Directives de Soumission d'Échantillons
Construire des clones iPSC modifiés avec un contrôle qualité soutenu par séquençage dès le départ.
L'édition génétique dans les cellules souches pluripotentes induites peut soutenir la modélisation des maladies, la génération de contrôles isogéniques, la génomique fonctionnelle et le développement de modèles pour la découverte de médicaments. Mais un projet de cellules souches iPSC éditées n'est rarement qu'une tâche d'édition. Votre équipe a également besoin d'une validation au niveau des clones, d'un suivi des échantillons, de preuves de séquençage et d'un plan de contrôle qualité clair avant que les expériences en aval ne commencent.
Notre solution d'édition génique et de contrôle de qualité pour les iPSC est conçue pour vous aider à planifier le projet comme un flux de travail connecté. Nous vous aidons à réfléchir à l'objectif d'édition, à la séquence cible, au modèle donneur, à la stratégie de dépistage, à la validation du site cible, à un contrôle de qualité génomique optionnel et aux livrables prêts à être rapportés avant que les cellules ou l'ADN extrait n'entrent dans le projet.
Quelle question cette solution vous aide-t-elle à répondre ?
- Ma lignée iPSC est-elle adaptée à l'objectif d'édition prévu ?
- Le projet devrait-il utiliser une stratégie de KO, KI, mutation ponctuelle, correction ou rapporteur ?
- Un modèle de donateur est-il nécessaire ?
- Quels clones portent l'édition prévue ?
- La confirmation par Sanger est-elle suffisante ou faut-il ajouter le séquençage d'amplicon, ciblé ou du génome entier ?
- Quels résultats de contrôle qualité sont nécessaires avant les études de modélisation des maladies en aval, de différenciation ou fonctionnelles ?
L'objectif est d'aider votre équipe à passer de "nous avons besoin d'un clone édité" à "nous comprenons quel clone est mieux soutenu par les preuves de séquençage et de contrôle qualité."
Pourquoi les projets de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) modifiées nécessitent plus qu'une simple confirmation du site cible.
La confirmation du site cible est importante, mais elle peut ne pas suffire pour chaque projet d'iPSC modifié. Un clone peut sembler correct par un court PCR ou un séquençage Sanger tout en nécessitant un examen plus approfondi pour l'état des allèles, des événements on-target plus importants, la structure d'insertion du donneur, des changements de nombre de copies ou d'autres signaux de contrôle qualité à l'échelle du génome.
Cela ne signifie pas que chaque projet nécessite la même profondeur de contrôle qualité. Cela signifie que le contrôle qualité doit correspondre à l'objectif du clone modifié. Un dépistage exploratoire rapide peut ne pas nécessiter le même ensemble de preuves qu'un modèle de maladie isogénique de grande valeur ou un clone destiné à des études de différenciation à long terme.
Nous vous aidons à définir cette profondeur de contrôle qualité dès le début, afin que les résultats finaux soient plus faciles à examiner et à utiliser.
Nos capacités de service pour les projets iPSC édités
Nous soutenons les projets iPSC modifiés en tant que flux de travail intégrés de conception, validation, séquençage, contrôle qualité et reporting. En fonction de l'ampleur du projet, notre équipe peut aider à la planification de la stratégie d'édition, à la logique de dépistage des clones, à la validation des sites cibles, au contrôle qualité soutenu par le séquençage et à l'interprétation bioinformatique.
Objectifs de montage que nous pouvons aider à planifier
- Knock-out de gène pour la modélisation de perte de fonction
- Insertion de knock-in ou insertion de rapporteur
- Introduction aux mutations ponctuelles
- Correction des mutations associées aux maladies
- Génération de contrôle isogénique
- Édition prise en charge par un modèle de donateur
- Validation du génotype au niveau du clone
- Contrôle qualité soutenu par séquençage avant la recherche en aval
Pour chaque projet, l'objectif d'édition doit être lié à une stratégie de validation. Un clone knockout peut nécessiter une interprétation des indels au niveau des allèles, tandis qu'un knock-in ou une insertion de rapporteur peut nécessiter une validation des jonctions et une confirmation de la séquence donneuse.
