Directives de Soumission d'Échantillons
Transformer les questions de livraison in vivo en preuves soutenues par le séquençage.
Les études de thérapie génique in vivo commencent souvent par une question directe : où est allé le matériel génétique délivré ? Une fois que le projet inclut plusieurs tissus, groupes ou points temporels, cette question devient plus complexe.
Vous devrez peut-être savoir si un vecteur est détectable dans les tissus cibles, si les tissus non cibles montrent un signal, si la séquence prévue est soutenue par des lectures, si l'expression au niveau de l'ARN est présente, ou si une analyse liée à l'intégration doit être envisagée pour votre système de vecteur.
Nous vous aidons à transformer ces questions en un plan de séquençage et de biodistribution adapté à l'étude, au lieu de forcer chaque projet dans le même essai.
Quelle question cette solution vous aide-t-elle à répondre ?
- Le vecteur ou le matériel génétique délivré est-il détecté dans les tissus sélectionnés ?
- Comment les tissus cibles et non cibles se comparent-ils entre les groupes ?
- Le génome vectoriel ou la région cible est-elle soutenue par des lectures de séquençage ?
- Le transgène montre-t-il une expression au niveau de l'ARN dans les tissus sélectionnés ?
- Faut-il ajouter l'évaluation du site d'intégration ou de l'événement d'insertion ?
- Quels résultats de QC et de bioinformatique sont nécessaires pour la révision interne ?
L'objectif est de choisir les bons résultats avant que les échantillons ne soient traités, afin que le paquet de données final réponde à la question que vous devez réellement poser.
Un résultat de biodistribution au niveau tissulaire peut montrer si une séquence cible est détectable. Il peut ne pas confirmer la séquence du vecteur plus large, expliquer l'expression au niveau de l'ARN ou aborder des questions liées à l'intégration.
C'est pourquoi certains projets de thérapie génique in vivo nécessitent une approche combinée :
- Lectures de biodistribution pour des preuves liées à la présence au niveau des tissus ou aux copies
- Séquençage ciblé pour la confirmation du vecteur ou de la région cible
- Séquençage du génome AAV pour le soutien à la structure et à la séquence du génome vectoriel
- Séquençage de l'ARN pour l'expression de transgènes ou le profilage de la réponse de l'hôte
- Séquençage du génome entier ou séquençage à longues lectures pour un contexte génomique plus large
- Analyse du site d'intégration lorsque la biologie vectorielle et la conception de l'étude l'exigent
Nous vous aidons à décider quelles couches sont nécessaires, lesquelles sont optionnelles et lesquelles peuvent ne pas être utiles pour l'étude actuelle.
Nos capacités de service pour les projets de biodistribution en thérapie génique
Nous soutenons les projets de séquençage de thérapie génique in vivo en tant que packages d'étude intégrés, et non comme des tâches de génération de données isolées. Avant le début du projet, notre équipe peut examiner avec vous le type d'échantillon, la conception du vecteur, les objectifs de lecture, la stratégie de séquençage, les points de contrôle de QC et les livrables attendus.
Cette première évaluation est importante. Elle aide à prévenir un problème courant dans les études complexes : générer des données qui sont techniquement valides mais qui ne correspondent pas bien à la question biologique.
Systèmes de vecteurs et de livraison que nous pouvons soutenir
- Recherche sur les vecteurs AAV
- Recherche sur les vecteurs lentiviraux ou rétroviraux
- Études de livraison par plasmide ou non virale
- Études sur les acides nucléiques délivrés par LNP ou nanoparticules
- Contextes de livraison de gènes exogènes ou de cellules ingénierées
Modules de séquençage et d'analyse
- Confirmation du génome vecteur ou de la région cible
- Lectures de biodistribution des tissus
- Profilage de l'expression des transgènes
- Évaluation du site d'intégration ou de l'événement d'insertion lorsque cela est applicable.
- Comparaison multi-tissulaire ou multi-temporelle
- Rapport et visualisation en bioinformatique
Soutien à l'exécution du projet
Un projet solide commence avant le séquençage. Nous vous aidons à examiner le type et le regroupement des échantillons, la liste des tissus et les points temporels, à établir une carte ou la disponibilité de la séquence cible, les informations de contrôle qualité de l'ADN ou de l'ARN, la nomination et l'étiquetage des échantillons, les tableaux et figures de sortie prévus, ainsi que les types de fichiers bioinformatiques requis.
