Séquençage SMRT de PacBio

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Solutions de séquençage SMRT de PacBio

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CD Genomics propose un séquençage PacBio SMRT pour compléter notre installation NGS. En tirant parti de la séquençage à longue lecture et séquençage moléculaire unique capacité développée par PacBio, nous sommes fiers d'offrir un génome avancé de novo solutions d'assemblage et séquençage de gènes/transcrits en longueur complète stratégie adaptée à vos besoins de projet.

Introduction à la séquençage SMRT de PacBio

Le séquençage moléculaire en temps réel (SMRT) utilise une cellule de flux spécialisée avec des milliers de puits individuels de picolitres dotés de fonds transparents — des guides d'ondes à mode zéro (ZMW). La polymérase est fixée au fond du puits et permet à la chaîne d'ADN de progresser à travers le ZMW. En conséquence, le système peut se concentrer sur une seule molécule. Le séquençage SMRT permet l'imagerie en temps réel des nucléotides marqués par fluorescence qui sont synthétisés avec des molécules de modèle d'ADN individuelles. La réaction de séquençage se termine lorsque le modèle et la polymérase se dissocient. La longueur de lecture moyenne de l'instrument PacBio est d'environ 2 kb, et certaines lectures peuvent dépasser 20 kb. Des lectures plus longues sont particulièrement utiles pour de novo assemblages de nouveaux génomes qui peuvent couvrir beaucoup plus de répétitions et de bases.

Les éléments hautement répétitifs présents dans les génomes eucaryotes et procaryotes posent un défi pour l'assemblage des génomes et rendent l'étude détaillée des séquences répétitives difficile. Séquençage à long terme livre des lectures dépassant plusieurs ou des dizaines de kilobases (kbs), qui peuvent couvrir des régions complexes ou répétitives avec une seule lecture continue, permettant ainsi la résolution de ces grandes caractéristiques structurelles. En plus de séquences d'ADN considérablement plus longues et très précises provenant de molécules individuelles non amplifiées, cela peut également montrer où se trouvent les bases méthylées, fournissant ainsi des informations fonctionnelles sur les ADN méthyltransférases codées par le génome. Le séquençage PacBio SMRT présente des avantages uniques dans les études de de novo génomique, métagénomique, transcriptomique et épigénétique.

Avantages de notre service de séquençage PacBio SMRT

• Longueurs de lecture moyennes les plus longues
• Précision de consensus la plus élevée
• Couverture uniforme
• Caractérisation épigénétique simultanée
• Résolution à l'échelle d'une seule molécule
• Rapide et abordable

Application du séquençage SMRT de PacBio

• De haute qualité de novo assemblage de génome : l'avantage des longues lectures de PacBio en fait la technologie principale pour une qualité élevée de novo assemblage de génome. Ses longues lectures contiguës aident à surmonter des défis tels que les régions répétitives, le biais de composition des bases et les réarrangements structurels dans le génome.
• Exploration des régions génomiques : Le séquençage PacBio peut aider à explorer des régions génomiques auparavant difficiles à séquencer en raison de longues séquences répétitives, d'un fort biais de composition en bases ou de réarrangements structurels.
• Séquençage de transcrits Iso-SeqLa technologie Iso-Seq de PacBio est utilisée pour analyser des transcrits d'ARNm complets sans assemblage. Cela permet d'obtenir des informations sur le panorama de l'expression génique, en particulier pour les réarrangements complexes des transcrits.
• Séquençage d'amplicons longs : Le séquençage PacBio peut être utilisé pour séquencer de longs amplicons, adapté à la détection de longs fragments d'ADN tels que des amplicons de gènes en longueur complète et des réarrangements génomiques.
• Études sur les modifications de bases de l'ADN bactérien : La technologie de séquençage PacBio peut être utilisée pour étudier les modifications de bases de l'ADN bactérien, telles que l'adénine N6-méthylée (m6A) et la cytosine N4-méthylée (m4C), afin de comprendre leurs impacts sur des processus tels que l'expression génique, le silence génique et la réplication de l'ADN.
• Épigénomique Études : La technologie de séquençage PacBio SMRT (Single Molecule, Real-Time) présente une valeur d'application unique dans le domaine de l'épigénomique grâce à sa capacité à séquencer avec précision les modifications de méthylation de l'ADN directement sans conversion au bisulfite. Cela présente un potentiel significatif pour éclairer les orientations des études dans cette discipline, explorant ainsi les mystères des processus cellulaires complexes.
• Diversité et recherche fonctionnelle dans les communautés microbiennes : le séquençage PacBio SMRT offre des solutions aux défis du séquençage complet du génome des pathogènes et de l'identification taxonomique des microorganismes difficiles à cultiver. Sa capacité de séquençage à longues lectures permet une surveillance génomique complète des communautés microbiennes, fournissant ainsi des informations cruciales sur leur diversité et leurs rôles fonctionnels dans divers écosystèmes.

