Directives de Soumission d'Échantillons
Le flux de travail complet pour le séquençage de l'eccDNA. En utilisant la technologie de séquençage génomique à faible couverture, ce processus permet l'extraction précise, la construction de bibliothèques et la détection bioinformatique des événements d'ADN circulaire extrachromosomique.Qu'est-ce que le séquençage d'eccDNA ?
L'ADN circulaire extrachromosomique (eccDNA) désigne des molécules d'ADN circulaires à double brin existant indépendamment des chromosomes canoniques. Ces structures varient en taille de dizaines de paires de bases (pb) à des millions de paires de bases (Mb). L'eccDNA est présent de manière ubiquitaire chez les organismes eucaryotes, y compris dans les tissus humains sains, les lésions néoplasiques et les échantillons de sang normaux.
Bien que les voies moléculaires précises restent incomplètement caractérisées, les recherches actuelles avancent quatre hypothèses principales : a) le modèle du cycle de rupture-fusion-pont (BFB), b) le modèle de chromothripsie, c) le modèle de translocation-délétion-amplification, d) le modèle d'épisome.
fig 1 : Mécanismes de formation de l'eccDNA. (Yiheng Zhao, et al., 2022)
L'eccDNA peut transporter divers composants génétiques, y compris des fragments de gènes, des séquences répétitives non codantes, des exons, des introns, des promoteurs et des amplificateurs. Grâce à la circularisation chimérique et à la réintégration dans le génome linéaire, l'eccDNA participe au remodelage génomique. Ses fonctions multifacettes peuvent réguler de manière critique l'expression des gènes, former des super-amplificateurs, s'engager dans des processus de réparation de l'ADN et contribuer à la pathogénie du cancer.
Le séquençage eccDNA de CD Genomics est une méthode à haut débit spécifiquement conçue pour identifier, caractériser et analyser les eccDNA existant indépendamment des chromosomes dans le noyau. Les eccDNA sont présents de manière ubiquitaire dans les tissus sains et malades, avec des rôles biologiques particulièrement significatifs dans le cancer, tels que la facilitation de l'amplification des oncogènes, l'amélioration de l'accessibilité de la chromatine et la participation aux réseaux de régulation génique. Cette technologie de séquençage fournit donc une approche technologique essentielle pour la caractérisation approfondie de la structure, des origines, des fonctions et des implications des eccDNA dans les maladies.
Stratégies de séquençage de l'eccDNA
Nous proposons plusieurs stratégies pour le séquençage d'eccDNA en fonction de vos besoins de recherche :
Options de service de séquençage d'eccDNA
Nous proposons trois principales options de séquençage d'eccDNA pour soutenir diverses applications de recherche :
Séquençage d'eccDNA pour des échantillons de tissu/cellules
Une eccDNA enrichie en colonne A&A｜Sensibilité de détection amplifiée par RCA｜Profilage complet alimenté par NGS
Séquençage d'eccDNA pour des échantillons de biopsie liquide
Flux de travail de bibliothèque optimisé pour la Tn5-transposase｜Détection d'eccDNA ultra-sensible｜Quantification préservant l'abondance d'origine｜Échantillon de sérum, plasma, urine, LCR, etc.
Séquençage de la méthylation de l'eccDNA pour des échantillons de biopsie liquide
Détection à double fonction (eccDNA + méthylation) | Efficacité d'échantillonnage (Tn5 + conversion enzymatique) | Précision à base unique (Résolution rentable)
Séquençage WGS standard vs. séquençage eccDNA
| Caractéristique | WGS standard (séquençage profond) | Séquençage d'eccDNA (Enrichi à faible couverture) | |
|---|---|---|---|
| Principe Fondamental | Séquences de tout l'ADN (linéaire + circulaire) sans distinction. | Enrichit l'ADN circulaire (élimine l'ADN linéaire) avant le séquençage. | |
| Sensibilité de détection | Faible. Ne détecte que les ecDNAs en grand nombre ou de grande taille (par exemple, dans le cancer). Manque les rares ou microDNAs. | Ultra-Haut. Détecte des quantités traces, des eccDNAs rares et des microDNAs (<1kb) que le séquençage génomique complet (WGS) ne parvient pas à identifier. | |
| Contexte de l'ADN linéaire | Élevé (>95%). La grande majorité des données est gaspillée sur des chromosomes linéaires. | Minimale. L'ADN linéaire est éliminé enzymatiquement, concentrant les lectures sur l'eccDNA. | |
| Efficacité des données | Faible. Nécessite une grande profondeur (30X-60X, >90 Go) pour "tomber par hasard" sur des cercles. | Élevé. Atteint une couverture profonde au niveau du cercle avec seulement 24 Go de données (passe-bas). | |
| Précision des points d'arrêt | Modéré. Difficile d'identifier les jonctions précises en raison du bruit de fond. | Précis. Un enrichissement élevé permet une identification claire des jonctions "tête-à-queue". | |
| Efficacité Coût | Coûteux pour la recherche sur l'eccDNA (paiement pour l'ensemble du génome). | Économique. Vous ne payez que pour les données circulaires pertinentes. | |
| Meilleure application | Profilage génomique général (SNVs, Indels) et détection de grandes CNV. | Recherche ciblée sur les eccDNA, découverte de biomarqueurs et études des mécanismes. |
Applications du séquençage de l'eccDNA
Notre séquençage d'eccDNA a de nombreuses applications dans divers domaines de recherche :
- Recherche sur le cancerÉtudier les altérations génétiques qui contribuent à la progression du cancer.
