Service de séquençage d'ARNm

Qu'est-ce que le séquençage de l'ARNm ?

L'ARNm est transcrit à partir de gènes codant des protéines et sert de molécule d'ARN intermédiaire qui transfère l'information génétique de l'ADN aux protéines. Chez les eucaryotes, l'ADN est d'abord transcrit en pré-ARNm, qui subit une série d'étapes de traitement pour former de l'ARNm mature. L'ARNm mature est ensuite transporté vers le cytoplasme et traduit par des ribosomes en protéines. La maturation de l'ARNm implique trois événements principaux de traitement : l'épissage, la coiffe 5' et la polyadénylation 3'. En conséquence, les molécules d'ARNm mature possèdent une queue poly(A) à leur extrémité 3'.

Fig 1. Qu'est-ce que l'ARNm.

La séquençage d'ARNm est un séquençage à haut débit la technologie développée pour détecter l'expression et le traitement de l'ARNm. L'étude du séquençage de l'ARNm chez les eucaryotes se concentre sur la collecte d'ARNm transcrits à partir de cellules ou de tissus spécifiques dans certains états fonctionnels. Elle peut être utilisée pour étudier l'expression différentielle de l'ARNm, détecter des variations structurelles et dépister des marqueurs moléculaires associés à des maladies ou à des traits. Elle peut également révéler la complexité du transcriptome, déterminer les structures des gènes et des transcrits, le splicing variable, l'édition de l'ARN, les ARN non codants polyadénylés et les nouveaux transcrits. Actuellement, le séquençage de l'ARNm a été largement appliqué dans des domaines tels que la recherche fondamentale, l'élevage moléculaire, le diagnostic clinique et développement de médicaments.

Principe technique de l'ARNm-seq

Pour les ARN contenant des queues poly(A), tels que les ARNm et certains lncARN, l'enrichissement est réalisé à l'aide d'oligo dT, qui capture l'ARN polyadénylé, également connu sous le nom de PolyA-Seq. L'ARNm/lncARN enrichi est ensuite fragmenté, transcrit inversement, ligaturé avec des adaptateurs de séquençage communs, et amplifié par PCR pour générer des bibliothèques de séquençage. Les données de séquençage résultantes sont soumises à une analyse bioinformatique pour obtenir des informations sur l'expression génique, l'épissage alternatif, l'édition de l'ARN et d'autres caractéristiques présentes dans l'ARN.

Fig 2. Flux de travail général de l'ARNm-seq.

Avantages de notre service de séquençage d'ARNm

• Comparé aux microarrays d'expression génique, le mRNA-Seq présente plusieurs avantages dans analyse du transcriptome:
• Il a une plage dynamique plus large, augmentant à la fois la sensibilité et la précision dans la mesure des variations de l'expression génique.
• Il peut capturer des caractéristiques connues ainsi que des caractéristiques nouvelles.
• Il peut être largement appliqué à diverses espèces.
• En plus de calculer les niveaux d'expression génique, il peut détecter des variations de séquence et de structure dans les transcrits.
• L'augmentation de la profondeur de séquençage permet d'élargir la plage dynamique de détection, facilitant l'identification et la quantification à la fois des transcrits très abondants et des transcrits peu abondants sur une échelle de six ordres de grandeur.
• En plus de détecter les niveaux d'expression des transcrits connus, il peut également découvrir des transcrits nouveaux.
• Lorsqu'il est appliqué à des espèces sans génome de référence, il peut découvrir de nouveaux gènes grâce à un assemblage de novo.

Flux de travail du service de séquençage d'ARNm

Pour le séquençage d'ARNm, notre entreprise propose des services expérimentaux comprenant, mais sans s'y limiter, la construction de bibliothèques et le séquençage basé sur des tissus et des lignées cellulaires, ainsi que des services d'analyse et d'interprétation bioinformatique rationalisés et personnalisés.