Cela aide votre équipe à définir plus clairement le projet et réduit le risque de collecter des données qui ne peuvent pas répondre à la question d'étude initiale.
Choisissez le bon affichage : Biodistribution, Confirmation de séquence, Expression ou Intégration.
Une bonne étude de thérapie génique in vivo ne commence pas par une plateforme. Elle commence par la question à laquelle votre équipe doit répondre. Le tableau ci-dessous montre comment les résultats courants diffèrent et quand chacun d'eux peut convenir.
| Lecture / Méthode | Question principale répondue | Cas d'utilisation optimal | Type d'échantillon courant | Sorties typiques | Limitation importante |
|---|---|---|---|---|---|
| quantification de type qPCR / ddPCR | La séquence cible est-elle détectable ou quantifiable ? | Biodistribution des tissus, analyse liée au nombre de copies du vecteur, détection de cibles connues | ADN ou ARN extrait, acide nucléique dérivé de tissu | Tables liées à la copie, comparaison au niveau des tissus, sortie de signal normalisée | Contexte de séquence limité ; ne confirme pas la structure vectorielle large. |
| Séquençage de région ciblée | La région cible ou le vecteur attendu est-il soutenu par les lectures ? | Confirmation de cible connue, support de séquence vectorielle basée sur l'amplicon | ADN, amplicons, régions cibles préparées | Lire le support, résumé de la couverture, tableau des régions cibles | Axé sur des régions sélectionnées ; pas conçu pour une découverte à l'échelle du génome. |
| Séquençage du génome AAV | La structure ou la séquence du génome AAV est-elle soutenue ? | Confirmation de la séquence du vecteur AAV et contrôle qualité lié au vecteur | ADN vector ou matériel lié à l'AAV préparé | Preuves de séquence vectorielle, couverture, soutien à la structure de séquence | Axé sur le vecteur ; ne remplace pas l'analyse de la biodistribution au niveau tissulaire. |
| Séquençage de l'ARN | Le transgène est-il exprimé, et la réponse de l'hôte est-elle pertinente ? | Profilage de l'expression des transgènes, réponse tissulaire, analyse au niveau des voies. | ARN total provenant de tissus ou de cellules | Matrice d'expression, carte thermique, tableau d'expression différentielle, sortie de voie | Le signal ARN n'égale pas toujours la présence d'ADN vecteur. |
| Séquençage du génome entier | Un contexte génomique plus large est-il nécessaire ? | Analyse des variantes à l'échelle du génome ou analyse contextuelle, questions de recherche sélectionnées nécessitant un contexte génomique. | ADN génomique | Tables de variantes, données à l'échelle du génome, résumé de QC | Plus complexe et pas toujours nécessaire pour une biodistribution ciblée. |
| Séquençage à lecture longue | Le contexte de séquence à plus long terme est-il important ? | Contexte structurel, questions plus larges liées aux insertions, études de vecteurs ou d'intégration sélectionnées. | ADN de haute qualité ou matériel préparé | Alignement de longues lectures, contexte structurel, support de région candidate | Nécessite des entrées de meilleure qualité et une conception d'étude soigneuse. |
| Analyse du site d'intégration | Où sont détectés les événements d'insertion de candidats ? | Systèmes d'intégration lentiviraux, rétroviraux, de transposons ou autres systèmes pertinents pour l'intégration | ADN génomique | Table d'insertion des candidats, résumé de la localisation génomique, visualisation | Seulement approprié lorsque la biologie vectorielle et la question d'étude le justifient. |
Pour les détails des services associés, consultez notre Séquençage du génome AAV, Séquençage de région ciblée, Séquençage du génome entieret Analyse des sites d'intégration lentiviraux/rétroviraux pages.
Si la question principale est où le matériel génétique est détecté, commencez par un bilan de biodistribution. Si la question principale est que le vecteur attendu ou la région cible est présent et soutenu par des lectures, ajoutez le séquençage ciblé ou le séquençage du génome vectoriel. Si la question principale est si le transgène est exprimé, ajoutez une analyse au niveau de l'ARN.