Modules de dépistage et de validation des clones
- Collection et suivi des clones de candidats
- Revue de l'état d'expansion des clones
- Génotypage sur site cible
- Séquençage Sanger ou séquençage d'amplicons lorsque cela est approprié.
- Séquençage ciblé pour un examen des modifications à plus haute résolution
- Insertion de donneur ou confirmation de jonction
- Tableau de comparaison des clones
- Notes de signalement et de contrôle qualité
Ces modules aident votre équipe à comparer les clones de manière structurée plutôt qu'en examinant des fichiers éparpillés.
Options de contrôle qualité et de reporting soutenues par le séquençage
Pour des projets sélectionnés, le contrôle qualité soutenu par le séquençage peut aller au-delà du site cible. En fonction de l'objectif de l'étude, des options supplémentaires peuvent inclure la révision des candidats hors cible, le contrôle qualité soutenu par le séquençage du génome entier, l'analyse des CNV/SNV/SV, ou la révision d'événements importants sur cible.
Pour des services connexes, consultez notre Analyse de l'édition CRISPR avec NGS, Séquençage de validation des effets hors cible de CRISPRet Séquençage CRISPR pages.
Choisissez la bonne stratégie d'édition et de contrôle qualité pour votre lignée iPSC.
Il n'existe pas de plan de contrôle qualité unique qui convienne à tous les projets d'iPSC modifiés. La bonne stratégie dépend de l'objectif de modification, de la conception du donneur, du nombre de clones, de l'utilisation en aval et de la quantité de contexte génomique dont votre équipe a besoin.
| Stratégie | Question principale | Objectif d'édition optimal | Méthode de validation | Profondeur QC | Limitation |
|---|---|---|---|---|---|
| K.O. | Le gène cible a-t-il été perturbé ? | Modèle iPSC de perte de fonction | Sanger, séquençage d'amplicons ou séquençage ciblé | Validation du site cible et comparaison des clones | Peut nécessiter une interprétation au niveau des allèles. |
| Knock-in | La séquence du donneur a-t-elle été insérée correctement ? | Insertion de rapporteur, insertion de balise, ajout de séquence fonctionnelle | PCR de jonction, séquençage d'amplicons ou séquençage ciblé | Revue de l'insertion du donneur et des jonctions | Le design du donneur affecte la complexité du dépistage. |
| Mutation ponctuelle | Le changement de base prévu a-t-il été introduit ? | Modélisation des mutations de maladies | Séquençage d'amplicon ou séquençage ciblé | Confirmation au niveau des allèles | Les modifications à basse fréquence nécessitent un dépistage minutieux des clones. |
| Correction de mutation | La variante associée à la maladie a-t-elle été corrigée ? | Génération de contrôle isogénique | Séquençage du site cible et comparaison de clones | Revue du statut du site cible et des allèles | Un contrôle qualité supplémentaire peut être nécessaire pour les clones de grande valeur. |
| Insertion de reporter | Le reporter a-t-il été inséré dans le cadre et au bon endroit ? | Ligne iPSC reporter | Validation et séquençage des jonctions | Planification de l'expression en aval du site cible | Ne remplace pas le contrôle de qualité de l'état de la cellule. |
| QC pris en charge par WGS | Des changements génomiques plus larges sont-ils présents ? | Revue de clones de haute valeur avant les études en aval | Séquençage du génome entier et bioinformatique | Revue à l'échelle du génome, contexte CNV/SNV/SV le cas échéant | Pas toujours nécessaire pour chaque clone de recherche. |
Pour la validation du site cible, Séquençage de région ciblée peut soutenir une revue ciblée. Pour une évaluation plus large à l'échelle du génome, Séquençage du génome entier peut être considéré lorsque le projet nécessite un contrôle qualité plus approfondi.
Commencez par l'édition dont vous avez besoin et l'expérience en aval que vous prévoyez de réaliser. Si le clone modifié sera utilisé pour un travail exploratoire précoce, la validation du site cible et la comparaison des clones peuvent suffire. Si le clone doit soutenir la modélisation des maladies, des études de contrôle isogéniques ou des expériences de différenciation à long terme, un package de contrôle qualité plus approfondi peut être utile.
