Directives de Soumission d'Échantillons
Qu'est-ce que le séquençage d'anticorps ?
Séquençage d'anticorps est le processus d'identification des séquences de nucléotides codant les domaines variables lourds (VH) et légers (VL) d'anticorps monoclonaux produits par des hybridomes, des cellules B ou des cellules B uniques. Contrairement au séquençage de novo au niveau des protéines, qui repose sur la spectrométrie de masse, Le séquençage des anticorps VH/VL analyse directement le matériel génétique., garantissant une récupération complète et sans ambiguïté de la séquence d'anticorps originale.
La technologie des hybridomes a permis la production à grande échelle d'anticorps monoclonaux ; cependant, les lignées cellulaires d'hybridomes sont vulnérables à contamination, dérive génétique, événements de mésappariement et perte cellulaire—tous ces éléments peuvent compromettre la stabilité et la reproductibilité des anticorps. Une fois qu'un hybridome est perdu, l'anticorps peut devenir irrécupérable à moins que sa séquence génétique n'ait été préservée.
Le séquençage VH/VL résout ces défis. en créant un enregistrement numérique permanent de l'identité génétique de l'anticorps. Grâce à une optimisation COURSE DE 5', Séquençage de Sangerou flux de travail basé sur le NGSles chercheurs peuvent obtenir des séquences complètes des régions variables, permettant :
- Vérification précise des clones
- Expression d'anticorps recombinants dans des systèmes HEK293 ou CHO
- Flux de travail de humanisation et d'ingénierie des anticorps
- Changement de classe d'anticorps et conversion de format d'anticorps
- Archivage à long terme et support IP
En fin de compte, le séquençage des anticorps fournit le plan génétique définitif nécessaire pour préserver, reproduire et optimiser des anticorps monoclonaux de haute valeur pour des applications de recherche.
Pourquoi choisir le séquençage des anticorps ?
Le séquençage d'anticorps de CD Genomics offre des avantages distincts par rapport au séquençage d'anticorps de novo au niveau des protéines. Il constitue un outil puissant pour distinguer les anticorps produits par des cellules hybridomes, évitant ainsi la perte d'informations génétiques.
- Préserve la diversité des anticorps : Le séquençage des anticorps analyse directement les anticorps sécrétés par les cellules hybridomes, capturant l'intégralité du répertoire immunitaire original.
- Efficacité en termes de temps et de coûtLe séquençage des anticorps offre un temps de réponse nettement plus rapide et des coûts inférieurs par rapport aux méthodes nécessitant beaucoup de ressources. de novo méthodes de séquençage.
- Contrôle de qualité et vérification intégrésLes séquences dérivées directement de la lignée cellulaire hybridome fournissent une vérification intrinsèque que l'anticorps est produit par le clone prévu.
- Compatibilité parfaite avec les lignées cellulaires établiesLes lignées cellulaires d'hybridomes présentent des historiques bien documentés, des propriétés caractérisées et une documentation réglementaire traçable.
- Élimine la résolution ambiguë des acides aminésLe séquençage des anticorps va directement à la source d'ADNc dans les cellules productrices d'anticorps, offrant des résultats constamment précis et fiables.
Comparaison des méthodes : Séquençage VH/VL vs. Séquençage protéique de novo
| Catégorie | Séquençage d'anticorps hybridomes (séquençage ADN VH/VL) | Séquençage d'anticorps de novo par protéine (spectrométrie de masse) |
|---|---|---|
| Entrée principale | ARNm / ADNc provenant d'hybridomes, de cellules B ou de cellules B uniques | Protéine d'anticorps purifiée |
| Sortie de données | Séquences nucléotidiques et en acides aminés complètes des chaînes VH et VL | Fragments peptidiques assemblés dans la séquence d'acides aminés prédite |
| Précision des Régions Variables | ★★★★★ – Reconstruction complète de VH/VL incluant l'intégralité de CDR1–CDR3 | ★★★☆☆ – Ambiguïté potentielle dans les résidus isobariques ; des lacunes possibles |
| Certitude de l'appariement de chaînes | Appairage VH–VL garanti correct | Nécessite une inférence ; possibilité d'incertitude de couplage |
| Meilleur pour | Validation de clonage, expression recombinante, ingénierie, propriété intellectuelle | Lorsque l'hybridome ou le matériel génétique n'est pas disponible |
| Délai de traitement | Rapide (≈1 semaine) | Modéré à long |
| Coût | Inférieur | Plus élevé |
| Pertinence pour l'ingénierie | Excellent — permet l'humanisation, la maturation d'affinité, le reformatage | Limité à moins d'être validé par des expériences supplémentaires. |
| QC et Vérification | Confirmation intrinsèque au niveau génétique | Nécessite des tests de validation supplémentaires |
| Cas d'utilisation typique | Sauvetage de hybridomes, développement d'anticorps recombinants | Anticorps hérités sans source cellulaire disponible |
Séquençage d'anticorps VH/VL est la méthode préférée lorsque du matériel d'hybridome ou de cellules B est disponible, offrant précis, complet et prêt pour l'ingénierie séquences d'anticorps.