Si la question principale est si les événements liés à l'insertion sont importantsConsidérez l'analyse du site d'intégration uniquement lorsque le type de vecteur et le design de l'étude le rendent pertinent. Si votre équipe a besoin d'un package de données internes clair, nous devrions définir les livrables en bioinformatique avant la soumission des échantillons. Cela inclut les tableaux, figures, types de fichiers, résumés de contrôle qualité et notes de rapport attendus.
Flux de travail de l'échantillon au rapport avec des points de contrôle de qualité
Notre flux de travail combine le traitement technique avec la gestion de projet. Une fois que les échantillons entrent dans le projet, nous suivons si chaque étape soutient toujours la question d'étude originale.
Étape 1 : Sélection de l'admission du projet et de la lecture des résultats
Avant que les échantillons n'entrent dans le flux de travail, nous examinons le plan d'étude avec votre équipe. Les informations utiles comprennent le vecteur ou le système de livraison, la liste des espèces et des tissus, les tissus cibles et non cibles, la conception des groupes et les points temporels, le format des échantillons, la séquence cible ou la carte de construction, les résultats souhaités et les tableaux et figures de sortie attendus.
Cette étape nous aide à décider si votre étude nécessite un seul résultat ou un package combiné.
Étape 2 : Soumission d'échantillons et revue pré-QC
Lorsque les échantillons sont préparés pour l'expédition, un étiquetage et une documentation clairs sont essentiels. CD Genomics demande aux clients de fournir un formulaire de soumission d'échantillons complété, de maintenir la cohérence des noms d'échantillons entre le formulaire et les étiquettes des tubes, et de soumettre des données de contrôle qualité électroniques lorsque cela est possible.
Pour la soumission de tubes, des tubes de centrifugeuse de 1,5 mL sont souvent appropriés. Les plaques doivent être scellées hermétiquement pour réduire la perte d'échantillons ou la contamination croisée. L'ADN dans l'eau ou le tampon TE doit être expédié avec des packs de glace, tandis que l'ARN, les cellules, les bactéries et les tissus congelés doivent être expédiés avec de la glace carbonique.
À ce stade, notre équipe vérifie l'identité de l'échantillon, le type d'échantillon, l'étiquetage et les informations de contrôle qualité disponibles. Si quelque chose n'est pas clair, nous le clarifions avant que l'échantillon ne passe à l'étape suivante du traitement.
Étape 3 : Extraction des acides nucléiques et contrôle de la qualité
Le flux de travail technique dépend du matériau d'entrée et de la lecture sélectionnée.
Pour les lectures basées sur l'ADN, l'ADN extrait doit être traité avec de l'ARNase et ne montrer aucune dégradation ou contamination évidente. Les recommandations d'échantillons de CD Genomics suggèrent que le rapport OD260/280 de l'ADN soit aussi proche que possible de 1,8 à 2,0.
Pour les résultats basés sur l'ARN, l'ARN total doit être exempt d'ADN. Les recommandations de CD Genomics suggèrent un A260/A280 ≥ 1,8, un A260/230 ≥ 1,8 et un RIN ≥ 6 pour les échantillons d'ARN total.
La révision de la QC peut inclure la concentration, la pureté, la dégradation et l'adéquation à la méthode de séquençage choisie. Si la qualité de l'échantillon ne correspond pas à la lecture prévue, nous discutons des ajustements possibles avant de procéder.
Étape 4 : Préparation de la bibliothèque ou de l'analyse et séquençage
Après le contrôle qualité, le projet passe à la voie technique sélectionnée.
Pour le séquençage ciblé, les régions cibles sont amplifiées ou enrichies avant le séquençage. Pour le séquençage du génome AAV, le soutien et la couverture des séquences liées au vecteur sont évalués. Pour le séquençage d'ARN, l'ARN est converti en bibliothèques prêtes pour le séquençage. Pour les stratégies de séquençage du génome entier ou à longues lectures, la préparation de la bibliothèque dépend de la qualité de l'ADN et du type de données requis.
L'objectif technique n'est pas seulement de générer des lectures. Il s'agit de générer des données qui correspondent au résultat biologique prévu.
Étape 5 : Bioinformatique, résumé de l'assurance qualité et livraison du rapport
Après le séquençage, nous traitons les données en résultats exploitables. Selon le projet, cela peut inclure des données brutes et des données nettoyées, un résumé de contrôle de qualité au niveau des échantillons, un soutien de lecture dans les régions cibles, des tableaux de distribution au niveau des tissus, une matrice d'expression, un tableau des candidats de sites d'intégration lorsque cela est applicable, des résumés visuels, des notes de rapport d'analyse, ainsi que des enregistrements de pipeline et de paramètres lorsque cela est inclus.
