Séquençage d'Amplification Quantitative Absolue 16s/18s/ITS

L'introduction de la séquençage d'amplicons pour la quantification des microorganismes

Séquençage du gène 16S rRNA est couramment utilisé pour l'identification, la classification et la quantification des microbes au sein de mélanges biologiques complexes. En bref, les régions hypervariables de l'ADNr 16s chez les procaryotes sont amplifiées par PCR. Ensuite, les amplicons sont séquencés sur séquençage à haut débit plateforme. L'analyse des données de ces régions hypervariables uniques est effectuée pour déterminer l'abondance relative de chaque taxon dans une communauté et pour comparer le profil taxonomique entre les groupes d'intérêt. Ce niveau d'analyse peut aider à évaluer les changements dans le profil microbien global au fil du temps ou entre les groupes de traitement. Cette méthode joue donc un rôle crucial dans l'étude de la composition et des changements dynamiques des microbiomes dans des échantillons environnementaux complexes.

Figure 1. Les régions et les amorces de l'ARNr 16S.

Récemment, le problème de quantification absolue d'un certain groupe de micro-organismes dans un échantillon environnemental spécifique a suscité de plus en plus d'attention. Dans le passé, il était détecté par quantification absolue de qPCR d'espèces spécifiques, mais les résultats de qPCR sont souvent instables, et des amorces spécifiques pour le qPCR d'espèces spécifiques doivent être conçues et nécessitent une spécificité d'amorce plus élevée. Actuellement, le général Séquençage de l'ARNr 16S La méthode ne peut obtenir des données d'abondance relative que par le rapport entre le nombre de séquences d'un certain OTU et le nombre total de séquences.

La génomique CD peut fournir une quantification des microorganismes par séquençage d'amplicons basé sur des séquences de standards externes 16S afin d'obtenir des données d'abondance absolue pour les espèces dans l'échantillon. La bibliothèque d'amplicons 16S est construite et séquencée en ajoutant une séquence synthétique de nombre de copies connu à l'ADN de l'échantillon, puis une courbe standard est tracée en fonction du nombre de lectures d'amplicons et du nombre de copies absolu de la séquence standard externe. Enfin, le nombre de copies absolu du gène 16S rRNA de l'espèce correspondante de la séquence représentative de l'OTU dans l'échantillon est calculé.

Avantages du séquençage d'amplification quantitative absolue 16s/18s/ITS

• La mise en œuvre pratique est simplifiée, avec un débit plus élevé et une applicabilité plus large ;
• Il peut réduire efficacement l'impact de facteurs tels que l'amplification PCR et le séquençage sur l'analyse quantitative des communautés bactériennes dans les échantillons ;
• Il peut refléter avec précision la composition exacte des communautés bactériennes au sein des échantillons, fournissant des références de données plus précises pour la recherche.

Application de séquençage d'amplification quantitative absolue 16s/18s/ITS

Le séquençage d'amplicons 16S quantitatif absolu offre un moyen plus précis de retracer la véritable composition des communautés microbiennes au sein des échantillons. Son application va au-delà des méthodes de détection conventionnelles, englobant divers aspects tels que :

• distribution et dynamique bactériennes,
• métabolisme fonctionnel,
• ainsi que des aperçus écologiques et évolutifs sur les populations bactériennes.

Flux de travail de séquençage d'amplification quantitatif absolu 16s/18s/ITS

Le processus analytique commence par la récupération d'échantillons et l'extraction de l'ADN microbien, suivie de la construction de bibliothèques amplifiant des régions ciblées comme les gènes 16S/18S rRNA ou les régions ITS, menant à la formation de bibliothèques de séquençage. Par la suite, un séquençage à haut débit des amplicons est effectué. La phase suivante implique une analyse de données complète englobant la vérification de la qualité des données de séquençage, le regroupement ou le débruitage des séquences pour la création d'OTUs ou d'ASVs, l'allocation taxonomique et la quantification précise des espèces microbiennes.