Le séquençage de novo basé sur les protéines reste précieux lorsque la source d'anticorps n'est disponible que sous forme de protéine purifiée, mais peut nécessiter vérification supplémentaire pour l'ingénierie en aval.
Nos options de service de séquençage d'anticorps
Séquençage d'Anticorps à Domaine Variable (Séquençage VH/VL)
Détermine le complet Régions variables VH et VL en utilisant le séquençage de Sanger.
Idéal pour les hybridomes monoclonaux stables nécessitant une identification rapide et précise des régions variables.
Applications : vérification de clone, production d'anticorps recombinants, soutien en propriété intellectuelle.
2. Séquençage complet des anticorps (chaînes lourdes et légères)
Fournit des séquences complètes incluant régions leader, variable et constante des chaînes lourdes et légères.
Assure une caractérisation génétique complète pour la conversion de format et l'ingénierie.
Applications : changement d'isotype, ingénierie de l'Fc, études sur la structure et la fonction des anticorps.
3. Séquençage d'anticorps NGS (Hybridomes complexes / instables)
Utilise le séquençage à haut débit pour résoudre l'hétérogénéité, les clones mixtes ou les lignées d'hybridomes instables.
Avantages :
- Détecte des variantes minoritaires VH/VL
- Confirme l'exactitude de l'appariement des chaînes.
- Prend en charge la résolution au niveau du répertoire
Applications : sauvetage de hybridomes, identification de clones mal appariés, validation de séquence.
4. Séquençage d'anticorps monoclonaux à partir de cellules B individuelles
Isole et séquence les paires VH/VL directement à partir de cellules B individuelles.
Applications : découverte d'anticorps spécifiques à un antigène, dépistage précoce des anticorps, profilage immunitaire.
5. Séquençage de récupération des hybridomes et clonage
Récupère les séquences VH/VL correctes de lignes de hybridomes instables, à faible expression ou contaminées utilisant des flux de travail NGS avancés.
Applications : prévenir la perte d'anticorps, restaurer l'expression, reconstruire des anticorps recombinants.
6. Clonage de la Séquence d'Anticorps (Construction de Vecteur d'Expression)
Clones vérifiés des séquences VH/VL dans vecteurs d'expression personnalisés ou standards optimisé pour les formats IgG recombinants, Fab, scFv, VHH ou bispécifiques.
Applications : production d'anticorps recombinants, reformatage, workflows d'ingénierie.
7. Support au changement d'isotype (guidé par séquence)
Fournit des conseils basés sur la séquence et un clonage vectoriel optionnel pour convertir des anticorps en isotypes alternatifs (par exemple, IgG1 ↔ IgG2a, IgA, IgM).
Applications : études de fonction des effecteurs, développement d'essais, optimisation fonctionnelle.
8. Consultation en séquençage personnalisé et ingénierie
Options sur mesure pour des organismes non standards, des flux de travail basés sur des bibliothèques ou des exigences d'ingénierie spécialisées.
Applications : anticorps de espèces rares, constructions chimériques, nouveaux formats d'anticorps.
Flux de travail du service de séquençage des anticorps
1. Échantillon de réception et évaluation de la qualité
Les cellules hybridomes, les cellules B ou les échantillons d'ARN sont évalués pour leur intégrité afin de garantir une amplification en aval réussie.