Spécification de service

	Exigences d'échantillon ARN total ≥ 500 ng, quantité minimale : 200 ng, concentration ≥ 20 ng/µl Cellules ≥ 1×106 Tissu ≥ 50 mg, Quantité minimale : 10 mg OD A260/A280 ratio ≥ 1,8, A260/230 ratio ≥ 1,8, RIN ≥ 6 Tous les échantillons d'ARN total doivent être exempts d'ADN. L'ARN doit être conservé dans de l'eau sans nucléase ou dans RNA Stable. Remarque : Les montants d'échantillons sont indiqués à titre de référence uniquement. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.
Cliquez	Stratégies de séquençage Illumina NovaSeq, PE 150 Quantité de données de séquençage : 5 Go de données brutes
	Analyse de données Nous proposons plusieurs analyses bioinformatiques personnalisées : Contrôle de qualité Filtrage Alignement au génome de référence Quantification de l'ARNm Analyse différentielle des gènes Analyse de regroupement d'échantillons Analyse d'enrichissement fonctionnel des gènes exprimés de manière différentielle Analyse des interactions protéiques des gènes différemment exprimés Analyse structurelle des réseaux d'interaction Remarque : Les sorties de données recommandées et les contenus d'analyse affichés sont uniquement à titre de référence. Pour des informations détaillées, veuillez contactez-nous avec vos demandes personnalisées.

Pipeline d'analyse

Livrables

• Les données de séquençage originales
• Résultats expérimentaux
• Rapport d'analyse des données
• Détails sur le séquençage de l'ARNm pour votre rédaction (personnalisation)

Chez CD Genomics, nous proposons des services de séquençage d'ARNm à la pointe de la technologie, conçus pour répondre à divers besoins de recherche. Notre service comprend un contrôle de qualité rigoureux des échantillons, une préparation de bibliothèque experte, séquençage à haut débitet une analyse de données détaillée. Nous privilégions la livraison de résultats précis et complets qui s'alignent sur les objectifs spécifiques de votre recherche. Contactez-nous pour explorer comment nos solutions de séquençage d'ARNm peuvent soutenir et améliorer vos efforts scientifiques.

Résultats de la démo

Les résultats partiels sont montrés ci-dessous :

Distribution de la qualité de séquençage

Distribution A/T/G/C

Interface du navigateur IGV

Analyse de corrélation entre les échantillons

Graphique des scores PCA

Diagramme de Venn

Diagramme de volcan

Résultats statistiques de l'annotation GO

Classification KEGG

FAQ sur le séquençage de l'ARNm

1. Tous les eucaryotes peuvent-ils subir un séquençage d'ARNm ?

L'ARNm eucaryote contient une queue poly-A, et la méthode courante pour enrichir l'ARNm eucaryote consiste à capturer l'ARNm à partir de l'ARN total en utilisant des billes magnétiques attachées à des oligos poly-T, suivie de la construction de bibliothèques pour le séquençage. Par conséquent, théoriquement, tous les eucaryotes peuvent subir un séquençage d'ARNm.

2. Pourquoi le séquençage de l'ARNm nécessite-t-il une intégrité de l'ARN plus élevée que le séquençage de l'ensemble du transcriptome ?

Dans la construction de bibliothèques de séquençage d'ARNm, les molécules d'ARN avec une queue poly-A sont capturées à l'aide de billes magnétiques. Si l'intégrité de l'ARN est mauvaise et que l'ARNm est partiellement dégradé, entraînant une perte de la queue poly-A, l'ARNm capturé à partir d'échantillons avec une intégrité inférieure est réduit, ce qui entraîne une couverture génique plus faible. Par conséquent, un niveau d'intégrité de l'ARN plus élevé est requis.

3. La séquençage d'ARNm peut-il détecter des ARN non codants ?

La séquençage de l'ARNm capture principalement les molécules d'ARN avec une queue poly(A) ; par conséquent, théoriquement, toute molécule avec une queue poly(A) exprimée dans la cellule peut être détectée. Cela inclut les ARNm et les longs ARN non codants avec des queues poly(A).