- Études de régulation géniqueComprendre comment l'eccDNA influence l'expression génique et les fonctions cellulaires.
- Maladie infectieuse: Enquêter sur les génomes viraux ou identifier l'ADN circulaire dans les agents pathogènes.
- Troubles génétiquesIdentifier des facteurs génétiques nouveaux contribuant aux maladies.
- Biologie agricole :Exploiter l'eccDNA ingénierie pour l'amélioration des cultures et la délivrance de gènes biotechnologiques.
- Biologie évolutiveÉtudier les variations génétiques entre différentes espèces.
Flux de travail du service de séquençage d'eccDNA
Chez CD Genomics, nous proposons un service de séquençage eccDNA fluide et complet, conçu pour garantir des résultats cohérents et de haute qualité. Notre flux de travail standardisé, de la soumission d'échantillons à la livraison des données, est conçu pour soutenir la reproductibilité, rationaliser la recherche et accélérer la découverte dans tous les types d'études génomiques.
Aperçu du flux de travail pour les services de séquençage d'eccDNA.
Analyse bioinformatique du séquençage d'eccDNA
CD Genomics propose des services complets et flexibles. services d'analyse en bioinformatique, allant du traitement de données de base à des analyses personnalisées avancées. Nos solutions facilitent l'exploration approfondie des variations génomiques et de leurs fonctionnalités.
- Acquisition de données brutes et contrôle qualitéAcquisition de données de séquençage en paires, suivie d'une évaluation initiale de la qualité utilisant le seuil Q30.
- Prétraitement des donnéesLe découpage des adaptateurs et le filtrage des lectures de faible qualité ont été effectués à l'aide de cutadapt.
- Alignement de génomesAlignement des lectures propres traitées au génome de référence (HG38/hg38) en utilisant bwa.
- Détection d'eccDNADétection d'eccDNA dans tous les échantillons à l'aide de circle-map, en s'appuyant sur des signatures d'alignement (par exemple, alignements discordants, lectures soft-clipped) pour inférer l'existence de molécules circulaires et les positions des points de rupture.
- Comptage des lectures soft-clippéesQuantification des lectures brutes soft-clipped aux jonctions de rupture en utilisant samtools.
- Filtrage différentiel des eccDNANormalisation via edgeR, suivie de l'identification de l'ADN circulaire exprimé de manière différentielle sur la base des seuils de p-value et de changement de fold.
- Annotation d'eccDNAAnnotation génomique des caractéristiques de l'ADN circulaire à l'aide de bedtools.
- Analyse d'enrichissement fonctionnelAnalyse d'enrichissement de l'ontologie génique (GO) des gènes associés à l'ADN circulaire exprimé différemment.
- Analyse de méthylation (optionnelle)Évaluation statistique des niveaux de méthylation de l'eccDNA.
- Rapports personnalisésDes résumés personnalisés présentant des données analysées dans un format clair et exploitable.
Exigences d'échantillon pour le séquençage d'eccDNA
| Type de séquençage | Exigences d'échantillon |
|---|---|
| Cellules | 2× 10⁷ cellules |
| Tissu | 200 mg |
| ADN | ≥10μg, Dissous dans de l'eau sans nucléase ou dans un tampon TE (pH 8,0) ; 260/280 = 1,7–2,0 ; Absence d'ARN, de contamination inter-espèces ou inter-individus. |
| Sérum | 5 mL |
| Plasma | 5 mL |
| Urine | 5~10mL |
| Liquide céphalorachidien |
|
- Si vous souhaitez traiter d'autres types d'échantillons, veuillez nous contacter.
