ddRAD-seq

Avec l'expertise approfondie de CD Genomics dans séquençage de nouvelle génération (NGS)Nous sommes désormais ravis d'offrir des services de séquençage d'ADN associé aux sites de restriction Double Digest (ddRADseq) pour une découverte complète de SNP à l'échelle du génome, même en l'absence d'informations sur la séquence génomique préalable. Le ddRADseq facilite le séquençage de données à l'échelle du génome provenant d'espèces non modèles, permettant le développement rentable de vastes ensembles de données englobant un large échantillonnage taxonomique et géographique.

Qu'est-ce que le séquençage ddRAD ?

Le ddRADseq a gagné une popularité considérable parmi les écologistes moléculaires pour le développement de nouveaux marqueurs SNP utilisant des plateformes NGS. Cette méthode tire parti de la spécificité des sites de coupure des enzymes de restriction pour générer des fragments de bibliothèque à partir de régions génomiques distinctes qui sont conservées chez les individus de la même espèce. Cette conservation permet le séquençage et l'analyse comparative de régions génomiques identiques chez différents individus. Par conséquent, le ddRADseq facilite le développement rapide et efficace d'un nombre substantiel de marqueurs génétiques.

Quel est le principe du séquençage ddRAD ?

ddRADseq est une variation améliorée de la méthode traditionnelle. Séquençage RAD protocole, spécifiquement conçu pour la découverte de SNP et génotypageAu lieu de la fragmentation par cisaillement, le ddRAD-seq incorpore une digestion par restriction secondaire, ce qui améliore à la fois la réglabilité et la précision de l'étape de sélection de taille. En résumé, le processus commence par la digestion de l'ADN génomique à l'aide d'une enzyme de restriction, suivie de la ligation d'un adaptateur P1 barcodé aux fragments résultants. Ces fragments ligaturés avec l'adaptateur provenant de divers échantillons sont ensuite regroupés, et une seconde enzyme de restriction est appliquée pour une digestion supplémentaire. Les fragments digérés sont ensuite soumis à une sélection de taille et à une purification. Par la suite, des amorces P2 sont ligaturées, et les fragments sont amplifiés. Enfin, les données de séquence sont analysées pour évaluer et noter les variations génétiques au sein des échantillons d'intérêt.

Quels sont les avantages du service de séquençage ddRAD ?

• Réutilisabilité des échantillons : Plusieurs échantillons peuvent être réutilisés, maximisant ainsi l'efficacité des ressources.
• Flux de travail efficace : Le processus de préparation de la bibliothèque est plus simple et plus rapide, rationalisant l'ensemble de la procédure expérimentale.
• Longueur de fragment cohérente : Assure des longueurs de fragment uniformes entre les échantillons aux sites de digestion identiques, améliorant ainsi la précision.
• Flexibilité de la densité SNP : Offre une flexibilité dans la densité SNP, permettant une personnalisation en fonction des besoins de recherche spécifiques.
• Couverture de séquence élevée : atteint une couverture de séquence élevée, améliorant la fiabilité des données.
• Rapport coût-efficacité : Réduit les coûts expérimentaux tout en maintenant une production de données robuste.
• Aucun génome de référence requis : permet la découverte de SNP sans avoir besoin d'un génome de référence.
• Plateforme multi-technologies avancée : Fournit des résultats de données fiables, répondant à la fois aux exigences de fiabilité et de rentabilité.
• Support technique : Des services de support complets répondent à tous les besoins du projet, garantissant la satisfaction du client.
• Processus expérimental rationalisé : Simplifie le processus expérimental et garantit un retour rapide. Des projets multi-loci peuvent être réalisés dans des tests multiplex avec typage effectué dans un seul tube.
• Mises à jour de projet en temps réel : Offre des mises à jour sur l'avancement du projet en temps réel, permettant aux clients de suivre clairement chaque étape.
• Protocoles personnalisés : Flexibilité pour adapter les protocoles expérimentaux aux besoins spécifiques du projet, avec une personnalisation experte pour des résultats optimaux.