Le package final est conçu pour aider votre équipe à examiner l'étude, à comparer les groupes et à décider si des expériences de suivi sont nécessaires.
Exigences d'échantillonnage pour les études de thérapie génique multi-tissulaire
Les besoins en échantillons dépendent du type de vecteur, de la lecture, de l'espèce, du tissu et de l'état d'extraction. Le tableau ci-dessous fournit des points de départ pratiques basés sur les recommandations d'échantillons de CD Genomics et la planification de projets de séquençage courants. Les exigences finales doivent être confirmées lors de la révision du projet.
| Type d'échantillon | Entrée recommandée | Conteneur | Expédition | Points de contrôle QC | Notes |
|---|---|---|---|---|---|
| Tissu congelé pour extraction d'ADN/ARN | Spécifique au projet ; pour le RNA-seq, les recommandations de tissu peuvent commencer à partir de 10-50 mg en fonction de l'application. | Cryotube ou tube scellé approuvé | Glace carbonique | Identité des tissus, risque de dégradation, adéquation ADN/ARN | Fournir le nom du tissu, le groupe, le point temporel, le type de vecteur. |
| ADN génomique extrait pour le séquençage à court terme | WGS : ≥500 ng recommandé ; WES : ≥500 ng recommandé ; séquençage du génome viral : ≥1 μg recommandé | Tube sans DNase | Sacs de glace | OD260/280 proche de 1,8-2,0, concentration, dégradation, contamination | Soumettez la carte de construction ou la séquence cible si disponible. |
| ADN génomique extrait pour le séquençage à long terme | PacBio WGS : ≥3 μg ; Nanopore WGS : ≥5 μg | Tube sans DNase | Packs de glace | ADN de haute masse moléculaire, concentration, pureté | Utile lorsque un contexte de séquence à plus long terme est nécessaire. |
| ARN extrait pour le profilage d'expression | Transcriptome complet : ≥3 μg recommandé ; mRNA-seq : ≥500 ng recommandé | Tube sans RNase | Glace carbonique | A260/A280 ≥1,8, A260/230 ≥1,8, RIN ≥6 | Utile pour l'expression de transgènes ou le profilage de la réponse de l'hôte. |
| Cellules pour le travail basé sur l'ARN | L'orientation de l'ARNm-seq peut commencer à partir de ≥1×106 cellules | Format de tube approuvé ou format de cellule congelée | Glace carbonique | Quantité de cellules, intégrité de l'ARN après extraction | Fournir le type de cellule, le groupe, le traitement et le résultat cible. |
| Échantillon de sang | Pour certains tests, 0,5 à 1 mL ou plus peuvent être nécessaires en fonction de la lecture. | Vessel de collecte de sang anticoagulant en plastique | Emballage rigide protégé ; l'état dépend de l'analyse | Intégrité de l'échantillon et adéquation de la matrice | Fournir le type d'anticoagulant et le groupe d'étude. |
| Amplicon purifié | Séquençage d'amplicons : ≥1 μg recommandé ; 500 ng minimum | Tube à faible liaison | Sacs de glace | Concentration, bande à cible unique si disponible | Utile pour la confirmation ciblée d'une région spécifique. |
| Particules virales ou matériel vecteur | Examen de faisabilité spécifique au projet requis | Format congelé approuvé | Glace carbonique | Identité, concentration si disponible, informations de construction | Utile pour la confirmation de séquences liées aux vecteurs. |
Analyse bioinformatique et livrables
La bioinformatique doit être planifiée avant le début du séquençage. Lorsque nous comprenons votre type de vecteur, la région cible, la liste des tissus et les objectifs de rapport dès le départ, nous pouvons créer un package de résultats plus utile.
Livrables minimums
- Données brutes et données nettoyées lorsque cela est applicable
- Résumé de la QC au niveau de l'échantillon
- Résumé des lectures liées à la région cible ou au vecteur
- Table de distribution au niveau des tissus
- Fichiers de visualisation de base
- Notes sur la méthode et l'analyse
- Paquet de rapport final
Pour les projets impliquant le profilage d'expression, les résultats peuvent également inclure des matrices d'expression et des cartes thermiques. Pour les projets portant sur des questions d'intégration, les résultats peuvent inclure des tableaux de candidats d'insertion et des résumés de localisation génomique.