Nos services de séquençage SMRT PacBio

Nous utilisons les instruments avancés PacBio SMRT (PacBio SR II et PacBio Sequel) pour plusieurs objectifs de recherche, y compris le séquençage de génomes entiers. de novo assemblage de génomes, séquençage de cibles en longueur complète, études de métagénomique, séquençage de transcrits en longueur complète et analyse des modifications de l'ADN à l'échelle du génome. Notre équipe d'experts hautement expérimentés met en œuvre la gestion de la qualité à chaque étape pour garantir des résultats fiables et impartiaux.

• Séquençage métagénomique à lecture longue

  • Métagénomique, définit comme l'analyse génétique directe des génomes contenus dans un échantillon environnemental. Ce domaine a été initialement lancé par le clonage de l'ADN environnemental, suivi par des dépistages d'expression fonctionnelle et bientôt renforcé par le séquençage de l'ADN environnemental. Le séquençage métagénomique à longues lectures, réalisé par des plateformes telles que PacBio SMRT, permet l'analyse génétique directe de diverses communautés microbiennes extraites de différents échantillons environnementaux. Cette technologie facilite la génération de longueurs de lecture plus longues, triomphant ainsi des éléments répétitifs observés dans les génomes bactériens. Par conséquent, elle offre des aperçus complets sur les fonctionnalités microbiennes, les voies métaboliques et les relations intégrales qu'elles entretiennent avec leurs habitats.

    Les applications du séquençage métagénomique à longues lectures sont vastes et robustes, s'étendant à divers domaines tels que la science de l'environnement, la biologie médicale, l'agriculture ainsi que la biotechnologie. Ces applications offrent des avenues profondes pour comprendre la diversité inhérente aux communautés microbiennes, la dynamique des écosystèmes, les mécanismes des maladies et le processus de bioprospection. En conclusion, la technologie PacBio SMRT constitue un outil influent et puissant pour accélérer les progrès de la recherche et les applications pratiques dans une myriade de domaines académiques et industriels. La puissance de cette technologie continuera d'être élargie et affinée dans les années à venir.

• Génome complet bactérien de novo séquençage

  • Génome complet bactérien de novo le séquençage implique la reconstruction complète du plan génétique d'une bactérie, sans recourir à un génome de référence. Cette méthodologie permet une compréhension nuancée de la variabilité génétique bactérienne, des dynamiques évolutives et des composants fonctionnels, englobant des gènes clés impliqués dans la virulence, la résistance aux antimicrobiens et les réponses adaptatives aux signaux environnementaux. Le spectre des applications pour le génome complet bactérien de novo Le séquençage couvre divers domaines, allant de la microbiologie clinique, où il facilite le diagnostic rapide et la surveillance des maladies infectieuses et des épidémies, à la microbiologie environnementale, permettant l'exploration approfondie des consortiums microbiens et de leurs interactions écologiques.