Spécifications du service

	Exigences d'échantillon Type d'échantillon : échantillons de sol réguliers et échantillons de selles, d'autres types d'échantillons doivent être évalués. Sol ≥ 5 g ; Selles ≥ 2 g Quantité d'ADNg : > 500ng ; concentration d'ADNg ≥ 20ng/μL Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégie de séquençage Région recommandée : V3/V4/V3+V4/V4+V5 MiSeq PE250/PE300, HiSeq PE150 ou MGI DNBSEQ-T7/DNBSEQ-G400 ≥ 15W lectures par échantillon
	Analyse bioinformatique Filtrage Contrôle de qualité des données de séquençage Assemblage de lectures, obtenir des tags uniques. Génération d'OTU et analyse statistique Quantification des OTU Analyse de la composition des espèces Analyse de la diversité alpha Analyse de la diversité bêta Statistiques sur la diversité …… Bioinformatique avancée : Méta-analyse Intégration multi-omiques Algorithmes de regroupement …… Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage d'amplification 16s/18s/ITS quantitatif absolu pour votre rédaction (personnalisation)

Les résultats partiels sont affichés ci-dessous :

La distribution taxonomique de tous les échantillons au niveau de classification du Phylum.

Chaleur de l'abondance des espèces.

Courbe de raréfaction des lectures séquencées pour les échantillons (La figure ci-dessus) et la profondeur des échantillons de séquençage (La figure ci-dessous).

Analyse des boxplots basée sur Bray-Curtis (A), Jaccard binaire (B), Unifrac non pondéré (C) et Unifrac pondéré (D).

Analyse PCoA basée sur Bray-Curtis (A), Jaccard binaire (B), Unifrac non pondéré (C) et Unifrac pondéré (D).

Arbre de regroupement UPGMA.

Proportion moyenne du groupe traité et du groupe témoin.

Cladogram.

SCORE LDA.

1. En quoi le séquençage d'amplicons quantitatif absolu diffère-t-il du séquençage d'amplicons traditionnel ?

Traditionnel séquençage d'amplicons fournit des données d'abondance relative, ce qui peut être trompeur car cela ne tient pas compte des variations de la charge microbienne totale entre les échantillons. Le séquençage d'amplicons quantitatif absolu utilise des standards internes ou externes pour fournir des comptes absolus des taxons microbiens, offrant une image plus précise de la structure de la communauté microbienne.

2. Quels types d'échantillons sont adaptés à l'analyse utilisant le séquençage d'amplicons quantitatif absolu ?

Cette méthodologie est polyvalente et peut être efficacement utilisée sur une multitude de types d'échantillons, y compris le sol, l'eau, l'air, les tissus humains et animaux, les spécimens végétaux, ainsi qu'une variété de matrices environnementales et industrielles.

3. Quelle est l'unité de mesure pour la quantification absolue dans le séquençage des amplicons 16S ?

L'unité de mesure pour la quantification absolue peut être soit des copies de 16S/g d'échantillon, soit des copies de 16S/ng d'ADN. Cependant, l'utilisation de copies de 16S/g d'échantillon est généralement plus précise et préférable. Cette approche tient compte des variations dans la quantité de matériel de départ, ce qui conduit à des résultats plus fiables et interprétables dans l'analyse des communautés microbiennes.

4. Qu'est-ce que les OTUs et les ASVs ?

Les Unités Taxonomiques Opérationnelles (UTO) servent de clusters consolidés de séquences similaires, délimités en fonction d'un seuil de similarité prédéfini, souvent fixé à 97 %. En revanche, les Variantes de Séquence d'Amplicon (VSA) représentent des séquences d'une précision maximale au niveau du nucléotide unique ; elles sont dérivées via des algorithmes de débruitage, incarnant ainsi des variantes de séquence distinctes.

5. Quels sont les avantages de l'intégration de l'analyse de quantification absolue avec la métabolomique ?

L'analyse de quantification absolue fournit l'abondance absolue des espèces, tandis que les techniques de métabolomique actuelles, telles que la métabolomique ciblée et non ciblée, donnent les concentrations absolues des métabolites. L'intégration des données du microbiome et du métabolome implique généralement de corréler les abondances relatives des espèces avec les concentrations absolues des métabolites, ce qui peut conduire à des conclusions erronées. Par conséquent, il est fortement recommandé de baser les analyses de corrélation ultérieures sur les abondances absolues des espèces et les concentrations absolues des métabolites. Cette approche permet d'obtenir des résultats plus précis et fiables.