Options supplémentaires
- Analyse des candidats pour le site d'intégration
- Matrice d'expression de l'ARN et expression différentielle
- Analyse des voies de réponse de l'hôte
- Comparaison multi-temporelle ou multi-dose
- Visualisation prête pour les figures personnalisées
- Enregistrement des paramètres de pipeline
- Tableau récapitulatif de lecture croisée
Pour les projets au niveau de l'ARN, consultez notre Séquençage de l'ARN service. Pour un support d'analyse personnalisé, consultez notre Bioinformatique services.
Scénarios d'application
Ces scénarios d'étude aident à montrer comment les résultats de séquençage et de biodistribution peuvent être combinés lorsque la question de recherche nécessite plus d'une couche de preuve.
Tropisme tissulaire des AAV et biodistribution des vecteurs
Les études sur les AAV nécessitent souvent de comparer les tissus cibles avec les tissus non cibles après une administration in vivo. En fonction de l'objectif, le projet peut combiner des lectures de biodistribution avec Analyse du site d'intégration AAV ou séquençage lié au génome AAV.
Évaluation du site d'insertion de vecteurs lentiviraux ou intégrants
Pour les systèmes lentiviraux, rétroviraux, de transposons ou d'autres systèmes pertinents à l'intégration, une analyse des sites d'intégration peut être nécessaire pour comprendre les emplacements d'insertion candidats. Cette analyse ne devrait être envisagée que lorsque la biologie du vecteur et la conception de l'étude le justifient.
Études sur la livraison non virale et la persistance des acides nucléiques
Pour les systèmes de délivrance basés sur des plasmides, des LNP ou des nanoparticules, l'étude peut se concentrer sur l'endroit où le matériel acide nucléique est détecté, si les régions cibles sont soutenues par le séquençage et si des lectures d'expression sont nécessaires.
Expression de transgènes et profilage de la réponse au niveau tissulaire
Lorsque la présence du vecteur seule n'est pas suffisante, l'analyse au niveau de l'ARN peut aider à montrer si l'expression du transgène ou la réponse au niveau tissulaire fait partie du package de données.
Références
- Développement et validation d'un essai de biodistribution de thérapie génique modèle pour AVGN7 utilisant la réaction en chaîne par polymérase à gouttelettes numériques.
- Virus adénovirus associé comme vecteur de livraison pour la thérapie génique des maladies humaines
- Caractérisation des vecteurs AAV : Une revue des techniques analytiques et des attributs de qualité critiques
- Une nouvelle approche pour quantifier la biodistribution et la transduction de la thérapie génique par virus adéno-associés en utilisant des vecteurs AAV radiomarqués chez les souris.
- Cartographie des profils de transduction dépendants de la voie d'administration des variants AAV couramment utilisés chez la souris par séquençage d'amplicons de code-barres.
- Auto-expansion des cellules souches hématopoïétiques transduites par HDAd in vivo par expression constitutive de tHMGA2
Résultats de la démo : à quoi pourrait ressembler votre paquet de données
Les résultats de la démonstration aident votre équipe à comprendre à quoi pourraient ressembler les résultats finaux. Les exemples ci-dessous sont des formats de résultats courants qui peuvent être inclus lorsqu'ils correspondent à la conception de l'étude.
Démonstration 1 : Profil de biodistribution des tissus
Un profil de biodistribution des tissus peut montrer comment le signal lié au vecteur est distribué à travers des tissus, groupes ou points temporels sélectionnés. Un tableau ou un graphique typique peut inclure l'ID de l'échantillon, le type de tissu, le groupe ou la dose, le point temporel, le signal cible, la sortie normalisée et le statut de contrôle qualité. Cette vue aide votre équipe à comparer les tissus cibles et non cibles en un seul endroit.
Démonstration 2 : Séquence vectorielle et confirmation de la région cible
Une sortie de confirmation de séquence peut indiquer si les lectures soutiennent la région vectorielle attendue, la région du transgène ou la séquence cible sélectionnée. Une vue de rapport typique peut inclure la région cible, le nombre de lectures ou le soutien des lectures, un résumé de la couverture, des notes sur l'appariement de séquence, des indicateurs de variantes ou d'incompatibilités le cas échéant, et des notes d'interprétation de la qualité.
