Génotypage SNP du génome entier

SNP, abréviation de polymorphisme mononucléotidique, désigne une forme de polymorphisme génétique résultant d'une mutation dans la séquence d'ADN du génome, provoquée par une altération d'un seul nucléotide, qui peut impliquer la substitution, la transversion, l'insertion ou la suppression d'une seule base. En principe, les SNP peuvent se manifester sous forme bi-allélique, tri-allélique ou tétra-allélique, cependant, dans les applications pratiques, ces deux dernières sont extrêmement rares et considérées comme sans importance. En général, lorsqu'on fait référence aux SNP, l'accent est mis sur les polymorphismes bi-alléliques. Ces variations peuvent se manifester sous forme de transitions, illustrées par la conversion d'une cytosine (C) en thymine (T), ou son homologue de brin complémentaire, à savoir, la conversion d'une guanine (G) en adénine (A). Alternativement, elles peuvent également se manifester sous forme de transversions, telles que cytosine en adénine (CA), guanine en thymine (GT), cytosine en guanine (CG) ou adénine en thymine (AT). Il convient de noter que les transitions présentent systématiquement des taux d'occurrence nettement plus élevés par rapport aux autres catégories, les SNP de type transition représentant environ deux tiers du total.

Pourquoi détecter le génotypage des SNP ?

Les SNPs communs ont le potentiel de se manifester à la fois dans les régions codantes et non codantes du génome. Bien que leur occurrence dans les régions codantes soit relativement rare, leur capacité à influencer la fonctionnalité des gènes, entraînant ainsi des modifications des traits biologiques, les rend d'une importance capitale dans le domaine de l'investigation des maladies génétiques. En tant que marqueurs génétiques de troisième génération, les SNPs sont répartis de manière complexe à travers l'ensemble des paysages génomiques des animaux et des humains. Ils présentent une corrélation prononcée avec les gènes fonctionnels, affichent des taux de mutation minimaux et illustrent une stabilité génétique robuste. De plus, ils se prêtent à une analyse à haut débit et à une automatisation simplifiée. Il est à noter que certains loci de SNP peuvent ne pas être directement corrélés à l'expression de gènes associés à des maladies. Cependant, en raison de leur proximité avec des gènes pathogènes particuliers, ils jouent des rôles essentiels en tant que marqueurs génétiques cruciaux dans ces contextes.

Analyse SNP basée sur microarray

Les puces génétiques offrent de nombreux avantages, notamment un débit substantiel, une précision impeccable et une utilisation conviviale, les rendant particulièrement adaptées aux applications où les loci cibles spécifiques sont préétablis. En particulier, lorsque la quantité de loci cibles dépasse un certain seuil, les puces génétiques montrent une réduction notable des coûts globaux accompagnée d'une efficacité accrue.

La technologie des puces à ADN est basée sur le principe de l'hybridation complémentaire des bases. Elle implique la conception de séquences de sondes pour des loci SNP connus et le marquage des sondes d'ADN avec des isotopes ou des marqueurs fluorescents. Ces sondes d'ADN marquées sont hybridées avec l'ADN cible pour obtenir des informations biologiques. Les puces à ADN utilisent la technologie des microarrays pour intégrer des millions de sondes sur une puce en silicium ou une membrane en nylon de la taille d'une lame de microscope. Cela permet l'analyse simultanée de 5 000 à 1 000 000 de génotypes pour un individu.

Notre services de génotypage SNP basés sur microarray composé de puces SNP Affymetrix et de puces SNP Illumina. Les puces de génotypage Affymetrix sur l'instrument GeneTitan (plaques de la série Axiom) et le système GeneChip Scanner 3000 7G (puces cartouche) peuvent être utilisées pour une variété de cas – pour quelques échantillons ou beaucoup d'échantillons, allant des applications ciblées aux applications à l'échelle du génome en sélectionnant les puces de génotypage préconçues spécifiques. Le génotypage haute densité sur les puces Illumina Infinium ou GoldenGate® permet des études d'association à l'échelle du génome (GWAS) puissantes et peut détecter avec précision les mutations ponctuelles et les variations du nombre de copies. Actuellement, Affymetrix propose des puces de génotypage pour les espèces d'élevage et d'aquaculture (buffle, bovin, poulet, porc, saumon et truite), les cultures (coton, maïs, soja, fraise et blé) et les organismes modèles biomédicaux (humain, chien, souris et Arabidopsis thaliana), tandis qu'Illumina commercialise des BeadArrays de génotypage pour les espèces humaines et non humaines (bovin, chien, maïs, porc et mouton). La puce SNP a été choisie comme technique préférée dans certaines circonstances en raison de sa haute densité, de la précision des tests, de l'analyse de données simple et de l'échange facile de données entre les programmes de recherche. Cependant, ces puces ou chips SNP disponibles dans le commerce ne peuvent pas être facilement modifiés pour s'adapter à des conceptions expérimentales individuelles. De plus, des recherches pertinentes ne peuvent pas être menées pour les espèces qui n'ont pas de puces/chips SNP disponibles dans le commerce.