Une communauté synthétique dérivée du rhizosphère de pastèque greffée offre une protection pour la pastèque non greffée contre Fusarium oxysporum via des effets synergiques microbiens

Journal : Microbiome
Facteur d'impact : 16,837
Publié : 05 juin 2024

Contexte

La recherche a mis en évidence le rôle significatif des communautés microbiennes de la rhizosphère dans la santé et la croissance des plantes. Des stratégies telles que la culture de cultures résistantes et la transplantation de microbiote de rhizosphère (RMT) sont reconnues comme des outils efficaces pour la gestion des maladies des plantes. Des études récentes ont souligné le concept de "microbiome central" dans les rhizosphères des plantes, comprenant des espèces microbiennes étroitement liées à la plante hôte dans divers environnements. L'émergence de communautés synthétiques (SynComs) offre une approche novatrice pour améliorer la santé des plantes dans des environnements non stériles. Cette étude visait à examiner l'impact des communautés microbiennes de la rhizosphère de pastèques greffées sur la résistance aux maladies et à évaluer l'efficacité des SynComs dans la promotion de la santé des plantes. De plus, elle a développé une méthodologie efficace pour construire et simplifier des SynComs fonctionnels basés sur les interactions synergiques entre les membres de la communauté.

Méthodes

Résultats

Les effets protecteurs du SynCom ont été étudiés en comparant les compositions des communautés microbiennes de la rhizosphère et les profils métagénomiques entre différents groupes de traitement. L'inoculation du SynCom a normalisé la diversité microbienne en réponse à l'infestation par des pathogènes, avec des augmentations notables des abondances relatives de genres bénéfiques tels que Pseudomonas et Streptomyces. De plus, l'inoculation du SynCom a conduit à des réseaux microbiens plus complexes avec une stabilité améliorée et une cohésion communautaire renforcée, facilitant potentiellement la résistance aux maladies.

Fig 1. Changements dans la composition de la communauté microbienne du rhizosphere et le profil fonctionnel des plantes inoculées avec SynCom.

L'analyse métagénomique a révélé des propriétés fonctionnelles distinctes déclenchées par le SynCom dans la communauté rhizosphérique. Des différences significatives dans l'abondance des voies KEGG ont été observées entre les groupes traités par le SynCom et les groupes témoins, avec des voies enrichies liées au système à deux composants et à la formation de biofilm. En particulier, Pseudomonas a montré une augmentation remarquable de son abondance après l'inoculation par le SynCom, démontrant une colonisation efficace et une corrélation négative avec les pathogènes de la rhizosphère. Une analyse plus approfondie a mis en évidence l'enrichissement de gènes associés à la voie de formation de biofilm de Pseudomonas, provenant principalement des membres du SynCom, suggérant un rôle clé de Pseudomonas dans la suppression des maladies et la promotion de la croissance des plants de pastèque.

Les interactions synergiques entre les membres de SynCom et Pseudomonas contribuent à la croissance et à la colonisation de Pseudomonas dans la rhizosphère, améliorant ainsi la croissance des plantes. L'analyse du potentiel compétitif et des interactions entre les souches principales a révélé une faible compétition et des corrélations positives. Des expériences de co-culture in vitro ont démontré que certaines souches de SynCom favorisaient la croissance d'autres, avec des analyses métabolomiques identifiant des métabolites potentiels de cross-feeding. Dans l'ensemble, ces résultats soulignent l'importance de la facilitation métabolique dans la promotion de la coopération synergique entre les membres de SynCom et Pseudomonas.

Fig 2. Matrice d'interaction in vitro et profils de déplétion de substrat entre les souches individuelles de SynCom.

Conclusion

Cette étude révèle que les bactéries de la rhizosphère essentielles des plants de pastèque greffés forment un SynCom, contrôlant efficacement les maladies et favorisant la croissance des plants non greffés. L'augmentation de l'abondance de Pseudomonas et l'amélioration de la formation de biofilm suggèrent son rôle central dans la santé des plantes. Des essais in vitro démontrent une facilitation métabolique entre les membres du SynCom et Pseudomonas, conduisant à un SynCom simplifié avec des effets promoteurs de croissance conservés. Cela met en évidence le potentiel des SynComs dans la protection des plantes contre les stress biotiques, soulignant l'importance de comprendre et de manipuler les interactions microbiennes dans la rhizosphère pour une gestion écologique de la santé des plantes.

Référence

1. Qiao Y, Wang Z, Sun H, et al. Une communauté synthétique dérivée du rhizosphère de pastèque greffée offre une protection pour la pastèque non greffée contre Fusarium oxysporum via des effets synergiques microbiens. Microbiome, 2024, 12(1) : 101.