Un projet de modèle de donneur devrait inclure un examen du design du donneur et une confirmation des jonctions. Un projet de mutation ponctuelle ou de correction peut nécessiter un séquençage au niveau des allèles. Un clone destiné à un usage plus large en aval peut nécessiter un contrôle qualité à l'échelle du génome ou un examen des candidats hors cible.
Nous vous aidons à choisir le niveau de validation qui correspond à l'objectif de recherche, sans transformer chaque projet en un flux de travail inutilement lourd.
Flux de travail de l'échantillon au rapport avec des points de contrôle de QC au niveau du clone
Notre flux de travail relie la conception d'édition, le criblage de clones, la validation de séquençage et le reporting de contrôle qualité. Chaque étape est conçue pour réduire l'incertitude avant que le projet ne passe à l'étape suivante.
Étape 1 : Réception du projet et révision des objectifs d'édition
Nous commençons par examiner le gène cible ou la région génomique, le type d'édition, la source de iPSC et le contexte de la lignée cellulaire, les informations sur le modèle ou le construct du donneur le cas échéant, l'utilisation de recherche en aval, la profondeur de validation souhaitée, le nombre de clones à dépister et les livrables attendus.
Cette étape nous aide à définir si le projet nécessite uniquement une validation sur site cible, une comparaison de clones, un examen des candidats hors cible, un contrôle qualité à l'échelle du génome, ou un package combiné.
Étape 2 : Édition du design, planification de l'ARN guide et du modèle donneur
Le design d'édition doit correspondre au résultat souhaité. Les projets de knockout peuvent se concentrer sur la création de décalages de lecture ou d'indels disruptifs. Les projets de knock-in et de rapporteur nécessitent une planification du modèle donneur et une validation des jonctions. Les projets de mutation ponctuelle ou de correction nécessitent une confirmation minutieuse au niveau de la séquence.
À ce stade, l'ARN guide, le modèle donneur, la séquence cible et la logique de dépistage sont examinés ensemble. Cela aide à réduire le risque de concevoir une modification qui est techniquement possible mais difficile à valider par la suite.
Étape 3 : Livraison, récupération et dépistage monoclonal
Le plan de livraison et de récupération dépend de la lignée iPSC et de la stratégie d'édition. Les lignées iPSC peuvent être sensibles au stress d'édition, à la manipulation de cellules uniques et à l'expansion des clones. Le criblage monoclonal aide à séparer les clones candidats et permet à chaque clone d'être examiné indépendamment.
Une fois les clones disponibles, l'identité de l'échantillon, l'étiquetage des clones, l'état d'expansion et la disponibilité de l'ADN deviennent des points de contrôle QC importants.
Étape 4 : Validation du site cible et comparaison des clones
La validation du site cible vérifie si l'édition prévue est présente. Selon le projet, cela peut inclure le séquençage Sanger, le séquençage d'amplicons, le séquençage ciblé, la confirmation de jonction, la révision au niveau des allèles ou le support d'insertion de donneur.
La comparaison des clones regroupe les résultats. Au lieu d'examiner chaque clone isolément, votre équipe peut comparer le génotype, le modèle d'édition, la zygosité, l'état d'insertion du donneur, les indicateurs de contrôle qualité et la qualité de séquençage dans un seul tableau.
Étape 5 : QC à l'échelle du génome, bioinformatique et livrables finaux
Pour certains projets sélectionnés, un contrôle qualité supplémentaire peut inclure une révision soutenue par séquençage du génome entier, la validation de candidats hors cible, l'analyse CNV/SNV/SV ou une révision d'événements importants ciblés. L'analyse bioinformatique organise ces résultats en tableaux, résumés visuels et notes de rapport.
Les livrables finaux peuvent inclure des informations sur les clones édités, des données de séquençage, des résumés de contrôle qualité, des tableaux de comparaison de clones, des figures et des notes d'analyse.