4. Quelle est la différence entre le séquençage de l'ARN total et le séquençage de l'ARNm ?

RNA-Seq totalLa séquençage de l'ensemble du transcriptome, ou séquençage de l'ensemble du transcriptome, est une méthode exhaustive qui englobe le séquençage de toutes les espèces d'ARN après l'élimination de l'ARN ribosomique (ARNr), y compris les ARN codants et non codants. Cela inclut des ARN comme l'ARNr, l'ARNm précurseur (pré-ARNm), l'ARN messager (ARNm) et une variété d'ARN non codants (ARNnc) tels que l'ARN de transfert (ARNt), les microARN (miARN) et l'ARN long non codant (ARNlnc). En revanche, le mRNA-Seq cible spécifiquement les régions codantes en enrichissant l'ARN polyadénylé (poly(A)), ce qui en fait une approche plus rentable et rationalisée pour les études principalement axées sur l'analyse de l'ARNm.

5. Devriez-vous choisir le séquençage d'ARNm ou le séquençage de l'ARN total ?

Pour la recherche impliquant des organismes eucaryotes et avec un intérêt principal pour les régions codantes, le mRNA-Seq est le choix optimal. L'approche mRNA-Seq enrichit l'ARNm grâce à la sélection Poly(A), réduisant les coûts et la complexité du séquençage, particulièrement adaptée aux échantillons avec un matériel de départ limité. D'autre part, si une analyse complète englobant tous les ARN, y compris les molécules d'ARN codantes et non codantes, est nécessaire, séquençage RNA total est l'option préférée, malgré son coût plus élevé et une demande de données de séquençage plus importante. La sélection entre les méthodes doit être basée sur des objectifs expérimentaux spécifiques, des questions biologiques, des types d'échantillons et des contraintes budgétaires.

Études de cas sur le séquençage de l'ARNm

Mécanisme moléculaire sous-jacent à la différenciation de la tolérance au cadmium dans Lentinula edodes comme révélé par les analyses d'ARNm et d'ARNmil

Journal : Journal des Matériaux Dangereux
Facteur d'impact : 14,224
Publié : 15 octobre 2022

Contexte

Le cadmium (Cd) est un métal lourd toxique largement répandu, capable d'induire plusieurs maladies dans le corps humain, telles que le cancer du sein et le cancer du rein. Avec le développement rapide des activités industrielles et agricoles, la contamination par le cadmium est devenue un problème mondial sérieux. Il est donc essentiel de dépolluer les zones contaminées par le Cd. La dépollution fongique est une technique de restauration novatrice et importante, mais les mécanismes moléculaires sous-jacents aux réponses fongiques au stress des métaux lourds restent flous. Cette étude a été menée séquençage du transcriptome analyser l'expression différentielle de l'ARNm et des miARN entre des champignons tolérants au Cd (YS119) et sensibles au Cd (YS45). Les résultats fournissent une base théorique pour une exploration plus approfondie des mécanismes moléculaires de la tolérance au cadmium chez les champignons et aident à élucider les rôles potentiels des miARN dans les réponses fongiques au stress des métaux lourds.

Matériaux et Méthodes

Résultats

Analyse de séquençage de l'ARNm

Un total de 577 586 098 lectures brutes a été obtenu à partir de tous les échantillons, ce qui a donné 577 165 672 lectures propres après filtration. Les coefficients de corrélation de Pearson et l'analyse en composantes principales (ACP) ont indiqué une haute reproductibilité entre les réplicats biologiques des échantillons, permettant une analyse plus approfondie (Figure 1A, B).

Figure 1 Coefficient de corrélation de Pearson et analyse en composantes principales.

Sous stress Cd, YS45 a montré une réponse plus forte par rapport à YS119, avec 2036 gènes exprimés différemment (DEGs) dans YS45 (1034 régulés à la hausse, 1002 régulés à la baisse) contre 370 DEGs dans YS119 (239 régulés à la hausse, 131 régulés à la baisse). Les analyses GO et KEGG ont révélé que les deux variétés de champignons avaient 170 DEGs communément régulés à la hausse, enrichis dans 14 catégories GO et un chemin KEGG, et 107 DEGs communément régulés à la baisse, enrichis dans 12 catégories GO et un chemin KEGG, indiquant que les gènes impliqués dans la stabilité des protéines, la liaison des ions et l'activité redox jouent un rôle dans la réponse au stress Cd. Plus précisément, YS45 avait 863 gènes régulés à la hausse de manière unique, enrichis dans 20 catégories GO et 12 chemins KEGG, tandis que YS119 avait 64 gènes régulés à la hausse de manière unique, enrichis dans 11 catégories GO et un chemin KEGG.