    Le séquençage à molécules uniques en temps réel (SMRT) peut générer de longues longueurs de lecture (moyenne >15 000 pb, certaines séquences dépassant 100 000 pb) et se vante de la plus haute cohérence et précision. Cela rend le séquençage SMRT remarquablement utile pour de novo assemblage de génome. L'un des principaux avantages des longues lectures étendues de SMRT est la capacité à surmonter les obstacles souvent rencontrés dans la recherche génomique, tels que le biais GC et les taux de réplication élevés dans les génomes bactériens. Par conséquent, le séquençage SMRT aboutit souvent à l'assemblage de génomes bactériens en contigs uniques, contournant les régions d'ambiguïté et les multiples possibilités qui peuvent compliquer le processus d'assemblage.

• Génome complet fongique de novo séquençage

  • Les champignons occupent une niche essentielle au sein de la biosphère, exerçant des impacts profonds tant sur l'équilibre écologique que sur les affaires humaines, en raison de leurs ramifications médicales et économiques significatives. Déchiffrer le génome complet des champignons constitue une base solide pour les investigations mycologiques, favorisant des connaissances plus approfondies sur la biodiversité fongique, les dynamiques de croissance, les besoins nutritionnels, les attributs physiologiques, les fondements génétiques, les voies métaboliques et les rôles écologiques. Génome complet des champignons. de novo Le séquençage implique le déchiffrement méticuleux de l'ensemble du répertoire génétique d'un champignon, indépendamment de tout génome de référence. Cette approche fournit des perspectives holistiques sur la génomique fongique, les trajectoires évolutives et les attributs fonctionnels, englobant les gènes impliqués dans la pathogénie, l'adaptabilité environnementale et la biosynthèse de métabolites secondaires.

    Grâce à l'utilisation de lectures longues obtenues par séquençage en temps réel sur molécule unique (SMRT) avec le système PacBio, nous pouvons générer des données complètes. de novo assemblages pour les génomes fongiques. Ces assemblages atteignent ou approchent zéro lacunes ou erreurs basées sur N avec un N50 de contig >1 Mb et un degré de précision élevé de 99,999 %. Cette technique innovante représente un progrès significatif vers l'amélioration des études sur les génomes fongiques.

• Séquençage de transcriptions complètes (Iso-Seq)

  • Le séquençage de transcriptomes complets (Iso-Seq) se trouve à la pointe des techniques de biologie moléculaire, redéfinissant notre compréhension de l'expression génique. Contrairement aux méthodes conventionnelles Séquençage d'ARN Les méthodes, susceptibles de générer des séquences fragmentées, Iso-Seq capture des transcrits complets depuis l'initiation jusqu'à la terminaison. Cette capacité permet une identification et une quantification précises des isoformes alternativement épissées et des transcrits rares, offrant une représentation holistique du paysage transcriptomique.

    Grâce à la révélation des structures complètes des transcrits, l'Iso-Seq facilite la découverte de nouveaux gènes, isoformes et ARN non codants, dévoilant des territoires de régulation et de fonction des gènes jusqu'alors inexplorés. Ses applications polyvalentes couvrent divers domaines, englobant la biologie du développement, la recherche sur le cancer et les neurosciences, fournissant des aperçus indispensables sur les mécanismes complexes orchestrant les processus cellulaires.

    En comparaison avec la plateforme Illumina, les analyses PacBio sont capables de détecter facilement des molécules d'ARN multi-exoniques extrêmement longues, désignées comme des transcrits complexes, et mettent en évidence divers chevauchements transcriptionnels nouveaux entre des gènes parallèles adjacents et distants. Ce développement contribue à améliorer le potentiel d'exploration du contrôle intégré de l'expression génique et de la réplication à travers l'ensemble du réseau génomique.

• Séquençage du génome humain entier par PacBio SMRT

  • Les 15 et 16 février 2001, les revues Nature et Science ont respectivement publié les données de séquence complètes compilées par le Projet Génome Humain et le Projet Celera Genomics. Le séquençage du génome humain désigne le processus élaboré de cartographie de toutes les séquences d'ADN au sein du génome humain. L'objectif de cette entreprise est de décoder les composants, la structure et la fonctionnalité intégrés dans le génome humain, en plus de déchiffrer les corrélations entre les gènes humains, la santé et la maladie.

