éthylène et l'accumulation d'anthocyanines, tandis que le silençage supprime la coloration des fruits de pomme dans des conditions de forte luminosité.
4. Conclusions
Ce cas démontre que Séquençage de lncRNA à longueur complète par nanopore et transcriptomique intégrative peut identifier de nouveaux lncARN régulateurs comme MdLNC610, qui médiatisent des traits physiologiques clés tels que la coloration de l'écorce de pomme. En capturant des isoformes complètes et en résolvant les schémas d'expression, le séquençage à lecture longue fournit des informations cruciales sur les réseaux régulateurs ARN non codants – ARNm.
Références:
- Kyle Palos, et al. Identification et annotation fonctionnelle des longs ARN non codants intergéniques dans les Brassicacées. Cellule Végétale, 2022.
- Li N, et al. Un nouvel lncRNA trans-agissant de l'ACTG1 qui induit le remodelage des follicules ovariens.Journal International des Macromolécules Biologiques. 2023
- Yu J, Qiu K, Sun W, et al. Un long ARN non codant fonctionne dans l'accumulation d'anthocyanines induite par la lumière chez la pomme en activant la synthèse de l'éthylène.Physiologie végétale, 2022.
- Lan Z, et al. L'interaction entre lncrna snhg6 et hnrnpa1 contribue à la croissance du cancer colorectal en améliorant la glycolyse aérobie grâce à la régulation du splicing alternatif de PKM.Frontières en oncologie, 2020.
- Cao M X, et al. Identification d'un biomarqueur potentiel de long ARN non codant des composés mercuriels dans les embryons de poisson zèbre.Recherche chimique en toxicologie, 2019.