Exigences d'information sur les échantillons et les projets
Les besoins en échantillons dépendent de si votre équipe demande une édition de conception, une validation de clonage, un contrôle qualité uniquement sur le séquençage, une révision à l'échelle du génome ou un package combiné. Le tableau ci-dessous utilise les directives de soumission d'échantillons de CD Genomics comme référence pour les soumissions d'acides nucléiques et de cellules. Les exigences finales doivent être confirmées lors de la révision du projet.
| Type d'entrée | Matériau recommandé | Contrôle de qualité | Conteneur ou Format | Expédition ou Soumission | Notes |
|---|---|---|---|---|---|
| Ligne iPSC existante ou cellules congelées | Spécifique au projet ; pour la soumission générale de cellules, les directives de CD Genomics indiquent un apport cellulaire de 1×10.6 cellules | Identité cellulaire, viabilité, historique de passage, statut mycoplasme si disponible. | Cryovial ou format de cellule congelée approuvé | Glace carbonique | Utilisé pour l'édition de l'examen de faisabilité ou la planification de l'extraction d'ADN/ARN. |
| Clones iPSC édités / pellets cellulaires | Spécifique au projet ; cellules suffisantes pour l'extraction d'ADN génomique et la validation des clones. | Identité clonale, étiquetage des échantillons, statut d'expansion, rendement en ADN après extraction | Cryovial ou tube à culot cellulaire | Glace carbonique | Utilisé pour la validation du site cible, la comparaison de clones et la révision de la qualité. |
| ADN génomique extrait pour la validation du site cible ou du clone | Pour les projets de séquençage ADN ciblés, utilisez l'exigence spécifique à l'essai ; les entrées de type WES/WGS en courtes lectures commencent généralement à partir de ≥500 ng d'ADN génomique. | OD260/280 proche de 1,8-2,0 ; traité avec de la RNase ; pas de dégradation ou de contamination évidente. | Tube sans DNase ; eau sans DNase, tampon d'élution ou Tris 10 mM pH 8,0 | Sacs de glace | Utile pour le séquençage ciblé, la validation de clones ou le contrôle qualité ciblé. |
| ADN génomique extrait pour le contrôle qualité soutenu par le séquençage du génome entier (WGS) | WGS : recommandé ≥500 ng, minimum 200 ng, concentration minimale 10 ng/µL ; WGS sans PCR : recommandé ≥1 µg, minimum 500 ng, concentration minimale 20 ng/µL | Concentration par fluorométrie lorsque possible ; si vous utilisez un Nanodrop, un apport plus élevé peut être nécessaire. | Tube sans DNase | Sacs de glace | Utilisé lorsque des contrôles de qualité à l'échelle du génome plus larges sont nécessaires. |
| ADN génomique extrait pour une revue structurelle à long terme | PacBio WGS : ≥3 µg, 80 ng/µL ; Nanopore WGS : ≥5 µg, 20 ng/µL | ADN de haute masse moléculaire, faible dégradation, pureté adéquate | Tube sans DNase | Packs de glace | Considérez lorsque le contexte structurel à long terme est important. |
| Amplicon purifié pour validation ciblée | Séquençage d'amplicons : recommandé ≥1 µg, minimum 500 ng, concentration minimum 20 ng/µL | Produit unique attendu si applicable ; vérification de la concentration et de la pureté | Tube à faible liaison ou tube sans DNase | Packs de glace | Utile pour la confirmation au niveau du site cible, de la jonction du donneur ou du clone. |
| Modification des fichiers de conception | Gène cible, séquence de référence, gRNA, modèle donneur, carte du plasmide, liste des clones | Précision de la séquence et cohérence de l'identifiant d'échantillon | FASTA, GenBank, feuille de calcul, carte de plasmide ou fiche de projet | Soumission électronique | Nécessaire avant la révision de la méthode et la mise en place du reporting. |
CD Genomics demande également aux clients de soumettre un formulaire de soumission d'échantillons complété, de maintenir la cohérence des noms d'échantillons entre le formulaire et les étiquettes des échantillons, et de fournir des données de contrôle qualité électroniques lorsque cela est possible. Les échantillons dans des tubes de centrifugeuse de 1,5 mL doivent être soigneusement scellés ; les cellules et les échantillons congelés doivent être expédiés avec de la glace carbonique.
Analyse bioinformatique et livrables
La bioinformatique aide à transformer les données de séquençage en preuves de contrôle qualité au niveau des clones. Cela est particulièrement important lorsque votre projet inclut le séquençage d'amplicons, le séquençage ciblé, la validation de candidats hors cible, le contrôle qualité soutenu par le séquençage du génome entier (WGS) ou des comparaisons entre plusieurs clones.