    Le séquençage du génome humain par PacBio SMRT représente une méthode de génomique à la pointe de la technologie, offrant des aperçus profonds sur la nature complexe du génome humain. Propulsée par la technologie de séquençage à molécule unique en temps réel (SMRT) de PacBio, cette approche avancée produit des lectures longues et précises, garantissant une exploration approfondie des segments génomiques avec une précision maximale. Grâce à sa capacité à capturer les variations structurelles, les séquences répétées et les régions génomiques complexes avec un détail remarquable, le séquençage PacBio SMRT permet aux chercheurs de déchiffrer la diversité génétique, les schémas évolutifs et les mécanismes de la maladie à un degré sans précédent. Son large éventail d'applications couvre divers domaines de recherche, englobant la génétique des populations, la médecine personnalisée et le diagnostic des maladies, favorisant ainsi des découvertes révolutionnaires en biologie humaine et en santé.

• Séquençage d'amplicons complets 16S/18S/ITS

  • Étant donné l'évolution de la technologie des séquenceurs, Séquençage des gènes d'ARNr 16S/18S/ITS est devenu l'outil optimal pour étudier la taxonomie bactérienne et fongique ainsi que l'évolution moléculaire. Contrairement aux méthodes de séquençage classiques à courtes lectures, qui produisent des séquences fragmentaires des gènes cibles, le séquençage d'amplicons en longueur complète capture la longueur totale des régions 16S, 18S ou ITS. Offrant une représentation plus précise de la diversité microbienne, il permet une catégorisation taxonomique précise et une identification des espèces. En sécurisant des séquences d'amplicons complètes, les chercheurs peuvent approfondir leur compréhension de l'écologie microbienne, de l'évolution et des interactions au sein d'écosystèmes complexes. De plus, le séquençage d'amplicons en longueur complète favorise la découverte de nouveaux taxa et de gènes fonctionnels, faisant ainsi progresser notre compréhension des communautés microbiennes et de leur rôle dans divers environnements.

• Analyse de Longs Amplicons (LAA)

  • L'analyse de longs amplicons (LAA) utilise la PCR et le séquençage en temps réel sur molécule unique (SMRT) pour produire des séquences d'ADN complètes, précises et phasées. Essentielle pour le séquençage d'histocompatibilité et la complémentation génique, la LAA est particulièrement précieuse dans les études immunologiques du complexe majeur d'histocompatibilité (MHC). Avec plus de 99,9 % de précision de lecture sur molécule unique provenant des séquences de consensus circulaires PacBio (CCS), la LAA soutient Typage HLA, haplotypage alternatif, et localisé de novo assemblages de gènes ciblés.

Exigences d'échantillon

Pipeline d'analyse

Notre pipeline de bioinformatique comprend de novo assemblage, détection de modification de base, génération de consensus à partir de molécules uniques, analyse de transcrits, analyse d'amplicons, alignement de séquences avec détection de variantes. Et d'autres analyses de données sont disponibles en fonction de vos besoins spécifiques.

Soutenu par nos scientifiques expérimentés et nos plateformes avancées, CD Genomics peut vous aider dans vos études sur génomique, transcriptomique, épigénomique, et la génomique microbienne. avec des longueurs de lecture inégalées, une couverture uniforme et une grande précision. Si vous avez des exigences supplémentaires ou des questions, n'hésitez pas à nous contacter.

Références :

1. Le site web de PacBio
2. Rhoads A, Au K F. Séquençage PacBio et ses applications. Génomique, Protéomique et Bioinformatique, 2015, 13(5) : 278-289.

1. Quelles sont les différences entre PacBio RS II et PacBio Sequel ?

Le système RS II a été lancé par PacBio en 2013, basé sur la technologie SMRT, dont la longueur de lecture moyenne atteint 10 kb avec la plus longue dépassant 20 kb. Sequel est la nouvelle plateforme de PacBio qui est également basée sur la technologie SMRT mais qui présente une augmentation significative du débit et de la qualité des données.