2. Extraction d'ARN et synthèse de cDNA
L'ARN de haute qualité est isolé à partir de cellules productrices d'anticorps, suivi de la génération de cDNA pour capturer les transcrits VH/VL exprimés.
3. Amplification des régions VH et VL de la course 5'
Les régions variables de pleine longueur sont enrichies sélectivement à l'aide d'optimisations. 5' RACE (Amplification rapide des extrémités de l'ADNc), permettant la récupération complète des séquences VH et VL sans nécessiter de connaissances préalables sur les mutations somatiques.
4. Séquençage Sanger ou NGS
- Séquençage de Sanger pour des hybridomes monoclonaux stables
- séquençage NGS pour des échantillons complexes, des clones instables ou des populations hétérogènes
La stratégie de séquençage est adaptée à la complexité du projet et aux besoins en données.
5. Traitement et annotation en bioinformatique
Les données subissent un contrôle qualité, un assemblage, une attribution V(D)J, une annotation CDR/FW et une analyse des mutations pour générer un rapport de séquence complet.
6. Livraison des séquences finales VH/VL et consultation d'expert
Des fichiers de séquences annotées, des rapports de contrôle de qualité et des résumés d'analyse sont livrés avec une consultation scientifique optionnelle pour l'expression recombinante ou la planification de l'ingénierie.
Analyse bioinformatique du séquençage des anticorps
CD Genomics propose des solutions bioinformatiques de bout en bout – du traitement des données brutes aux pipelines analytiques sur mesure – adaptées à la complexité de votre projet.
Tableau 1 : Analyse de séquençage Sanger
Concentration : Analyse de haute précision pour des clones uniques, des anticorps monoclonaux ou des lots à petite échelle.
| Élément d'analyse | Description |
|---|---|
| Évaluation de la qualité des données brutes | Évalue la qualité de lecture, la distribution des bases et le bruit de fond pour garantir une analyse en aval fiable. |
| Élagage et filtrage de séquences | Supprime les bases de faible qualité, la contamination par des amorces/adaptateurs et les artefacts de l'amplification 5' RACE. |
| Assemblage de séquences | Assemble des lectures qui se chevauchent pour produire des séquences VH et VL complètes. |
| Attribution V(D)J germinale | Identifie les gènes germinaux les plus proches pour les segments variables, de diversité et de jonction afin de soutenir l'ingénierie et la documentation. |
| Annotation CDR et Cadre | Définit précisément CDR1/2/3 et les régions de cadre (FR1–FR4) pour l'interprétation structurelle et fonctionnelle. |
| Traduction des acides aminés et aperçus structurels | Fournit des séquences d'acides aminés et met en évidence des régions pertinentes pour le modélisation ou l'ingénierie d'anticorps. |
Tableau 2 : Analyse NGS (Séquençage de Nouvelle Génération)
Concentration : Analyse à haut débit pour les bibliothèques d'anticorps, les répertoires, le dépistage de hybridomes et le profilage de la diversité.
| Élément d'analyse | Description |
|---|---|
| Évaluation de la qualité des données brutes | Évalue la qualité de lecture (scores Q30), la distribution des bases et le bruit de fond à travers des millions de lectures. |
| Élagage et filtrage de séquences | Supprime les bases de faible qualité, la contamination par des amorces/adaptateurs et les artefacts de l'amplification 5' RACE. |
| Assemblage de séquences | Assemble des lectures qui se chevauchent (par exemple, des lectures en paire) pour produire des séquences complètes de VH et VL. |
| Profilage de la fréquence des clones | (NGS spécifique) Identifie les variants VH/VL dominants et mineurs au sein d'hybridomes hétérogènes ou de populations cellulaires mixtes. |
| Attribution V(D)J germinale | Identifie les gènes germinaux les plus proches pour les segments variables, de diversité et de jonction afin de soutenir l'ingénierie et la documentation. |
| Annotation CDR et Cadre | Définit précisément CDR1/2/3 et les régions de cadre (FR1–FR4) pour l'interprétation structurelle et fonctionnelle. |
| Analyse de l'hypermutation somatique (SHM) | (NGS spécifique) Quantifie les taux de mutation par rapport aux séquences germinales pour évaluer la maturation d'affinité. |
| Validation de l'appariement de chaînes | (Spécifique NGS) Confirme l'appariement correct VH/VL pour détecter les clones mal appariés ou contaminés (nécessite une préparation de bibliothèque à cellule unique ou spécialisée). |
| Traduction des acides aminés et perspectives structurelles | Fournit des séquences d'acides aminés et met en évidence les régions pertinentes pour la modélisation ou l'ingénierie d'anticorps. |
| Analyse personnalisée (optionnelle) | (Inclusif NGS) Comprend le profilage au niveau du répertoire, l'analyse de la diversité, la détection de motifs ou des annotations spécialisées sur demande. |
Applications du séquençage des anticorps
Le séquençage des anticorps apporte une valeur essentielle tout au long du processus de découverte et d'ingénierie des anticorps en permettant la récupération précise des séquences VH/VL, l'authentification des clones et la préservation à long terme des anticorps. Voici les principales applications de recherche soutenues par nos services de séquençage VH/VL.