Pourquoi choisir CD Genomics pour le séquençage d'eccDNA ?
Des plateformes de séquençage avancées à la livraison de données de haute qualité, CD Genomics propose une solution eccDNA efficace et complète adaptée à divers besoins de recherche. Notre équipe garantit des résultats fiables avec un soutien flexible.
- ExpertisePlus de 10 ans d'expérience dans le séquençage et l'analyse de l'ADN.
- Technologie de pointeNous utilisons les dernières plateformes de séquençage et les outils de bioinformatique.
- Résultats fiablesNotre contrôle qualité rigoureux garantit des données hautement précises et reproductibles.
- Service flexiblePrend en charge tout, des échantillons uniques au traitement parallèle multi-projets à haut débit.
Références :
- Møller, Hans D., et al. "Les éléments d'ADN circulaire d'origine chromosomique sont courants dans les tissus somatiques humains sains." Communications Nature 9 (2018) : 1069. https://doi.org/10.1038/s41467-018-03369-8
- Deshpande, Vineet, et al. "Exploration du paysage des amplifications focales dans le cancer à l'aide d'AmpliconArchitect." Communications Nature 10 (2019) : 392. https://doi.org/10.1038/s41467-018-08200-y
- Mann, Lena, et al. "ECCsplorer : un pipeline pour détecter l'ADN circulaire extrachromosomique (eccDNA) à partir des données de séquençage de nouvelle génération." BMC Bioinformatique 23 (2022) : 40. https://doi.org/10.1186/s12859-021-04545-2
- Zhao, Yiheng, et al. "ADN circulaire extrachromosomique : État actuel et perspectives futures. eLife 11 (2022) : e81412. https://doi.org/10.7554/eLife.81412
- Yang, Zhenzhen, et al. "ADN circulaire extrachromosomique : biogenèse, structure, fonctions et maladies." Transduction du signal et thérapie ciblée 7 (2022) : 342. https://doi.org/10.1038/s41392-022-00978-7
- Hung, King L., et al. "Hérédité coordonnée des ADN extrachromosomiques dans les cellules cancéreuses. Nature 635 (2024) : 201–210. https://doi.org/10.1038/s41586-024-07861-8
Démonstration
Résultats d'analyse issus du séquençage d'eccDNA montrant la distribution des longueurs, les caractéristiques des eccDNA, et les événements d'eccDNA différentiels, avec des régions associées aux gènes et répétitives.
FAQ
- Puis-je utiliser des échantillons FFPE pour le séquençage de l'eccDNA ?
Oui, mais avec des réserves. L'ADN FFPE est souvent fragmenté, ce qui peut affecter la récupération et la sensibilité de détection de l'eccDNA, en particulier pour les cercles plus grands. Les tissus congelés frais sont fortement préférés. Nous optimisons les protocoles pour le FFPE, mais les résultats peuvent varier. Contactez-nous pour discuter de la faisabilité.
- Quels outils de bioinformatique utilisez-vous principalement pour la détection des eccDNA ?
Nous utilisons une combinaison d'algorithmes établis (comme Circle-Map, AmpliconArchitect) et d'outils propriétaires optimisés pour la sensibilité et la spécificité. Notre pipeline se concentre sur les preuves de lecture jonctionnelle et les motifs de cartographie spécifiques aux cercles pour minimiser les faux positifs.
- CD Genomics aide-t-il à la validation fonctionnelle en aval de l'eccDNA identifié ?
Bien que notre service principal soit le séquençage et la bioinformatique, nous proposons également des services de validation tels que FISH, PCR inverse, PCR digitale par gouttelettes et séquençage Sanger.
- Comment garantissez-vous la spécificité de votre enrichissement en eccDNA ?
Notre protocole optimisé combine la digestion par exonuclease dépendante de l'ATP (dégradant l'ADN linéaire) avec une sélection de taille basée sur des colonnes, adaptée pour enrichir les molécules d'ADN circulaires. Nous effectuons des contrôles qualité rigoureux pour confirmer l'efficacité de l'enrichissement.
- La séquençage d'eccDNA peut-il détecter d'autres variations structurelles (SV) ?
Oui, l'analyse identifie intrinsèquement les points de rupture et les variations structurelles présentes au sein des eccDNA eux-mêmes. Cependant, elle est spécifiquement optimisée pour les structures circulaires et peut ne pas capturer tous les SV linéaires à l'échelle du génome aussi efficacement que l'appel SV dédié du WGS.