Tableau 1. La comparaison entre PacBio RS II et Sequel.

2. Qu'est-ce que la sélection de taille ?

PacBio permet le séquençage de bibliothèques d'ADNc de longueur complète à une résolution de molécule unique. Cependant, la plupart des transcrits mesurent entre 1 et 1,5 kb. Les transcrits plus longs sont difficiles à détecter en raison de leur faible abondance, du biais d'amplification et du chargement préférentiel de constructions SMRTbell plus petites. Par conséquent, la sélection de taille est un moyen puissant d'augmenter considérablement le nombre de transcrits > 1,5 kb. Cela est particulièrement essentiel pour les transcrits > 3 kb. En ce qui concerne les échantillons dégradés, le fractionnement n'est pas nécessaire, ce qui peut réduire encore la taille des inserts de la bibliothèque, et la sélection de taille est importante pour éliminer les fragments plus courts qui seront beaucoup moins bénéfiques pour l'assemblage. La sélection de taille peut être effectuée avec des gels d'agarose ou le système BluePippin. De plus, la sélection de taille peut être utilisée pour génome entier de novo séquençage.

3. Les exigences des échantillons d'ADN.

En général, les précautions suivantes doivent être prises lors de la soumission d'échantillons d'ADN :

• Assurez-vous de la purification et de l'intégrité des échantillons d'ADN.
• Évitez le dessèchement excessif de l'ADN.
• Évitez la visualisation par éthidium/UV lors de l'utilisation de la purification par gel.
• Évitez la surchauffe et le vortexage de l'ADN.
• Subir un minimum de cycles de gel-dégel.
• ADN double brin.

Tableau 2. Le rendement estimé et les quantités recommandées d'échantillons d'ADN.

4. Les exigences pour les échantillons d'ARN.

Veuillez fournir des échantillons d'ARN intégrés et purifiés (ARN ≥ 5 µg ; concentration ≥ 300 ng/µl) pour séquençage de transcrits complets.

Utilisation du séquençage PacBio pour étudier les effets du traitement avec des bactéries lactiques ou des antibiotiques sur l'endométrite chez les vaches.

Journal : Microbiome

Facteur d'impact : 16,837

Publié : 22 janvier 2021

Arrière-plans

Cet article examine les diversités intra-lignées des assemblages de bactérioplancton pélagiques dans 11 lacs d'eau douce profonds au Japon et en Europe. Malgré la nature cosmopolite des lignées de bactérioplancton dans les écosystèmes d'eau douce, leur microdiversité et leur phylogéographie demeurent floues. L'étude utilise le séquençage d'amplicons à lecture longue ciblant presque gènes 16S rRNA de pleine longueur et les séquences d'espaces transcrits internes ribosomiques adjacents pour combler ces lacunes dans la compréhension.

Méthodes

Résultats

1. Performance et limitations méthodologiques

L'étude évalue la performance et les limitations des plateformes de séquençage à longues lectures, en se concentrant sur la précision des lectures, le débit et les écarts de composition communautaire. Cibler les séquences du gène 16S rRNA et des ITS tout en excluant le gène 23S rRNA adjacent aide à maintenir la précision des lectures. La validation utilisant des SNP identifiés à partir des ASV et du mapping de lectures métagénomiques démontre une grande reproductibilité. Cependant, le faible débit de lecture entrave la performance de l'analyse, limitant les lectures assignées aux ASV et entravant les estimations de diversité alpha. La spécificité des amorces et la connectivité des opérons de gènes rRNA contribuent aux écarts de composition communautaire par rapport au séquençage à courtes lectures. Malgré ces limitations, le séquençage d'amplicons à longues lectures montre un potentiel pour le profilage phylogénétique à haute résolution des assemblages microbiens environnementaux.