Les fondements techniques des puces génétiques confèrent les avantages suivants :

Débit Élevé : Les puces génétiques permettent l'examen simultané d'un large éventail de loci génétiques, avec des capacités allant jusqu'à 1 000 000 de loci.

Normalisation stricte et reproductibilité : Chaque expérience fournit des informations génétiques précises à des positions prédéfinies, éliminant le hasard inhérent et garantissant des résultats cohérents.

Précision Exemplaire : Le processus de production de puces est ponctué par des évaluations de qualité rigoureuses, chaque lieu de détection étant soumis à un examen récurrent, soutenant ainsi des résultats d'une précision remarquable.

Efficacité : Les expériences utilisant des puces génétiques sont accélérées, avec des résultats obtenus en aussi peu que 2 jours, contribuant à la rapidité de la recherche.

Efficacité Coût : Les puces génétiques représentent une solution rentable, particulièrement adaptée aux efforts de profilage génétique à grande échelle et à haut débit.

Personnalisation : Les puces génétiques peuvent être adaptées en fonction de loci cibles spécifiques, les puces microarray offrant une flexibilité accrue pour la personnalisation par rapport aux homologues synthétisés in situ.

Génotypage SNP basé sur le NGS

technologies de séquençage de nouvelle génération (NGS) sont des outils puissants pour le génotypage des SNP, car ils peuvent découvrir et génotyper de manière efficace et précise des milliers de SNP pour étudier la génomique quantitative, fonctionnelle et évolutive chez l'homme, les animaux et les plantes.

La NGS est une technologie de séquençage de l'ADN qui a évolué à partir de la PCR et des puces à gènes. Par rapport au séquençage Sanger, le séquençage NGS introduit une terminaison réversible des extrémités, permettant à la synthèse et au séquençage de se produire simultanément.

Dans le séquençage de nouvelle génération (NGS), des molécules d'ADN individuelles doivent être amplifiées en clusters composés de compositions d'ADN identiques. Ces clusters sont ensuite répliqués de manière synchronisée pour améliorer l'intensité du signal de fluorescence, facilitant ainsi la lecture de la séquence d'ADN. À mesure que les longueurs de lecture augmentent, la cohésion de la réplication des clusters diminue, entraînant une baisse de la qualité du séquençage des bases. Par conséquent, le NGS a généralement des longueurs de lecture plus courtes, ne dépassant généralement pas 500 paires de bases. Après le séquençage, les informations provenant des segments d'ADN fragmentés doivent être assemblées, et le processus d'assemblage des séquences présente un taux d'erreur compris entre 0,1 % et 15 %, réduisant ainsi la précision.

La diminution des longueurs de lecture dans le séquençage de nouvelle génération (NGS) permet l'évaluation simultanée de centaines de milliers, voire de millions de séquences génétiques au cours d'un seul passage de séquençage. Cette avancée surmonte efficacement les contraintes associées à un faible débit qui caractérisaient les méthodes de séquençage de première génération. Un seul passage de NGS peut réaliser avec compétence des expériences de génotypage multi-locus, en particulier lorsqu'il s'agit de grands ensembles d'échantillons, offrant des économies de temps et de coûts notables. Par conséquent, cette technologie a connu une adoption extensive dans le domaine du séquençage génétique à haut débit.

Il existe diverses méthodes de génotypage des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) basées sur le séquençage de nouvelle génération.