Démonstration 3 : Sorties liées à l'expression et à l'intégration
Pour les projets qui incluent des questions liées à l'ARN ou à l'intégration, une sortie combinée peut montrer des motifs d'expression et des informations sur les insertions candidates. Une sortie typique peut inclure le groupe de tissus ou d'échantillons, le niveau d'expression du transgène, les marqueurs de réponse de l'hôte si inclus, l'emplacement de l'insertion candidate le cas échéant, l'annotation des caractéristiques génomiques, les informations de lecture de soutien et les commentaires de contrôle qualité.
FAQ : Planification d'un projet de séquençage de thérapie génique in vivo
1. Quel affichage devrais-je choisir en premier ?
Commencez par la question à laquelle vous devez répondre. Si vous avez besoin de la présence au niveau tissulaire, commencez par la biodistribution. Si vous avez besoin de soutien par séquence, ajoutez le séquençage ciblé ou par vecteur. Si vous avez besoin de preuves d'expression, ajoutez une analyse au niveau de l'ARN. Si les événements liés à l'insertion sont importants, une analyse du site d'intégration peut être utile.
2. Des échantillons de tissu, de sang, d'ADN et d'ARN peuvent-ils être inclus dans un même projet ?
Oui, mais ils peuvent nécessiter un traitement, des contrôles qualité et des flux de travail de séquençage différents. Nous examinons d'abord les types d'échantillons, puis nous alignons chaque groupe d'échantillons avec le bon résultat.
3. Quand le séquençage est-il plus utile que le qPCR ou le ddPCR seuls ?
Le séquençage est utile lorsque la détection liée à la copie n'est pas suffisante. Il peut ajouter un soutien à la région cible, des informations sur la séquence du vecteur, un profil d'expression, des preuves liées à l'intégration ou un contexte génomique plus large.
4. Pouvez-vous aider à la confirmation du génome AAV ?
Oui. Pour les travaux liés aux AAV, nous pouvons aider à évaluer si le séquençage du génome AAV ou le séquençage de la région cible convient au projet. La meilleure option dépend de la conception du vecteur, du type d'échantillon et de la question posée.
5. Quand l'analyse du site d'intégration doit-elle être envisagée ?
Considérez-le lorsque le système de livraison peut s'intégrer, lorsque les questions liées à l'insertion font partie de l'étude, ou lorsque des informations sur la localisation génomique sont nécessaires. Ce n'est pas nécessaire pour chaque projet de biodistribution.
6. Quelles informations devrais-je envoyer avant de demander un plan de projet ?
Les informations utiles incluent le type de vecteur, l'espèce, la liste des tissus, les points temporels, le format d'échantillon, la séquence cible, la carte de construction, les résultats souhaités et toutes les données de contrôle qualité existantes pour l'ADN ou l'ARN.
7. Quels résultats en bioinformatique peuvent être inclus ?
Selon le projet, les résultats peuvent inclure des résumés de contrôle qualité, des tableaux au niveau des tissus, un soutien de lecture pour les régions cibles, des matrices d'expression, des tableaux d'insertion candidats, des visualisations et des notes de rapport.
8. Cette solution peut-elle prendre en charge des conceptions multi-tissulaires et multi-temporelles ?
Oui. Les conceptions multi-tissulaires et multi-temporelles sont souvent bien adaptées à cette solution lorsque la qualité des échantillons, le regroupement et les objectifs de lecture sont planifiés avant le début du séquençage.
Publication client : Cas d'étude sur le séquençage des preuves dans une étude de thérapie génique in vivo
Cas de publication client
Journal : Thérapie Moléculaire : Méthodes et Développement Clinique
Publié : 2024
DOI : 10.1016/j.omtm.2024.101319
Contexte
Cette publication destinée aux clients a étudié une approche de thérapie génique par cellules souches hématopoïétiques in vivo conçue pour éviter la collecte, la manipulation et la transplantation de cellules ex vivo. Les auteurs ont construit des vecteurs HDAd5/35++ tropiques pour les CSH exprimant un gène HMGA2 tronqué et un gène rapporteur GFP. Un vecteur de transposase SB100x a médié l'intégration aléatoire du cassette de transgène.