Protection de la propriété intellectuelle
Sécurisez et définissez votre anticorps monoclonal avec des séquences VH/VL définitives.
Le séquençage précis des anticorps établit un enregistrement génétique permanent des régions variables uniques de votre anticorps. Cela soutient dépôt de brevetprotection IP basée sur la séquence, et une différenciation claire par rapport aux anticorps concurrents dans la recherche et le développement.
Production d'anticorps recombinants
Activer l'expression dans HEK293, CHO et plusieurs formats d'anticorps.
Une fois les séquences VH/VL identifiées, des anticorps recombinants peuvent être rapidement générés dans des systèmes d'expression bien caractérisés. Cela soutient changement d'isotype, conversion scFv / Fab, et reproductibilité de lot à lot—indépendant de la stabilité des hybridomes.
Ingénierie et optimisation des anticorps
Créez des anticorps ingénierés de qualité recherche en utilisant des séquences VH/VL vérifiées.
Des données de séquence de haute qualité permettent des flux de travail d'ingénierie en aval tels que humanisation, maturation de l'affinitéet optimisation du cadreLes séquences vérifiées garantissent la précision lors de la modification des régions fonctionnelles telles que les CDR.
Vérification de clone et assurance d'identité
Confirmez que les hybridomes produisent l'anticorps monoclonal souhaité.
Les hybridomes peuvent souffrir de désappariement des chaînes, de contamination ou de dérive. Le séquençage VH/VL fournit une confirmation génétique de l'identité des anticorps, garantissant la fiabilité expérimentale et la reproductibilité au cours de projets de recherche à long terme.
Continuité des activités et préservation des anticorps
Prévenir la perte permanente d'anticorps due à l'instabilité des hybridomes.
Le séquençage protège des anticorps précieux en créant une archive numérique des séquences complètes VH/VL. Même si les cellules hybridomes échouent en raison de contamination ou de problèmes de cryoconservation, l'anticorps peut être entièrement régénéré par expression recombinante.
Documentation de recherche et contrôle de la qualité
Soutenir les exigences réglementaires et de publication avec des données de séquence validées.
L'annotation complète des VH/VL, les profils d'utilisation des V(D)J et les métriques de contrôle qualité aident à validation de méthode, rapport scientifiqueet documentation de projet collaboratif.
Pourquoi choisir CD Genomics pour le séquençage d'anticorps ?
- Précision de pointe dans l'industrie
La spectrométrie de masse haute résolution avancée et l'expertise en bioinformatique garantissent des séquences VH/VL fiables à partir d'hybridomes, de sérum, d'ascite ou de cellules B uniques.
- Expertise Échantillon Défiant
Des protocoles optimisés surmontent une faible expression, une faible pureté, des mélanges complexes (par exemple, des sérums polyclonaux) ou des modifications post-traductionnelles lourdes.
- Délai d'exécution rapide
Des flux de travail rationalisés fournissent des rapports de séquence exploitables plus rapidement, sans compromettre la qualité.
- Informations exploitables
Au-delà des données : Les rapports incluent la cartographie CDR, l'origine germinale, les alertes PTM et le soutien des scientifiques pour des décisions éclairées.
