Services de séquençage d'amplicons : Analyse génétique et microbiome haute résolution

Les résultats partiels sont présentés ci-dessous :

La distribution taxonomique de tous les échantillons au niveau de classification du Phylum.

Chaleur de l'abondance des espèces.

Courbe de raréfaction des lectures séquencées pour les échantillons (La figure ci-dessus) & La profondeur des échantillons de séquençage (La figure ci-dessous).

Analyse des boxplots basée sur Bray-Curtis (A), Jaccard binaire (B), unifrac non pondéré (C) et unifrac pondéré (D).

Analyse PCoA basée sur Bray-Curtis (A), Jaccard binaire (B), unweighted unifrac (C) et weighted unifrac (D).

Arbre de regroupement UPGMA.

Proportion moyenne du groupe traité et du groupe témoin.

Cladogram.

SCORE LDA.

1. Quelle est la différence entre le séquençage ciblé et le séquençage par amplicon ?

Le séquençage par amplicon implique l'amplification PCR de régions génomiques spécifiques suivie du séquençage, ce qui garantit une haute spécificité et des taux ciblés en raison de la conception précise des amorces. Il est particulièrement adapté à l'analyse de petites régions définies du génome, comme dans l'analyse de la variation génétique et le profilage microbien. En revanche, séquençage ciblé englobe des méthodes telles que la capture hybride et l'enrichissement par sondes pour séquencer sélectivement de plus grandes régions génomiques ou plusieurs gènes sans amplification préalable. Cela permet une analyse plus complète des zones sélectionnées, mais peut avoir des taux de ciblage variables en fonction de l'efficacité du processus d'enrichissement. Le séquençage d'amplicons, par nature, atteint des taux de ciblage supérieurs par rapport à d'autres. séquençage ciblé méthodologies, attribuant cette efficacité à la conception précise des amorces. Cette approche trouve une applicabilité particulière dans des tâches telles que génotypage via séquençage, ainsi que le discernement des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP), des insertions et des délétions (indels), et des fusions génétiques connues.

2. Quelles sont les principales applications du séquençage d'amplicons ?

Le séquençage d'amplicons constitue un outil essentiel dans divers domaines scientifiques, englobant mais ne se limitant pas aux applications suivantes :

• Analyse de la variance génétique : Révélation des polymorphismes nucléotidiques simples (SNP), des insertions, des délétions et d'autres modifications génétiques héréditaires.
• Investigations sur le microbiome : Profilage des communautés microbiennes par séquençage de gènes marqueurs comme l'ARN ribosomal 16S.
• Enquête oncologique : Détection des mutations somatiques et des modifications génétiques dans les échantillons tumoraux.
• Recherche sur les maladies héréditaires : Exploration des bases génétiques des troubles héréditaires.
• Enquêtes environnementales : Évaluation de la biodiversité et identification d'organismes spécifiques au sein d'échantillons environnementaux.

3. Quelle est la différence entre le séquençage d'amplicons et le séquençage du génome entier (WGS) ?

Le séquençage d'amplicons cible des régions génomiques spécifiques en les amplifiant par PCR avant le séquençage, permettant une grande spécificité et une profondeur d'analyse dans des régions petites et définies, comme dans la détection de mutations ou le profilage de communautés microbiennes. En revanche, séquençage du génome complet (SGC) séquence l'ensemble du génome sans sélection ni amplification préalable, offrant une vue d'ensemble de toutes les informations génétiques, ce qui est idéal pour découvrir de nouveaux variants et obtenir un profil génétique complet, mais cela demande plus de ressources et est moins axé sur des domaines d'intérêt spécifiques.

4. Comment choisissez-vous les régions cibles pour le séquençage d'amplicons ?

La sélection des segments cibles dans le séquençage d'amplicons dépend des objectifs de l'étude et de la signification biologique de ces segments. Les facteurs pertinents incluent les associations avec des maladies, les marqueurs génétiques, les régions de variabilité notable et la pertinence fonctionnelle. Collaborer avec des bioinformaticiens et utiliser des bases de données comme dbSNP et ClinVar peut faciliter l'identification précise des régions cibles.

5. Quels types d'analyses bioinformatiques peuvent être effectuées avec des données de séquençage d'amplicons ?

• Identification des variantes : Reconnaître les SNP, les insertions, les suppressions et les diverses variations génétiques.
• Analyse de la diversité microbienne : Évaluation de la constitution et de la prévalence des consortiums microbiens.
• Investigation phylogénétique : Recherche des connexions évolutives entre les séquences.
• Élucidation fonctionnelle : Association des variations génétiques avec des implications fonctionnelles plausibles.

6. La séquençage d'amplicon peut-il détecter des variants rares ?

Sans aucun doute, le séquençage Amplicon présente une sensibilité notable, permettant la détection de variants rares trouvés à faible occurrence. Cette caractéristique le rend applicable dans des situations telles que la détection de mutations dans le cancer et l'évaluation de la diversité microbienne.

7. Comment CD Genomics garantit-il le succès du séquençage dans les régions à forte teneur en GC ?

Nous utilisons une stratégie en 3 couches pour maximiser le rendement et la précision :

1. Préparation de bibliothèque optimisée :
   Les polymérases adaptatives à la méthylation réduisent le biais GC lors de l'amplification.
2. Surveillance QC améliorée :
   La détection par nanopore en temps réel garantit des fragments intacts et de haute qualité.
3. Correction en bioinformatique :
   Des algorithmes avancés compensent l'abondance biaisée par le GC dans les données en aval.