Étude de cas : Validation de l'eccDNA en tant que biomarqueur diagnostique pour la progression du cancer colorectal
TitreADN circulaire extrachromosomique comme nouveau biomarqueur de la progression du cancer colorectal
JournalMédecine moléculaire
Facteur d'impact6,4 (2024)
Publié: 2025
DOI10.1186/s10020-025-01164-y
Contexte
Le diagnostic précoce du cancer colorectal (CCR) présente des défis significatifs. La coloscopie, bien qu'efficace, est invasive, et les tests de sang occulte dans les selles (TSOS) manquent souvent de sensibilité et de spécificité suffisantes. De plus, les biopsies liquides d'ADN tumoral circulant (ctDNA) rencontrent des taux de capture faibles, limitant leur fiabilité diagnostique. Dans ce contexte, l'ADN circulaire extrachromosomique (eccDNA) a émergé comme un nouveau biomarqueur prometteur. L'eccDNA apparaît lors des premières étapes de la tumorigenèse, et son abondance est corrélée à la progression du cancer, ce qui en fait un outil potentiellement précieux pour la détection précoce du CCR.
Objectifs du projet
- Caractériser les changements dynamiques de l'eccDNA tout au long de la progression du CRC (du tissu sain au polype, à l'adénome et au carcinome).
- Évaluer le potentiel de l'eccDNA en tant que biomarqueur diagnostique précoce pour le CRC.
Matériaux et Méthodes
Collecte d'échantillons
- Échantillons cliniques : Tissus épithéliaux intestinaux humains sains (n=5) ; Tissus de patients atteints de CRC : Polypes (n=17), Adénomes (n=14), Tumeurs (n=29), Tissus normaux adjacents (n=5).
- Modèles animaux : modèles de CRC chez la souris induits par AOM/DSS aux points temporels de 0, 5, 8 et 11 semaines.
Préparation et séquençage des acides nucléiques
- Extraction d'ADN, déplétion d'ADN linéaire, amplification par cercle roulant (RCA), préparation de bibliothèque d'ADN.
- Extraction d'ARN, préparation de bibliothèque d'ARN.
- Séquençage sur Illumina NovaSeq™ 6000 (PE150).
Analyse bioinformatique
- Filtrage et alignement des données.
- identification, annotation et calcul de l'abondance de l'eccDNA.
- Analyse RNA-seq : Analyse d'expression différentielle.
- Corrélation entre l'eccDNA et l'expression génique, analyse des voies KEGG/GO.
Expériences de validation
- PCR spécifique à un point de rupture : Validation des structures circulaires eccDNA candidates.
- Validation du modèle animal : Changements dynamiques d'eccDNA dans les modèles murins AOM/DSS.
Principales conclusions
1.Accumulation progressive d'eccDNAL'abondance augmente avec la progression du CRC (carcinome > adénome > polype > normal).
2.Transport de gènes associés au cancerLes eccDNA contiennent des gènes enrichis dans des voies tumorales (par exemple, la récupération des nucléotides et la signalisation EGFR).
3.Modèle de diagnostic haute performanceUn classificateur de forêt aléatoire utilisant 10 gènes liés à l'eccDNA (TAFA5/ADA/CRISPLD2) a atteint une AUC de 0,91 pour distinguer les lésions précancéreuses des tumeurs.
4.Mécanisme de formation73 % des points de rupture d'eccDNA contiennent des répétitions directes ou inversées (eccDNA DR/RR), facilitant la circularisation.
Chiffres référencés
Implications
- Potentiel de détection précoceDes niveaux élevés d'eccDNA dans les stades précancéreux soutiennent son utilité en tant qu'outil de biopsie liquide.
- Supériorité techniqueLa structure circulaire stable de l'eccDNA permet une enrichment et une détection plus efficaces par rapport à l'ADNct.
- Traduction cliniqueFondation pour des kits de dépistage du CRC basés sur l'eccDNA (par exemple, biomarqueurs TAFA5/CRISPLD2).
Référence :
- Qiu, Quanpeng, Yi Ding, Xiaolong Guo, Jing Han, Jiaqi Zhang, Yaping Liu, Junjun She et Yinnan Chen. "ADN circulaire extrachromosomique comme biomarqueur novateur pour la progression du cancer colorectal."Médecine Moléculaire 31.123 (2025)." Désolé, je ne peux pas accéder au contenu des liens.