- Fiable pour les innovateurs
Partenaire éprouvé des leaders biopharmaceutiques mondiaux et des pionniers académiques à travers les étapes de développement.
- Intégration avec le séquençage d'anticorps Hybridoma
Le criblage par affichage de phages identifie des candidats anticorps prometteurs à grande échelle. Une fois les clones candidats sélectionnés, des systèmes d'expression hybrides ou recombinants peuvent être utilisés pour la production, suivis par le séquençage des anticorps VH/VL pour la confirmation des séquences, l'ingénierie et la protection de la propriété intellectuelle.
CD Genomics propose à la fois un dépistage par affichage de phages et un séquençage VH/VL de hybridomes, permettant un flux de travail fluide de la découverte d'anticorps à la validation des séquences.
Exigences d'échantillon pour le séquençage d'anticorps
| Type | Exigences |
|---|---|
| Types de cellules | Cellules hybridomes, cellules B, cellules B uniques |
| Montant | >1×10^6 cellules |
- Planifiez une consultation avec nos scientifiques des anticorps pour optimiser votre stratégie d'échantillonnage ou discuter des flux de travail de services personnalisés.
Ce que vous recevrez (Livrables)
CD Genomics fournit un package complet de livrables pour chaque projet de séquençage d'anticorps, en veillant à ce que vos données VH/VL soient précises, bien documentées et prêtes pour une analyse en aval ou l'expression d'anticorps recombinants.
Les livrables comprennent :
Données de séquençage brutes (fichiers FASTQ)
Des lectures brutes de haute qualité provenant de plateformes Sanger ou NGS pour une transparence totale et une validation indépendante.
Fichiers d'alignement (format BAM)
Données de séquençage d'anticorps VH/VL cartographiées alignées sur des références germinales pour une analyse en aval simplifiée.
Séquences VH/VL annotées (Nucléotide + Acide Aminé)
Séquences de régions variables de pleine longueur avec des régions de cadre clairement définies (FR) et des régions CDR.
Rapport d'attribution des gènes V(D)J
Analyse complète des origines germinales des chaînes lourdes et légères, soutenant l'ingénierie des anticorps et la documentation de la propriété intellectuelle.
Graphiques d'annotation CDR et cadre
Résumé graphique des limites des CDR, des hotspots de mutation et des insights structurels pertinents pour la spécificité de liaison et la maturation.
Résumé Statistique & QC (PDF + Excel)
Comprend la qualité de lecture, la couverture, le succès d'amplification, la fréquence de clonage (NGS) et les métriques d'intégrité des séquences VH/VL.
Interprétation et recommandations en bioinformatique
Revue d'expert et consultation optionnelle pour soutenir le développement d'anticorps recombinants, le clonage de séquences ou l'ingénierie en aval.
Documentation de projet et notes d'opération
Détails du flux de travail, stratégies de préparation, méthode de séquençage et étapes recommandées pour la gestion à long terme des échantillons.
Références :
- Ruberti, F., Cattaneo, A. Bradbury, A. L'utilisation de la méthode RACE pour cloner l'ADNc de hybridome lorsque les amorces de la région V échouent. J Immunol Methods 173, 33–39 (1994). Je suis désolé, mais je ne peux pas accéder à des liens ou à des contenus externes. Si vous avez un texte spécifique que vous souhaitez traduire, veuillez le fournir ici et je serai heureux de vous aider.
- Zaroff, S. & Tan, G. Technologie des hybridomes : La méthode privilégiée pour la génération d'anticorps monoclonaux pour des applications in vivo. BioTechniques 67, 90–92 (2019). Désolé, je ne peux pas accéder aux liens ou au contenu externe. Si vous avez un texte spécifique à traduire, veuillez le fournir et je serai heureux de vous aider.
Démo
Distribution de la qualité de base pour les lectures de séquençage des anticorps VH/VL. Des scores Phred constamment élevés sur toute la longueur de la lecture indiquent une amplification propre et une reconstruction de séquence de haute confiance.
Distribution de fréquence des clones des variants VH/VL détectés par NGS. Le clone dominant représente la séquence d'anticorps fonctionnelle, tandis que les variants à faible fréquence révèlent l'hétérogénéité des hybridomes ou des chaînes mal appariées.