Séquençage de l'exome entier (WES) : Le WES est une méthode qui utilise le séquençage de nouvelle génération (NGS) pour séquencer uniquement les régions exoniques du génome humain, qui codent des protéines. Bien qu'il soit principalement utilisé pour étudier la relation entre les mutations génétiques et les maladies, il peut également être utilisé pour le génotypage des SNP, car les exons contiennent de nombreux loci SNP.

Séquençage du génome entier (WGS) : Le séquençage du génome entier (WGS) implique le séquençage de toutes les régions de l'ensemble du génome, y compris les régions codantes et non codantes. Cette méthode peut être utilisée pour détecter et génotyper tous les SNP dans le génome, fournissant des informations génétiques complètes.

Séquençage cibléL'approche de séquençage ciblé implique le séquençage spécifique de gènes ou de loci SNP d'un intérêt particulier, permettant l'acquisition de données SNP hautement ciblées. Cette méthodologie peut être adaptée pour inclure le ciblage sélectif de SNP associés à des maladies spécifiques, permettant un examen minutieux des variations génétiques pertinentes à la pathologie étudiée.

Séquençage de l'ARN (RNA-Seq)L'ARN-Seq, bien qu'il soit principalement utilisé pour l'étude des profils d'expression génique, offre une utilité polyvalente englobant la détection des polymorphismes à un seul nucléotide (SNPs). Cette approche multifacette, fondée sur l'examen des transcrits géniques, facilite la discernement de l'expression des SNP et des variations au niveau de l'ARN, offrant ainsi une compréhension complète de la diversité génétique et des dynamiques dans ce contexte.

MultiplexageLes technologies NGS permettent souvent le séquençage simultané de plusieurs échantillons, ce qui entraîne une efficacité accrue et une réduction des coûts. Cette méthodologie s'avère particulièrement avantageuse dans le cadre d'efforts de génotypage de polymorphismes nucléotidiques simples (SNP) à grande échelle, y compris les études d'association à l'échelle du génome (GWAS).

Génotypage par séquençage (GBS) : Le GBS est une approche à haut débit basée sur la technologie de séquençage de deuxième génération. Cette méthodologie facilite le séquençage simultané d'échantillons d'ADN provenant de plusieurs individus et la détermination de leurs génotypes respectifs. Le protocole GBS comprend la préparation de bibliothèques, le séquençage ciblé de régions génomiques spécifiques réalisé par digestion de l'ADN à l'aide d'enzymes de restriction, et l'utilisation de séquenceurs à haut débit pour produire des ensembles de données étendus riches en informations sur les polymorphismes mononucléotidiques (SNP).

dd-RAD (Séquençage d'ADN associé aux sites de restriction par double digestion)Le dd-RAD représente une technique supplémentaire de génotypage des SNP basée sur la technologie de séquençage de deuxième génération. Cette méthode implique l'utilisation de deux enzymes de restriction distinctes pour cliver l'ADN, suivie du séquençage des produits clivés pour la détection et le génotypage des loci SNP.

2b-RAD2b-RAD est une stratégie de séquençage de représentation génomique réduite ou de séquençage associé aux sites de restriction pour découvrir et génotyper des variants génétiques de manière rentable, applicable à la fois aux organismes modèles avec des génomes connus et aux organismes non-modèles avec des génomes inconnus. Cette technique est définie comme la construction de bibliothèques en digérant l'ADN avec des enzymes de restriction et en analysant la bibliothèque résultante avec des plateformes de séquençage Illumina.

Techniques de génotypage SNP basées sur la PCR

La PCR offre une grande sensibilité, un faible coût pour des scénarios avec un nombre limité de loci à tester, et des temps de détection plus courts, généralement complétés en 2 à 4 heures. Elle est opérationnellement simple. Cependant, elle présente des limitations, telles que la détection d'un seul locus, un faible débit (généralement entre quelques et quelques centaines de loci), et l'incapacité à détecter d'autres mutations qui peuvent exister dans l'ADN. Des faux négatifs et des faux positifs sont possibles, ce qui la rend adaptée aux scénarios avec un petit nombre de loci à tester et des exigences de débit plus faibles.

Réaction de Détection de Ligase (LDR) pour le GénotypageCette méthode utilise principalement la technologie de réaction de détection de ligase (LDR). La ligase Taq ADN est utilisée pour faciliter la réaction, qui se produit uniquement lorsque deux courtes sondes nucléotidiques, une de chaque brin, sont entièrement complémentaires à la séquence d'ADN cible sans aucun espace. La détection est réalisée par un balayage fluorescent des longueurs de fragments, permettant l'identification des loci SNP.