De plus, YS45 avait 890 gènes spécifiquement régulés à la baisse enrichis dans 22 catégories GO et 8 voies KEGG, tandis que YS119 avait 23 gènes spécifiquement régulés à la baisse enrichis dans 7 catégories GO sans enrichissement des voies KEGG. Cela suggère que la suppression sévère par YS45 des gènes liés au remodelage de la paroi cellulaire, à la réparation de l'ADN, au métabolisme des sucres et à la protéolyse sous stress Cd pourrait réduire sa tolérance au Cd, les expressions différentielles des gènes impliqués dans la régulation de la transcription, le transport, le métabolisme des lipides, la liaison des métaux, le métabolisme du glutathion et l'homéostasie redox contribuant aux différences de tolérance entre les deux variétés.

Figure 2 Analyse des gènes exprimés différemment (DEGs).

2. Analyse intégrée de l'ARNm et des miARN

Les miARN régulent l'expression génique en dégradant ou en inhibant leurs ARNm cibles. Dans YS45, parmi les 1620 cibles de miARN différentiellement exprimées, 216 sont des gènes différentiellement exprimés (GDE), dont 111 montrent des tendances d'expression opposées à celles des miARN (Figure 3A, B). Les gènes potentiellement régulés négativement par ces miARN incluent ceux codant pour des facteurs de transcription (TF), des protéines de transport, des cytochromes P450, des protéines de réparation de l'ADN comme MutL, des protéases, des glutathion S-transférases et des enzymes actives sur les glucides (CAZymes). Dans YS119, parmi les 525 cibles de miARN différentiellement exprimées, seulement 14 sont des GDE, dont 3 montrent des tendances d'expression opposées (Figure 3C, D), codant pour une hydrolase de glycoside, une protéine de croissance de cellulose et une déshydrogénase de rétinol.

Ces résultats suggèrent que les miARN peuvent ne pas affecter de manière significative l'expression de la plupart des gènes cibles chez les champignons. La dégradation de l'ARNm peut ne pas être le principal mécanisme de régulation ; au contraire, l'inhibition de la traduction et la compétition avec les ARN endogènes pour la liaison aux miARN pourraient jouer des rôles clés.

Figure 3 Analyse intégrée de l'ARNm et des miARN.

Conclusion

Cette étude explore les mécanismes moléculaires notables sous-jacents aux différences de tolérance au cadmium (Cd) entre deux variétés de champignons, YS45 et YS119. Sous stress de Cd, YS45 a montré une plus grande agrégation de protéines par rapport à YS119, impactant les activités cellulaires normales et diminuant la tolérance au Cd du champignon. Des analyses comparatives de l'ARNm et de l'ARNmi ont révélé l'implication de gènes ou d'ARNmi associés au remodelage de la paroi cellulaire, au transport, à la chélation des métaux, à l'homéostasie redox, à la transduction du signal, à la régulation transcriptionnelle, au métabolisme des lipides et des glucides, à l'hydrolyse des protéines, à la réparation de l'ADN et à la régulation du cycle cellulaire dans la modulation de la tolérance au Cd. De plus, la surexpression du gène LeAmy a confirmé son rôle dans l'amélioration de la tolérance au Cd chez les champignons. Les résultats posent une base théorique pour une compréhension plus approfondie des mécanismes moléculaires derrière les différences de tolérance au Cd chez les champignons, aidant au développement de cultivars fongiques tolérants aux métaux lourds.

Référence :

1. Shen N, Xu C, Zhang J, et al. Mécanisme moléculaire sous-jacent à la différenciation de la tolérance au cadmium dans Lentinula edodes comme révélé par les analyses d'ARNm et d'ARNmil. Journal des matériaux dangereux, 2022, 440 : 129841.