Applications du séquençage ddRAD

• Génétique des populations
• Études d'association à l'échelle du génome (GWAS)
• Biologie de la conservation
• Biologie évolutive
• Cartographie génomique
• Programmes d'élevage

Flux de travail de séquençage ddRAD

Le flux de travail du séquençage ddRAD chez CD Genomics implique plusieurs étapes clés :

Spécifications de service

	Exigences d'échantillon ADN génomique ≥ 300 ng, quantité minimale : 100 ng, concentration ≥ 10 ng/µL Les échantillons d'ADN doivent avoir un rapport OD260/280 aussi proche que possible de 1,8 à 2,0. Tout l'ADN doit être traité avec de l'ARNase et ne doit montrer aucune dégradation ni contamination. Remarque : Les montants d'échantillon sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégie de séquençage Illumina Hiseq, PE150 Profondeur de séquençage : au moins 1x (échantillons d'assemblage au moins 5x)
	Analyse bioinformatique Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Prétraitement des données Alignement de séquences Appel de SNP Détection de variantes Analyse génétique des populations Analyse d'association Remarque : Les sorties de données et les contenus d'analyse recommandés affichés sont à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails dans ddRAD-seq pour votre écriture (personnalisation)

CD Genomics propose un service complet de ddRAD-seq, prenant en charge tout, des contrôles de qualité de l'ADN initiaux à l'analyse détaillée des SNP. Nous offrons également des solutions personnalisées conçues pour répondre aux besoins spécifiques de votre projet. Pour plus d'informations ou pour discuter de vos exigences, veuillez contacter notre équipe.

Résultats de la démo

Les résultats partiels sont présentés ci-dessous :

FAQ sur ddRAD-seq

1. Combien de temps faut-il pour obtenir des résultats de ddRAD-seq ?

Le délai de traitement typique pour les résultats de ddRAD-seq varie en fonction de la taille et de la complexité du projet, mais se situe généralement entre 4 et 8 semaines.

2. Pouvons-nous personnaliser le service ddRAD-seq en fonction de besoins spécifiques ?

Oui, nous proposons des solutions sur mesure pour répondre aux exigences uniques des projets, y compris des ajustements de protocole personnalisés et des options d'analyse de données.

3. Quels types d'échantillons sont adaptés au ddRAD-seq ?

Le ddRAD-seq peut être appliqué à divers types d'échantillons, y compris le sang, les tissus et d'autres sources d'ADN génomique provenant de plantes, d'animaux et de micro-organismes.

4. Le ddRAD-seq peut-il être utilisé sans génome de référence ?

Oui, le ddRAD-seq ne nécessite pas de génome de référence, ce qui le rend adapté aux espèces pour lesquelles les génomes de référence ne sont pas disponibles.

5. Comment choisir la technologie de génome à représentation réduite appropriée ?

Lors de la sélection de la technologie génomique simplifiée appropriée, prenez en compte les quatre facteurs suivants pour concevoir votre stratégie de recherche :

Génome de référence

• Avec un génome de référence : L'utilisation d'un génome de référence aide à réduire les erreurs dues aux séquences homologues ou répétées, facilite l'analyse de la LD, l'analyse de sélection, et GWASCeci est adapté pour le conventionnel. Séquençage RAD et séquençage PE151.
• Sans génome de référence : le ddRAD-seq est recommandé.

Stratégie de séquençage

• Double Digest : Pour les fragments courts, le séquençage en paires (PE) peut entraîner un chevauchement significatif des adaptateurs et n'est pas idéal pour de longues longueurs de lecture ; le séquençage en simple sens (SE) est recommandé pour les fragments courts.
• Fragments longs : Les longues lectures peuvent détecter plus d'informations sur les variants mais nécessitent une couverture suffisante.
• Lectures courtes : Améliore la profondeur de séquençage par site de restriction, renforçant la précision de détection des SNP.
• Espèces non référencées : le séquençage SE est recommandé pour éviter le gaspillage de données.

Nombre de marqueurs

• Densité de marqueurs élevée : Le séquençage RAD conventionnel est adapté aux analyses nécessitant des marqueurs de haute densité.
• Génomes complexes et grandes tailles d'échantillons : GBS Le séquençage est idéal pour les génomes complexes et les grands volumes d'échantillons.

Artifacts d'amplification PCR

• Biais PCR : Peut entraîner une identification erronée des sites hétérozygotes comme homozygotes ou introduire des erreurs. Le séquençage RAD conventionnel peut éliminer les doublons PCR en utilisant les informations de séquence des fragments, tandis que le GBS et le ddRAD-seq ne le peuvent pas.