Génotypage SNP SNaPshot multiplexLa génotypage SNP SNaPshot est une méthode qui utilise simultanément plusieurs PCR pour effectuer le typage génétique de plusieurs loci SNP connus. Elle utilise des enzymes de séquençage de l'ADN, quatre ddNTP fluorescents, des amorces d'extension de longueurs variées adjacentes au site polymorphe, et des modèles de produits PCR. L'extension des amorces se termine après une seule base, et après électrophorèse sur gel sur un séquenceur ABI 3730, les couleurs des pics indiquent la base incorporée, déterminant le génotype de l'échantillon et le locus SNP correspondant au produit d'extension en fonction de la mobilité des pics.

Méthode de sonde TaqManCette méthode consiste à ajouter deux sondes avec des étiquettes fluorescentes différentes au système de réaction PCR. Chaque sonde complète parfaitement l'un des deux allèles. Normalement, en raison de la proximité étroite du groupe fluorescent à l'extrémité 5' et du groupe quench à l'extrémité 3' sur les sondes, la fluorescence est quenchée. Au fur et à mesure que la PCR progresse, la sonde parfaitement complémentaire au modèle est progressivement clivée par l'activité exonuclease 5'→3' de la Taq ADN polymérase, entraînant la séparation du groupe fluorescent à l'extrémité 5' du groupe quench à l'extrémité 3', déquenchant ainsi la fluorescence. En revanche, la sonde représentant l'autre allèle, qui ne correspond pas parfaitement au modèle, n'est pas efficacement clivée, et aucune fluorescence n'est détectée. La détection des loci SNP est réalisée en mesurant les variations des valeurs de fluorescence à l'aide de l'instrumentation correspondante.

PCR-ARMS (Système d'Amplification par Mutation Réfractaire) : ARMS est une méthode d'amplification PCR conçue pour des SNP spécifiques. Grâce à la conception des amorces, elle amplifie sélectivement des fragments d'ADN contenant ou non le SNP spécifique.

Les techniques basées sur la PCR offrent une gamme d'options pour le génotypage des SNP, chacune se distinguant par ses caractéristiques uniques et son adaptabilité à des contextes de recherche spécifiques.

Génotypage SNP basé sur la spectrométrie de masse

Génotypage SNP MassARRAY : La spectrométrie de masse par désorption/ionisation laser assistée par matrice (MALDI-TOF MS) constitue la technologie de base pour cette méthode. Dans un premier temps, la PCR est utilisée pour amplifier des segments de gènes contenant des SNP. Par la suite, une extension à base unique est réalisée à l'aide d'amorces spécifiques à la séquence. Ensuite, l'analyte de l'échantillon est co-cristallisé avec la matrice de la puce et excité par une impulsion laser de nanosecondes (10^-9 s) dans un tube sous vide. Ce processus entraîne la désorption des molécules d'acides nucléiques, les convertissant en ions à charge unique. En raison de la relation inverse entre la masse des ions et le temps de vol des ions dans un champ électrique, le poids moléculaire précis de l'analyte de l'échantillon est déterminé en mesurant le temps de vol des molécules d'acides nucléiques dans le tube sous vide. En conséquence, les informations sur les sites SNP peuvent être détectées de manière fiable. Cette méthode est particulièrement adaptée à l'analyse des SNP à débit moyen à élevé, notamment lorsqu'il s'agit de plus de dix sites SNP.

CD Genomics s'engage à fournir un génotypage SNP à l'échelle du génome de manière abordable. Nos scientifiques expérimentés peuvent offrir un soutien professionnel pour votre projet afin de répondre à vos objectifs de recherche et à votre budget.

Comparaison des méthodes de génotypage SNP et de RAD-Seq

Voici un aperçu clair côte à côte des techniques de génotypage et de RAD-seq :

Choisissez une méthode basée sur :

• 2b-RAD ou ddRAD-seq pour la découverte à l'échelle du génome
• RAD-seq classique pour des espèces non référencées
• PCR-LDR pour des tests SNP à petite échelle et de haute précision
• MassARRAY pour validation multiplexée à débit moyen