Livrables minimums
- Édition des notes de révision de conception où cela est inclus.
- Résumé de la qualité au niveau des échantillons et des clones
- Résumé de la validation du site cible
- Profil d'allèle ou d'indel le cas échéant
- Tableau de comparaison des clones
- Résumé de la QC de séquençage
- Table de validation hors cible des candidats où inclus
- Résumé de la QC à l'échelle du génome où le WGS est inclus.
- Sorties de révision CNV/SNV/SV le cas échéant
- Notes du rapport final
Pour des analyses et des rapports personnalisés, consultez notre Bioinformatique services.
Options supplémentaires
- Analyse de séquençage d'amplicons
- Validation des candidats hors cible ciblés
- Contrôle qualité soutenu par le séquençage du génome entier
- Analyse CNV/SNV/SV
- Examen des grandes suppressions ou insertions ciblées lorsque cela est approprié.
- Analyse de la jonction d'insertion du donneur
- Résumé du classement des clones ou résumé de la sélection des clones
- Visualisation prête pour figure personnalisée
- Enregistrement des paramètres de pipeline
Pour une évaluation plus large des effets hors cible, consultez notre Découverte des effets hors cible de CRISPR et Validation des effets hors cible de CRISPR pages.
Un rapport solide devrait aider votre équipe à comparer les clones, et pas seulement à archiver les fichiers de séquençage. Les résultats utiles peuvent inclure des tableaux récapitulatifs au niveau des clones, des graphiques de sites cibles, des preuves de jonction de donneurs, des tableaux de candidats hors cible, des chiffres de contrôle qualité à l'échelle du génome et des notes d'interprétation finales.
Ceci est particulièrement utile lorsque la lignée de cellules iPSC modifiée soutiendra la modélisation des maladies, la découverte de médicaments ou des expériences en aval à long terme.
Scénarios d'application pour l'édition et le contrôle qualité des iPSC
Ces scénarios d'application montrent comment des clones de iPSC édités peuvent soutenir la recherche en aval lorsque la conception de l'édition, le dépistage des clones et le contrôle qualité soutenu par le séquençage sont planifiés ensemble.
Modèle de maladie et génération de contrôles isogéniques
Les lignées iPSC modifiées sont souvent utilisées pour modéliser des variantes associées à des maladies ou générer des témoins isogéniques. Dans ces projets, la validation du site cible, la comparaison des clones et un contrôle qualité génomique optionnel peuvent aider votre équipe à sélectionner des clones mieux soutenus avant la différenciation ou les essais fonctionnels.
Développement de modèles de découverte de médicaments
Les programmes de découverte de médicaments peuvent utiliser des modèles dérivés de iPSC modifiés pour étudier les mécanismes de la maladie, la réponse des voies ou les effets des composés. Un package de contrôle qualité clair aide à réduire l'incertitude avant que la lignée modifiée ne soit utilisée dans des travaux de criblage ou de développement d'essais plus importants.
Génomique fonctionnelle et recherche sur les mécanismes
Les modèles iPSC knockout, knock-in, reporter et de mutation ponctuelle peuvent soutenir la génomique fonctionnelle et les études de mécanisme. Un plan de validation soutenu par séquençage aide à garantir que le phénotype observé est lié à l'édition prévue autant que possible.
Soutien à la recherche en médecine régénérative
Pour la recherche en médecine régénérative, les lignées de cellules iPSC modifiées peuvent nécessiter un examen plus approfondi au niveau des clones et à l'échelle du génome avant une utilisation expérimentale en aval. Nous pouvons aider à planifier la profondeur du contrôle qualité en fonction des objectifs de recherche tout en maintenant l'interprétation dans le cadre d'un service de recherche.
Résultats de la démonstration : ce qu'un package de contrôle qualité iPSC édité peut inclure
Les résultats de la démonstration aident votre équipe à comprendre à quoi pourrait ressembler un package QC final. Ces exemples montrent des formats de sortie courants lorsqu'ils correspondent à la conception du projet.
Démonstration 1 : Confirmation de l'édition sur le site cible
Une sortie de confirmation du site cible peut montrer si l'édition prévue est présente. Selon la méthode, cela peut inclure des traces de séquence, des résumés de séquençage d'amplicons, des profils d'indels, des preuves de jonction de donneur ou des tableaux d'édition au niveau des allèles.