Figure 1. Comparaison des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) attendus sur la base des variantes de séquence d'amplicon (ASV) et ceux détectés par le biais du mappage de lectures métagénomiques des séquences CL500-11 du lac Biwa.

Figure 2. Illustration schématique des discordances et des lacunes trouvées dans les séquences du gène 16S rRNA et de l'espaceur interne transcrit (ITS) de la lignée CL500-11.

2. Composition phylogénétique des amplicons à longues lectures

L'analyse a identifié 742 ASVs, révélant des populations diverses au sein de lignées avec une forte identité de séquence. Les phylums dominants variaient entre les échantillons de l'épilimnion et de l'hypolimnion. Une analyse plus approfondie s'est concentrée sur 11 OTUs appelées "lignées dominantes", représentant 85,4 % de l'abondance totale des lectures, à travers Chloroflexi, Alphaproteobacteria et Actinobacteria.

3. Microdiversité intra-lignée et motifs phylogéographiques parmi les lacs

L'étude examine la microdiversité intra-lignée et les schémas phylogéographiques parmi les communautés de plancton bactérien dans les lacs d'eau douce. En analysant des séquences de gènes 16S rRNA presque complètes, elle révèle des communautés diverses au sein d'une forte similarité de séquence. Les lignées dominantes présentent des degrés variés de microdiversité, avec quelques ASV dominant chaque échantillon. L'analyse de clusters basée sur la composition des ASV montre l'influence de la région et de l'environnement sur la structure des populations. La migration entre les lacs est limitée par la distance, mais les facteurs environnementaux et la dérive génétique jouent également des rôles significatifs. L'analyse temporelle indique une stabilité au fil du temps, avec des ASV dominants partagés sur différentes années dans le lac Biwa, suggérant une cohérence temporelle. Cependant, une enquête plus approfondie à travers les saisons et les années est nécessaire pour une compréhension complète.

Figure 3. Regroupement des échantillons basé sur la dissimilarité de Bray-Curtis de la composition des variantes de séquence d'amplicon générée en moyennant les valeurs des 11 lignées les plus dominantes.

4. Microdiversité et motifs phylogéographiques de la lignée hypolimnétique la plus abondante (CL500-11)

L'étude examine la microdiversité et les motifs phylogéographiques de CL500-11, une lignée de bactérioplancton prédominante habitant les hypolimnions des lacs d'eau douce profonds. Elle identifie des ASVs distincts dominant les lacs japonais et européens, montrant une différenciation génétique dans le gène 16S rRNA et la région ITS entre ces populations. Étonnamment, la microdiversification au sein des lacs japonais est limitée, remettant en question les hypothèses sur les facteurs influençant la diversification des lignées hypolimnétiques. La comparaison avec des analyses de métagénomes précédentes suggère un regroupement génétique régional au sein de CL500-11, mais une connectivité intercontinentale est observée entre l'Europe et l'Amérique du Nord. L'étude souligne la nécessité d'explorer davantage la diversité génétique de CL500-11 à travers différentes régions et périodes.

Figure 4. Distribution de la dissimilarité de Bray-Curtis par paires pour les compositions de variantes de séquences d'amplicons (ASV) parmi les neuf lacs japonais.

Conclusion

En conclusion, cette approche novatrice complète la résolution limitée du séquençage d'amplicons à courtes lectures et la sensibilité restreinte des stratégies orientées vers l'assemblage de métagénomes, offrant des perspectives plus éclairantes sur les processus écologiques complexes qui régissent l'ubiquité des lignées de bactérioplancton d'eau douce. Néanmoins, il convient de noter que le débit de lecture relativement faible de la méthode constitue un obstacle considérable qui doit être surmonté pour exploiter pleinement son potentiel.

Référence :

1. Okazaki Y, Fujinaga S, Salcher M M, et al. Microdiversité et diversification phylogéographique du bactérioplancton dans les systèmes d'eau douce pélagiques révélées par le séquençage d'amplicons à longues lectures. Microbiome, 2021, 9 : 1-15.