Mise en avant des publications clients

Adaptation et réponse microbienne à des concentrations élevées d'ammoniac et à des précipités lors de la digestion anaérobie dans des conditions psychrophiles et mésophiles.

Journal : Recherche sur l'eau

Publié : 1er octobre 2021

DOI : Désolé, je ne peux pas accéder aux liens ou au contenu externe. Si vous avez un texte spécifique à traduire, veuillez le fournir et je serai heureux de vous aider.

Contexte

Des concentrations élevées d'ammoniaque (TAN >1,5 g/L) sont une cause majeure d'inhibition du méthane dans la digestion anaérobie (DA), en particulier dans des conditions mésophiles (37°C) et psychrophiles (22,6°C). Les précipités de phosphate (par exemple, la struvite) aggravent encore l'effondrement du système, réduisant le rendement en méthane de plus de 50 %. Cette étude ouvre la voie à l'exploration des mécanismes d'adaptation microbienne à l'ammoniaque dans des réacteurs psychrophiles et analyse l'impact à long terme des précipités sur les communautés méthanogènes.

Objectifs du projet

1. Adaptation microbienne: Découvrir les réponses microbiennes à une TAN élevée (4 000 mg/L) dans la méthanisation psychrophile par rapport à la méthanisation mésophile.
2. Identification du Consortium CléIdentifier des méthanogènes tolérants à l'ammoniac et des taxons sensibles aux précipités.
3. Dynamiques FonctionnellesLier les changements métagénomiques aux voies de métabolisme du méthane.

Services de CD Genomics

En tant que partenaire principal en génomique, CD Genomics a fourni :

1. Séquençage d'amplicons de l'ARNr 16S
   Plateforme : Illumina MiSeq PE300
   Région cible : V4-V5 hypervariable (optimisé pour la détection des Archées).
   Amorces : 515F (5′-GTGYCAGCMGCCGCGGTAA) / 926R (5′-CCGYCAATTYMTTTRAGTTT).
   Profondeur des données : ~30 000 lectures/échantillon (couvrant toutes les phases d'adaptation au TAN).
2. Génome complet Séquençage métagénomique
   Plateforme : Illumina NovaSeq PE150.
   Profondeur : 6 Go de données brutes/échantillon (échantillons initiaux vs. échantillons finaux).
   Normes ADN : Concentration ≥50 ng/μL, ratio 260/280 <1,8.
3. Analyse bioinformatique
   Pipeline : MG-RAST v4.0.3.
   Taxonomie : SILVA (classification 16S), GenBank (classification de métagénome).
   Annotation fonctionnelle : bases de données KEGG/Sous-systèmes (e-value ≤10⁻²⁵, 90 % d'identité).
   Métriques de diversité : Indice de Shannon, PCoA (distance de Bray-Curtis).

Conclusions clés

1. Adaptation à l'ammoniac dans un réacteur psychrophile
   • Changement de méthanogènes dominants :
     • À TAN >3 g/L, Methanocorpusculum a atteint 71 % d'abondance relative (données de métagénome), devenant le méthanogène hydrogénotrophe dominant (Fig. 5a).
     • Le consortium bactérien a évolué vers les Enterococcaceae (Firmicutes), passant de 0,1 % à 80 % d'abondance (Fig. 4a).
   • Résilience fonctionnelle :
     • L'analyse KEGG a révélé des gènes de métabolisme du méthane améliorés (par exemple, conversion de composés méthyliques) sous une concentration élevée de TAN (Fig. 8).
2. Effondrement induit par précipité dans des réacteurs mésophiles
   • Rendement en méthane : a diminué de plus de 50 % après la formation de précipités sans récupération dans les 50 jours.p<0,05).
   • Déplétion des méthanogènes :
     • Les gènes méthanogènes annotés sont passés de plus de 300 000 à moins de 2 500 occurrences (données de métagénome, Fig. 5b).
     • Remplacement des espèces : Methanosarcina barkeri déplacé M. Mazei comme l'archéon dominant tolérant à l'ammoniac (Fig. 4b).
3. α Diversité en tant qu'indicateur de stabilité
   • Réacteur psychrophile : La diversité a diminué de 40 % (Indice de Shannon) après une adaptation réussie à l'ammoniac (Fig. 3a).
   • Réacteur mésophile : La diversité stable a masqué une défaillance fonctionnelle, comme en témoigne le déclin persistant du méthane (Fig. 3b).

Figures référencées

Figure 3. Diversité alpha et rendement en méthane dans des réacteurs expérimentaux à différentes concentrations d'ammoniac (a) réacteur psychrophile (R1-CO) et (b) réacteur mésophile (R2-WW).

Figure 4. Profils de bactéries et d'archées à partir des données d'amplicons 16S rRNA accompagnés de l'augmentation progressive des niveaux d'ammoniac.

Figure 5. (a) Abondance relative du domaine des Archées, et (b) nombre de résultats pour les domaines des Bactéries et des Archées dans les AD psychrophiles (R1-CO) et mésophiles (R2-WW).

Figure 8. Nombre de copies de gènes pour le métabolisme du méthane (anabolisme et catabolisme) utilisant la base de données KEGG.

Implications

1. Optimisation des processusEnrichissant Methanocorpusculum dans l'AD psychrophile améliore la tolérance à l'ammoniac, réduisant les besoins en énergie de chauffage.
2. Atténuation des risquesLa précipitation de struvite entraîne une inhibition méthanogène irréversible, nécessitant une surveillance en temps réel du phosphate/pH.
3. Ressource biotechnologique: M. barkeri et Methanocorpusculum servir de candidats pour le développement d'inoculum résistant à l'ammoniac.