Cela aide votre équipe à aller au-delà de "édité ou non édité" et à examiner le résultat exact au niveau de la séquence.
Démonstration 2 : Sélection de clones et comparaison de génotypes
La comparaison des clones est utile lorsque plusieurs clones candidats sont disponibles. Un rapport peut comparer l'ID du clone, le génotype, le statut des allèles, le modèle d'édition, le statut d'expansion, le soutien à l'insertion du donneur et les indicateurs de contrôle qualité.
Cela facilite la décision concernant les clones qui doivent avancer vers des contrôles qualité plus approfondis ou des tests en aval.
Démonstration 3 : Résumé de l'assurance qualité à l'échelle du génome et de l'examen des cibles hors cible
Pour les projets iPSC édités de plus grande valeur, un contrôle qualité à l'échelle du génome ou un examen des cibles hors cible peut être ajouté. Un résumé peut inclure des sites candidats hors cible, des résultats de CNV/SNV/SV le cas échéant, des notes de contrôle qualité à l'échelle du génome et des résumés prêts pour les figures.
L'objectif n'est pas de surestimer ce que le contrôle qualité peut prouver. L'objectif est de fournir un ensemble de preuves de recherche plus solide pour l'examen des clones.
FAQ : planification d'un projet d'édition génique et de contrôle qualité sur des iPSC
1. Pouvez-vous travailler avec ma lignée iPSC existante ?
Oui. Nous pouvons examiner votre lignée iPSC existante, l'objectif d'édition, les informations cellulaires disponibles et les besoins en contrôle qualité avant la mise en place du projet. Les informations utiles incluent la source cellulaire, l'historique des passages, l'état de culture, le statut de mycoplasme si disponible, et le cas d'utilisation en aval.
2. Quels types d'édition cette solution peut-elle prendre en charge ?
Cette solution peut soutenir la planification pour des projets de knockout, knock-in, mutation ponctuelle, correction de mutation, insertion de rapporteur et contrôle isogénique. Le flux de travail exact dépend de la séquence cible, du modèle donneur, des conditions de la lignée cellulaire et des objectifs de validation.
Ai-je besoin d'un dépistage monoclonal ?
Si votre équipe a besoin d'un clone iPSC édité stable pour des études en aval, le criblage monoclonal est généralement important. Il permet de génotyper, de comparer et de sélectionner des clones individuels sur la base de preuves au niveau des clones.
4. La séquençage Sanger est-il suffisant pour la validation des iPSC modifiées ?
Le séquençage Sanger peut être utile pour le dépistage initial des sites cibles, mais il peut ne pas suffire pour chaque projet. Le séquençage d'amplicons, le séquençage ciblé, la validation hors cible ou le contrôle qualité soutenu par le séquençage du génome entier peuvent être utiles lorsque la résolution au niveau des allèles ou un contexte génomique plus large est nécessaire.
5. Quand le séquençage du génome entier (WGS) devrait-il être ajouté au contrôle qualité des iPSC modifiées ?
Le séquençage du génome entier (WGS) peut être envisagé lorsqu'un clone soutiendra des études en aval de grande valeur, la modélisation isogénique de maladies, la différenciation à long terme, ou des projets où le contexte génomique global est important. Ce n'est pas nécessaire pour chaque clone modifié.
6. Quelles informations sur l'échantillon ou le projet devrais-je fournir ?
Les informations utiles comprennent le gène cible, le type d'édition, la source de iPSC, le modèle de donneur, les informations sur l'ARN guide, la séquence cible, la liste des clones, les données de contrôle de qualité gDNA disponibles, les livrables souhaités et l'utilisation de recherche en aval.
7. Pouvez-vous comparer plusieurs clones modifiés ?
Oui. La comparaison des clones peut inclure le génotype, l'état des allèles, le modèle d'édition du site cible, le soutien des jonctions du donneur, les indicateurs de contrôle qualité, la qualité de séquençage et les notes de rapport. Cela aide votre équipe à décider quels clones doivent avancer.