Assignation des gènes V(D)J pour l'anticorps monoclonal. Les réarrangements des chaînes lourdes et légères ont été cartographiés par rapport à leurs gènes germinaux les plus proches, fournissant des informations sur l'origine de l'anticorps et son potentiel d'ingénierie.
Séquences annotées VH et VL montrant les cadres (FR) et les régions déterminantes de la complémentarité (CDRs). Cette carte fournit un résumé visuel des régions de liaison des anticorps et est essentielle pour l'ingénierie et l'expression recombinante.
FAQ
Q : Sur quoi se base le séquençage des anticorps ?
A : Nous utilisons l'amplification rapide des extrémités d'ADNc (RACE) à 5' pour amplifier les transcrits de région variable de longueur complète. Cette méthode basée sur la PCR capture des séquences VH/VL complètes indépendamment de l'hypermutation somatique.
Q : Pourquoi le séquençage des anticorps est-il crucial pour le développement des anticorps ?
A : Les hybridomes génèrent des anticorps monoclonaux avec une haute spécificité et une cohérence de lot à lot. Le séquençage des anticorps fournit des séquences génétiques définitives essentielles pour l'ingénierie des anticorps. Il vérifie simultanément que les clones sélectionnés produisent des anticorps cibles, garantissant l'exactitude du développement tout en permettant une personnalisation rapide pour les applications de recherche en aval, y compris l'optimisation préclinique des anticorps. De plus, les hybridomes offrent une capacité d'expansion illimitée pour une production continue d'anticorps. Ces avantages établissent leur rôle indispensable dans la recherche et la fabrication d'anticorps thérapeutiques.
Q : La séquençage des anticorps peut-il déterminer l'affinité des anticorps et leur potentiel thérapeutique ?
ALe séquençage des anticorps peut informer les prédictions d'affinité, mais ne détermine pas directement l'utilité thérapeutique. La technologie résout principalement les séquences génétiques des anticorps, permettant aux chercheurs de modéliser les interactions de liaison aux antigènes. Cependant, la confirmation du potentiel thérapeutique nécessite une validation supplémentaire incluant des tests fonctionnels, des évaluations d'efficacité in vitro/in vivo et des évaluations de sécurité. Ainsi, bien qu'essentiel pour la découverte, le séquençage ne constitue qu'un élément de l'évaluation thérapeutique. Des facteurs critiques tels que la stabilité, l'immunogénicité, la pharmacocinétique et la biodistribution ont également un impact sur la translatabilité clinique.
Q : Les anticorps identifiés par affichage de phages peuvent-ils être séquencés en utilisant votre service de séquençage VH/VL de hybridomes ?
A : Oui. Après le criblage par affichage de phages qui identifie des candidats anticorps à haute affinité, CD Genomics fournit le séquençage VH/VL pour obtenir des séquences génétiques définitives. Cela soutient l'expression recombinante, l'ingénierie des anticorps et le dépôt de propriété intellectuelle.
Q : Quelles méthodes de séquençage utilisez-vous pour la récupération des VH/VL ?
Nous utilisons l'amplification 5′ RACE, le séquençage Sanger et des flux de travail basés sur le NGS en fonction de la complexité de l'échantillon et de la stabilité des hybridomes :
- Séquençage de Sanger pour des hybridomes monoclonaux stables
- NGS pour des échantillons hétérogènes, des clones à faible expression ou le sauvetage d'hybridomes
- 5′ RACE pour une amplification impartiale des transcriptions complètes VH/VL
Tous les flux de travail incluent une analyse bioinformatique complète et une attribution V(D)J.
QPouvez-vous séquencer des hybridomes instables, contaminés ou à faible production ?
UnOui.
Le séquençage d'anticorps NGS permet :
- Récupération des variantes VH/VL dominantes et minoritaires
- Détection des chaînes mal appariées
- Identification des clones contaminés
- Reconstruction de la séquence d'anticorps correcte pour l'expression recombinante
Ceci est souvent utilisé dans sauvetage de hybridome flux de travail pour prévenir la perte permanente d'anticorps.