L'étude est pertinente ici car elle montre pourquoi la recherche sur la thérapie génique in vivo peut nécessiter plus d'un type de preuve soutenue par le séquençage. Les auteurs ont examiné l'expansion cellulaire, l'implication des lignées, le comportement des sites d'insertion, la stabilité génomique et la validation chez des souris humanisées.
Méthodes
L'étude a mobilisé des HSC chez des souris en utilisant du G-CSF et de l'AMD3100/Plerixafor, suivie d'une injection intraveineuse d'un vecteur tHMGA2/GFP intégrant. Les auteurs ont suivi les cellules mononucléées du sang périphérique positives pour le GFP au fil du temps et ont évalué l'expansion des HSC ainsi que des populations de progéniteurs myéloïdes, lymphoïdes et érythroïdes dans la moelle osseuse et la rate.
Les méthodes liées au séquençage comprenaient l'analyse des sites d'intégration à l'échelle du génome et le séquençage de l'exome entier. Ces méthodes ont aidé les auteurs à examiner si l'expansion était polyclonale et si des indices d'instabilité génomique plus larges différaient entre les souris traitées et les souris témoins.
Résultats
Le document rapporte que les cellules mononucléées du sang périphérique positives pour la GFP ont montré une expansion lente mais progressive, atteignant environ 50 % à la semaine 44. Une expansion a également été observée chez les receveurs secondaires. Les auteurs ont signalé une expansion au niveau des HSC et à travers les populations de progéniteurs dans la moelle osseuse et la rate.
Figure 5 présente une analyse des sites d'insertion à l'échelle du génome par séquençage TRACE. La figure comprend des fragments d'ADN contenant des sites d'insertion uniques, des coordonnées d'insertion génomiques uniques, des logos de séquence autour des sites d'insertion, la distribution des régions géniques et une visualisation de l'emplacement des insertions au niveau des chromosomes.
Une observation clé de l'étude était que l'expansion était polyclonale, sans signes de dominance clonale basée sur l'analyse des sites d'intégration à l'échelle du génome. Le séquençage de l'exome entier n'a pas montré de différences significatives dans les indices d'instabilité génomique entre les souris tHMGA2/GFP et les souris témoins non traitées.
La figure 5 de la publication du client montre une analyse des sites d'insertion à l'échelle du génome dans une étude de thérapie génique HSC transduite par HDAd in vivo, aidant les lecteurs à comprendre comment les informations sur les sites d'insertion peuvent soutenir un ensemble de preuves de séquençage plus large.
Conclusion
Cette publication destinée aux clients montre pourquoi un plan de séquençage à plusieurs lectures peut être utile dans la recherche sur la thérapie génique in vivo. En fonction du système de vecteur et de l'objectif de l'étude, un projet peut nécessiter des preuves au niveau des tissus, une confirmation au niveau des séquences, des informations sur le site d'insertion, des données d'expression et un contexte génomique plus large.
Pour un projet de service, la leçon pratique est simple : définissez d'abord la question, puis construisez le plan de séquençage et de bioinformatique autour de cette question.
Référence
Publications clients associées
Les publications ci-dessous sont pertinentes pour les contextes de thérapie génique, de livraison de vecteurs, de séquençage ou de recherche sur les réponses immunitaires. Elles sont répertoriées comme des publications clients associées, et non comme des études de cas complètes.
| Publication | Journal / Année | Tag de service associé | Pourquoi c'est pertinent |
|---|---|---|---|
| Auto-expansion des cellules souches hématopoïétiques transduites par HDAd in vivo par expression constitutive de tHMGA2 | Thérapie Moléculaire : Méthodes et Développement Clinique, 2024 | Séquençage de l'exome entier, WES | Ajustement le plus proche pour le cas de publication client ; pertinent pour la thérapie génique in vivo et l'évaluation génomique. |
| L'édition de base in vivo sauve la DPCAD dans un modèle murin humanisé. | Nature Communications, 2025 | RNA-seq / Construction de bibliothèques RNA-seq et séquençage | Pertinent à l'édition de base délivrée par AAV in vivo et à l'analyse de l'édition d'ARN à l'échelle du transcriptome. |
| Les immunopéptidomes HLA de classe I des protéines de capside AAV | Frontières en immunologie, 2023 | Typage HLA | Pertinent à la recherche sur l'immunopeptidome des capsides AAV et au contexte de la réponse immunitaire liée à la délivrance de gènes. |
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