8. Quels résultats de bioinformatique peuvent être inclus ?
Les résultats peuvent inclure des résumés de validation des sites cibles, des profils d'indels ou d'allèles, des tableaux de comparaison de clones, des tableaux de validation des candidats hors cible, des revues de CNV/SNV/SV le cas échéant, des notes de contrôle qualité à l'échelle du génome et des résumés de rapport final.
9. Cette solution peut-elle soutenir des projets de modélisation des maladies ou de contrôle isogénique ?
Oui. Les lignées de cellules iPSC modifiées sont souvent utilisées dans la modélisation des maladies et la recherche sur les contrôles isogéniques. Nous pouvons aider à planifier la stratégie d'édition et de contrôle qualité afin que les preuves au niveau des clones soutiennent l'examen de la recherche en aval.
10. Quels livrables peuvent être inclus ?
En fonction de l'étendue du projet, les livrables peuvent inclure des informations sur les clones édités, des données de séquençage, des résultats de validation des sites cibles, des tableaux de comparaison des clones, des résultats de bioinformatique, des résumés de contrôle qualité et des notes de rapport final.
Étude de cas : un contrôle qualité plus approfondi peut révéler des défauts cachés dans les iPSCs édités par CRISPR.
Cas de littérature en libre accès
Journal : Rapports sur les cellules souches
Publié : 2022
DOI : 10.1016/j.stemcr.2022.02.008
Contexte
Cette étude en libre accès a examiné une préoccupation majeure concernant la qualité dans les projets de cellules iPSC éditées par CRISPR. Les lignées de cellules iPSC humaines sont largement utilisées pour le modélisation des maladies et la génération de contrôles isogéniques, mais les clones édités peuvent présenter des modifications inattendues sur la cible qui sont difficiles à détecter uniquement avec des PCR courtes et le séquençage Sanger.
L'étude est pertinente pour cette solution car elle montre pourquoi le contrôle qualité des iPSC modifiées peut nécessiter plus qu'un simple contrôle du site cible, en particulier lorsque les clones soutiendront des expériences en aval importantes.
Méthodes
Les auteurs ont évalué 27 clones de cellules souches pluripotentes induites (iPSC) générés après l'édition CRISPR/Cas9 à travers 9 loci génomiques dans 4 gènes. Ces clones semblaient initialement correctement édités sur la base de PCR courte et de séquençage Sanger.
Pour approfondir, l'étude a utilisé des tests de contrôle de qualité, y compris la PCR de génotypage quantitatif du nombre de copies d'allèles et le séquençage de SNPs hétérozygotes voisins. L'objectif était d'identifier de grands événements ciblés et des motifs de perte d'hétérozygotie qui pourraient être manqués par une validation standard.
Résultats
L'étude a révélé que 33 % des clones iPSC modifiés avaient acquis de grands défauts génomiques ciblés, y compris des insertions et une perte d'hétérozygotie. Il est important de noter que tous ces défauts avaient échappé à l'analyse par PCR standard et séquençage Sanger. La publication rapporte que 8 des 27 clones ont montré un nombre de copies alléliques inférieur par qgPCR, et un clone supplémentaire a montré un modèle de perte d'hétérozygotie neutre en copie à travers l'analyse de SNP voisins.
Figure 2 présente l'évaluation du nombre de copies d'allèles dans des clones de iPSC modifiés. Il comprend le concept de l'essai qgPCR, les résultats du nombre de copies d'allèles à travers 27 clones, l'analyse des SNP à proximité, et un graphique en donut résumant les clones correctement modifiés par rapport aux clones avec une modification monoallélique indésirable.
La figure 2 de l'étude en libre accès montre comment l'évaluation du nombre de copies d'allèles peut révéler des clones de iPSC modifiés présentant des défauts on-target cachés qui ont échappé au dépistage standard.
Conclusion
Cette étude soutient une leçon pratique pour les projets d'iPSC édités : un clone qui semble correct selon le dépistage standard des sites cibles peut encore nécessiter un contrôle qualité plus approfondi en fonction de l'objectif de recherche.
Pour un projet de service, cela signifie que le plan de contrôle qualité (CQ) doit être défini tôt. La validation sur site cible, la comparaison de clones, l'examen des cibles hors cible et le CQ à l'échelle du génome doivent être sélectionnés en fonction de l'utilisation prévue du clone modifié.
Référence