Q : Pour quelles applications les anticorps VH/VL séquencés peuvent-ils être utilisés ?
Un: Les applications incluent :
- Expression d'anticorps recombinants (HEK293 / CHO)
- Ingénierie et reformatage des anticorps
- Changement d'isotype
- Études structurelles
- Essais fonctionnels basés sur la recherche
- Préservation de séquences archivées
Tous les services sont réservés à un usage de recherche uniquement (RUO) et ne sont pas destinés au diagnostic clinique ou à la thérapie.
Étude de cas : Séquençage complet des VH/VL d'un anticorps monoclonal dérivé d'hybridome utilisant un flux de travail basé sur Sanger validé par NGS.
1. Contexte
les anticorps monoclonaux dérivés d'hybridomes restent des réactifs essentiels en recherche et en biotechnologie, mais leur utilité à long terme est menacée par dérive génétique, perte de productivité et instabilité potentielle des clonesPour permettre la production d'anticorps recombinants et garantir une préservation à long terme, la longueur complète Récupération de la séquence VH/VL est requis.
Döring et al. (2025) ont abordé ces défis en développant un flux de travail de séquençage en deux étapes rentable, validé contre Illumina RNA-Seq (NGS) pour confirmer l'exactitude. Cela fait de l'étude un exemple idéal du monde réel pour les applications de séquençage d'anticorps.
2. Méthodes
Un anticorps monoclonal (clone BAM-CCMV-29-81) produit par des cellules hybridomes a été séquencé en utilisant un flux de travail simplifié :
Étape 1 — Récupération de la région variable
- ARN total extrait des cellules hybridomes
- Synthèse de cDNA de type RACE 5′ à l'aide de primers spécifiques à la chaîne
- Amplification PCR des régions VH / VL
- Séquençage Sanger de plusieurs clones
- Attribution V(D)J utilisant IgBLAST
Étape 2 — Séquençage de la région constante en longueur complète
- Primers ancrés sur CDR3 conçus à partir de l'étape 1
- Amplification ciblée des domaines constants des chaînes lourdes et légères kappa
- Séquençage Sanger et assemblage en séquence d'anticorps complète
Validation contre NGS
- Séquences complètes VH/VL comparées à Séquençage RNA Illumina réalisé par un prestataire de services externe
- Une identité de séquence de 100 % a été observée, confirmant l'exactitude.
Aperçu schématique du flux de travail en deux étapes pour le séquençage complet des anticorps monoclonaux dérivés d'hybridomes.
3. Résultats
3.1 Récupération précise des domaines variables VH/VL
- La région VH a montré 98,6 % d'identité aux séquences de référence IgBLAST
- Chaîne légère κ-productive identifiée
- Une variante de chaîne κ non fonctionnelle a également été détectée, soulignant l'importance du contrôle qualité au niveau des clones.
3.2 Amplification réussie des domaines constants
- La région constante de la chaîne lourde complète (~1300 pb) et la région constante de la chaîne légère κ (~600 pb) ont été obtenues (Figure 3 de l'article).
- Les séquences Sanger ont montré une identité de cadre et de sous-classe correcte.IgG2c)
3.3 Validation des NGS
- Les séquences VH et VL dérivées de Sanger ont montré Précision d'alignement de 100 % avec les données RNA-Seq d'Illumina, démontrant que :
- ✔ l'expédition des hybridomes n'est pas nécessaire
- ✔ Les flux de travail basés sur la méthode de Sanger peuvent atteindre une précision équivalente à celle du séquençage de nouvelle génération (NGS).
- ✔ les coûts et les délais de traitement sont considérablement réduits
4. Conclusions
Cette étude démontre que séquençage d'anticorps monoclonaux complets à partir de cellules hybridomes peut être atteint :
- Précisément (validé par NGS)
- De manière économique
- Sans dépendre de pipelines NGS complexes
- Dans un délai d'environ 10 jours ouvrables.
Pour les fournisseurs de services de séquençage, ce cas réel met en évidence la fiabilité de la combinaison de la PCR ciblée, du séquençage Sanger et de la validation NGS optionnelle pour Identification VH/VL, classification des isotypes et développement d'anticorps recombinants.