Études de cas ddRAD-seq

Le génotypage basé sur le séquençage ddRAD pour l'analyse de la structure des populations dans la tomate cultivée fournit de nouvelles perspectives sur la diversité génomique du germoplasme méditerranéen de type 'da serbo' à longue durée de conservation. Recherche en horticulture

Journal : Recherche en horticulture

Facteur d'impact : 5,404

Publié : 01 septembre 2020

Contexte

TomateSolanum lycopersicum L..) se présente comme une culture légumière économique vitale avec une culture mondiale. On peut retracer les débuts de la domestication de la tomate à la région andine d'Amérique du Sud, d'où elle s'est répandue à travers les Amériques. Au cours du 16ème siècle, les tomates ont été introduites en Europe, avec l'Espagne et l'Italie comme principaux points d'entrée. Cette introduction a suscité d'autres efforts de domestication, contribuant à l'émergence d'une diversité génétique locale substantielle. Par conséquent, le bassin méditerranéen en Europe est reconnu comme un centre secondaire pour la diversification des tomates. Dans le cadre de cette enquête, les auteurs ont utilisé la technologie ddRAD-seq pour explorer méthodiquement la diversité génétique présente au sein de diverses variétés de tomates.

Matériaux et Méthodes

Résultats

Dans cette enquête, la diversité génétique de 288 spécimens de tomates a été examinée, comprenant 152 échantillons de la variété à longue durée de conservation (LSL) 'da serbo', principalement originaires d'Italie et d'Espagne, ainsi que d'autres variétés communes provenant de divers pays. Au-delà de la caractéristique LSL, les variétés 'da serbo' présentent également des caractéristiques de tolérance au stress. Afin de réaliser un clustering hiérarchique non paramétrique et de modéliser la structure de population ancestrale, l'étude a identifié 32 799 polymorphismes mononucléotidiques (SNP) de haute qualité. Six sous-populations génétiques distinctes ont été délimitées, séparant efficacement la majorité des variétés 'da serbo', reflétant une sous-structure de population liée à la fois au type variétal et à l'origine géographique. Le déséquilibre de liaison (LD) a montré un déclin rapide sur une portée génomique de moins de 5 kb. L'examen des SNP présentant des allèles à faible fréquence (MAF) dans les matériaux 'da serbo' a révélé une mutation à haute fréquence dans des gènes associés à la tolérance au stress, tels que CTR1 et JAR1, qui sont impliqués dans la maturation des fruits. Enfin, en s'appuyant sur une sélection de 58 matériaux de base représentant une part significative de la diversité génétique, des traits essentiels ont été développés. Les signatures génétiques du germoplasme 'da serbo', cultivé avec sélection dans le bassin méditerranéen, sont révélées dans ce travail. De plus, il offre de nouvelles perspectives sur le germoplasme "da serbo" à longue durée de vie, l'établissant comme une riche source de gènes de tolérance au stress.

Fig. 1 Estimation de la diversité génétique dans 288 accessions de tomate utilisant ddRAD.

Fig. 2 Décroissance du déséquilibre de liaison (LD) et comparaison.

Fig. 3 Graphique de chargement des première (F1) et deuxième (F2) composantes principales montrant la variation des principales caractéristiques des fruits dans les accès du mini-noyau développé à partir des données SNP ddRAD de 288 génotypes de tomate cultivée.

Conclusion

En utilisant le ddRAD-seq et le dernier génome de tomate, les auteurs ont identifié 2 297 nouveaux gènes cibles avec des SNP dans le pool génétique méditerranéen 'da serbo'. Cette étude révèle une distinction géographique parmi les variétés méditerranéennes et met en évidence des SNP dans de nouvelles régions géniques liées aux voies de stress et d'hormones. Une collection mini-noyau de génotypes divers a été fournie pour l'élevage, offrant un réservoir génétique précieux pour de futurs programmes de sélection de précision et des études d'association à l'échelle du génome.

Référence

1. Esposito, S., Cardi, T., Campanelli, G. et al. Le génotypage basé sur le séquençage ddRAD pour l'analyse de la structure des populations dans la tomate cultivée fournit de nouvelles perspectives sur la diversité génomique du germoplasme méditerranéen de type 'da serbo' à longue durée de conservation. Recherche Horticole 7, 134 (2020).